高晨 劉輝 吳宇 姚錫宇

喉癌是頭頸部常見腫瘤之一，以鱗狀細(xì)胞癌最多見。目前其主要治療手段為手術(shù)切除配合放射治療、化學(xué)治療。早期發(fā)現(xiàn)、早期診療對(duì)于減輕喉癌的危害非常重要，可提高患者術(shù)后生存率，也有可能盡量保留喉的發(fā)音功能，減少術(shù)后并發(fā)癥的發(fā)生。因此，通過(guò)對(duì)喉癌的發(fā)生、發(fā)展以及轉(zhuǎn)移機(jī)制的深入研究，在其基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)特異且敏感的分子指標(biāo)，并將其應(yīng)用于高發(fā)地區(qū)或人群的普查中，實(shí)現(xiàn)喉癌的二級(jí)預(yù)防，這對(duì)提高喉癌的療效有著十分重要的意義[1]。

BNIP3基因全長(zhǎng)1 535bp，位于10q26.3上。BNIP3是Bcl-2家族中促凋亡蛋白亞類的成員之一。因BNIP3基因在不同腫瘤中表達(dá)情況存在差異（乳腺癌中BNIP3基因高表達(dá)，胰腺癌中BNIP3基因表達(dá)沉默），且有關(guān)研究又發(fā)現(xiàn)BNIP3基因的表達(dá)缺失或過(guò)表達(dá)均可促進(jìn)腫瘤發(fā)生和發(fā)展[2，3]，使得對(duì)BNIP3基因的研究成為相關(guān)凋亡基因研究的熱點(diǎn)。

本研究擬應(yīng)用組織芯片免疫組化S-P染色技術(shù)，應(yīng)用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，觀察喉癌中BNIP3基因的表達(dá)情況，探討B(tài)NIP3基因在喉癌中的表達(dá)情況及影響因素。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象病例選自2005年1月～2018年12月我院頭頸外科治療的270例喉癌患者，男198例，女72例，平均年齡50.5歲，均經(jīng)臨床和病理明確診斷，通過(guò)我院病案管理系統(tǒng)，收集整理患者臨床、病理資料，建立數(shù)據(jù)庫(kù)，所有患者術(shù)前檢查均未發(fā)現(xiàn)罹患有糖尿病、心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、肝炎、結(jié)核等病史，無(wú)術(shù)前放、化療等治療史，取其腫瘤組織細(xì)胞檢測(cè)，設(shè)為喉癌組；另取對(duì)應(yīng)陰性切端的粘膜組織為對(duì)照組。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 試劑 ①BNIP3兔抗人多克隆抗體（工作濃度1∶200）；②二抗為即用型免疫組化Elivision plus試劑盒（鼠 /兔）（KIT 9901）。

1.2.2 儀器 ①切片機(jī)（NP-Q2）；②恒溫烤箱（XTJK200）；③冰箱（BCD-233GM型）；④普通光學(xué)顯微鏡（Olympus CX21）；⑤37.0℃恒溫孵育箱（TMC）。

1.3 結(jié)果判斷BNIP3免疫組化染色以胞漿內(nèi)出現(xiàn)特異性染色深淺來(lái)進(jìn)行評(píng)分：0分為無(wú)色，1分為淡黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色；再將染色細(xì)胞所占百分比來(lái)打分：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＜10%為0分，10%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，76%～100%為4分，兩項(xiàng)乘積即為該例免疫組化得分，0 分，-；1～2 分，+；3～4 分，++；5～6 分，+++。 其中-為陰性，+～++為弱陽(yáng)性，+++為強(qiáng)陽(yáng)性，乘積大于6分者歸為強(qiáng)陽(yáng)性

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BNIP3基因在喉癌組及對(duì)照組中的表達(dá)情況免疫組化結(jié)果示，喉癌組（270例）BNIP3基因表達(dá)陽(yáng)性例數(shù)為126例，陽(yáng)性率為46.7%，對(duì)照組（270例）中陽(yáng)性例數(shù)220例，陽(yáng)性率為81.5%。與對(duì)照組比較，喉癌組BNIP3基因表達(dá)陽(yáng)性率明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=11.2，P＜0.05）。

2.2 BNIP3基因在不同浸潤(rùn)深度喉癌中的表達(dá)情況免疫組化結(jié)果示淺度浸潤(rùn)組（T1-2，98例）BNIP3基因表達(dá)陽(yáng)性例數(shù)為66例，陽(yáng)性率為67.3%，深度浸潤(rùn)組（T3-4，172例）陽(yáng)性例數(shù)60例，陽(yáng)性率為34.9%，對(duì)照組（270例）中陽(yáng)性例數(shù)220例，陽(yáng)性率為81.5%。①與淺度浸潤(rùn)組比較，深度浸潤(rùn)組BNIP3基因表達(dá)陽(yáng)性率明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；②與對(duì)照組比較，淺度浸潤(rùn)組和深度浸潤(rùn)組BNIP3基因表達(dá)陽(yáng)性率有不同程度降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3 BNIP3基因在不同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況的喉癌中的表達(dá)情況免疫組化結(jié)果示無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（78例）BNIP3基因表達(dá)陽(yáng)性例數(shù)為42例，陽(yáng)性率為53.9%，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（192例）陽(yáng)性例數(shù)為84例，陽(yáng)性率為43.8%，對(duì)照組（270例）中陽(yáng)性例數(shù)220例，陽(yáng)性率為81.5%。①與無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組比較，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組BNIP3基因表達(dá)陽(yáng)性率明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；②與對(duì)照組比較，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組BNIP3基因表達(dá)陽(yáng)性率有不同程度降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.4 BNIP3基因在不同TNM分期喉癌中的表達(dá)情況免疫組化結(jié)果示早期喉癌組（62例）BNIP3基因表達(dá)陽(yáng)性例數(shù)為39例，陽(yáng)性率為62.9%，中晚期喉癌組（208例）陽(yáng)性例數(shù)為87例，陽(yáng)性率為41.8%，對(duì)照組（270例）中陽(yáng)性例數(shù)220例，陽(yáng)性率為81.5%。①與早期喉癌組比較，中晚期喉癌組BNIP3基因表達(dá)陽(yáng)性率明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；②與對(duì)照組比較，早期喉癌組和中晚期喉癌組BNIP3基因表達(dá)陽(yáng)性率有不同程度的降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.5 BNIP3基因在不同分化程度喉癌中的表達(dá)情況免疫組化結(jié)果示高分化組（80例）BNIP3基因表達(dá)陽(yáng)性例數(shù)為50例，陽(yáng)性率為62.5%，中分化組（132例）陽(yáng)性例數(shù)為63例，陽(yáng)性率為47.7%，低分化組（58例）陽(yáng)性例數(shù)為13例，陽(yáng)性率為22.4%，對(duì)照組（270例）中陽(yáng)性例數(shù)220例，陽(yáng)性率為81.5%。①與高分化組比較，中分化組和低分化組BNIP3基因表達(dá)陽(yáng)性率均有不同程度降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；②與中分化組比較，低分化組BNIP3基因表達(dá)陽(yáng)性率顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；③與對(duì)照組比較，高分化組、中分化組及低分化組BNIP3基因表達(dá)陽(yáng)性率均有不同程度降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

此外，胞漿內(nèi)的特異性染色（BNIP3）在周邊區(qū)域的癌細(xì)胞中表現(xiàn)為深染，比腫瘤中心區(qū)域和正常粘膜區(qū)域的染色深（見圖1）。

圖1 喉癌周邊區(qū)域癌細(xì)胞染色情況

3 討論

喉癌細(xì)胞中BNIP3基因表達(dá)陽(yáng)性率低于粘膜組織中BNIP3基因表達(dá)陽(yáng)性率說(shuō)明其可能通過(guò)某些機(jī)制導(dǎo)致BNIP3基因表達(dá)沉默。本研究中深度浸潤(rùn)組BNIP3基因表達(dá)陽(yáng)性率明顯低于淺度浸潤(rùn)組及對(duì)照組。表明BNIP3基因的表達(dá)可能與浸潤(rùn)深度有一定聯(lián)系。

Yanmshita等[4]研究發(fā)現(xiàn)BNIP3基因的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況呈正相關(guān)。本研究中：與無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組比較，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組BNIP3基因表達(dá)陽(yáng)性率明顯降低，說(shuō)明喉癌中BNIP3基因的表達(dá)可能與其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否有一定關(guān)系。

TNM分期系統(tǒng)是目前國(guó)際上最為通用的腫瘤分期系統(tǒng)，是對(duì)惡性腫瘤進(jìn)行分期的標(biāo)準(zhǔn)方法。本研究中：與早期喉癌組比較，中晚期喉癌組BNIP3基因表達(dá)陽(yáng)性率明顯減低；與對(duì)照組比較，早期喉癌組和中晚期喉癌BNIP3基因表達(dá)陽(yáng)性率有不同程度降低。說(shuō)明喉癌中BNIP3基因的表達(dá)可能與其TNM分期相關(guān)。腫瘤細(xì)胞的分化程度是指腫瘤細(xì)胞接近于正常細(xì)胞的程度。腫瘤細(xì)胞的分化程度越差，其惡性程度就越高，且容易發(fā)生轉(zhuǎn)移。Abe等[5]研究發(fā)現(xiàn)：低分化胰腺癌BNIP3基因表達(dá)陽(yáng)性率顯著降低。本研究亦發(fā)現(xiàn)：低分化喉癌BNIP3基因表達(dá)陽(yáng)性率明顯降低。本研究中：與高分化組比較，中分化組和低分化組BNIP3基因表達(dá)陽(yáng)性率均有不同程度減低；與中分化組比較，低分化組BNIP3基因表達(dá)陽(yáng)性率顯著降低，這表明分化程度越低，喉癌中BNIP3基因表達(dá)降低越明顯。

缺氧是實(shí)體腫瘤發(fā)展過(guò)程中持續(xù)存在的情況。當(dāng)缺氧達(dá)一定程度后，即可引起腫瘤細(xì)胞蛋白質(zhì)組的改變和/或細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程，導(dǎo)致細(xì)胞受損性生長(zhǎng)或死亡（細(xì)胞周期阻滯、細(xì)胞分化抑制、細(xì)胞凋亡等）。HIF-1是缺氧作用機(jī)制中的核心轉(zhuǎn)錄因子。BNIP3基因?qū)儆贖IF-1應(yīng)答基因之一[6]。本研究亦發(fā)現(xiàn)：胞漿內(nèi)的特異性染色（BNIP3）在周邊區(qū)域的癌細(xì)胞中表現(xiàn)為深染（該區(qū)域易發(fā)生缺氧），比腫瘤區(qū)域和正常粘膜區(qū)域的染色深。由于喉癌周邊區(qū)域極易發(fā)生缺氧[7]，考慮缺氧可導(dǎo)致喉癌細(xì)胞中BNIP3基因的高表達(dá)。

由本研究可知：①喉癌細(xì)胞中BNIP3基因的表達(dá)異常降低；②喉癌細(xì)胞中BNIP3基因表達(dá)隨著腫瘤浸潤(rùn)深度的進(jìn)展而降低得更明顯；③伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，喉癌細(xì)胞中BNIP3基因表達(dá)陽(yáng)性率降低較無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者明顯；④喉癌細(xì)胞中BNIP3基因表達(dá)在中晚期降低更明顯；⑤分化程度越差，喉癌細(xì)胞中BNIP3基因表達(dá)降低越明顯?？傊?，喉癌細(xì)胞中BNIP3基因表達(dá)與浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、TNM分期、腫瘤細(xì)胞分化程度有一定關(guān)系。

綜上所述，檢測(cè)BNIP3基因有望成為喉癌診治的新靶點(diǎn)及其預(yù)后判斷的分子標(biāo)記物。為進(jìn)一步明確BNIP3基因在喉癌發(fā)病中的作用機(jī)制，本研究后期或?qū)⒖紤]從細(xì)胞層面對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證。

本研究存在一定局限性，本研究為橫斷面研究，缺乏喉癌患者自身不同階段的動(dòng)態(tài)資料，有待增加后期隨訪工作，行進(jìn)一步研究；本研究只分析探討了幾個(gè)腫瘤病理特征與檢測(cè)指標(biāo)的相關(guān)性，未對(duì)其他臨床及患者個(gè)人相關(guān)因素進(jìn)行分析；且各組之間樣本量差別較大，可能會(huì)使結(jié)果產(chǎn)生一定的偏倚，有待進(jìn)一步增加樣本量減小誤差。