唐婷婷 趙曼曼

[摘要] 目的 探討CIN及宮頸癌患者外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的表達(dá)及意義。 方法 選取2014年1月～2018年12月我院收治的CIN（宮頸上皮內(nèi)瘤變）患者20例，宮頸癌患者40例，其中Ⅰ～Ⅱ期20例、Ⅲ～Ⅳ期20例，同時選擇健康志愿者20例作為對照組。采用流式細(xì)胞儀檢測調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，酶聯(lián)免疫吸附法測定相關(guān)細(xì)胞因子。 結(jié)果 CIN及宮頸癌患者外周血中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的水平顯著高于對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。 結(jié)論 CIN及宮頸癌患者調(diào)節(jié)性T細(xì)胞/Th17細(xì)胞間的平衡被打破，可能導(dǎo)致了CIN的進(jìn)展及宮頸癌的發(fā)生發(fā)展。

[關(guān)鍵詞] CIN;宮頸癌;調(diào)節(jié)性T細(xì)胞;IL-17;IL-10

[中圖分類號] R711.7 ? ? ? ? ?[文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A ? ? ? ? ?[文章編號] 1673-9701（2019）31-0015-03

Expression and significance of regulatory T cells in peripheral blood of patients with CIN and cervical cancer

TANG Tingting ? ZHAO Manman

Department of Obstetrics and Gynecology， Shenyang Fourth People's Hospital， Shenyang ? 110031，China

[Abstract] Objective To study the expression and significance of regulatory T cells in the peripheral blood of patients with CIN and cervical cancer. Methods Twenty patients with CIN （cervical intraepithelial neoplasia） and 40 patients with cervical cancer （including 20 patients with stage Ⅰ-Ⅱ cancer and 20 patients with stage Ⅲ-Ⅳ cancer） treated in our hospital from January 2014 to December 2018 were enrolled， and 20 healthy volunteers were selected as the control group. Regulatory T cells were detected by flow cytometry， and relevant cytokines were determined by enzyme-linked immunosorbent assay. Results The levels and function of regulatory T cells in peripheral blood of patients with CIN and cervical cancer were significantly higher than those of the control group， with statistically significant differences（P<0.01）. Conclusion The balance between regulatory T cells/Th17 cells in the patients with CIN and cervical cancer is destroyed， which may lead to the progress of CIN and the occurrence and development of cervical cancer.

[Key words] CIN; Cervical cancer; Regulatory T cells; IL-17; IL-10

宮頸癌作為婦科發(fā)病率較高的惡性腫瘤，正呈逐年上升的趨勢，嚴(yán)重威脅著婦女們的生命健康。而宮頸上皮內(nèi)瘤變（CIN）是宮頸癌前病變的主要疾病狀態(tài)，對宮頸癌的發(fā)生發(fā)展具有重要的促進(jìn)作用。Th17/Treg是CD4+T細(xì)胞的兩種亞群，正常情況下，Th17/Treg細(xì)胞之間保持平衡，然而大量研究表明多種惡性腫瘤患者腫瘤組織和外周血中均出現(xiàn)輔助性T細(xì)胞17（Th17）/調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cells，Treg）失衡，因此，認(rèn)為Th17/Treg 細(xì)胞失衡與腫瘤進(jìn)展關(guān)系密切[1-2]。

有研究者發(fā)現(xiàn)，CD4+CD25+Treg細(xì)胞在低級別CIN患者中輕度增高，在高級別CIN患者中，尤其是宮頸癌患者中顯著增高[3]。同時發(fā)現(xiàn)CIN及宮頸癌患者中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量增高者預(yù)后較差，無病生存期明顯縮短，提示調(diào)節(jié)性T細(xì)胞可能是CINIII及宮頸癌的獨(dú)立預(yù)后因素[4]。CD4+CD25+Treg細(xì)胞能分泌白細(xì)胞介素10（IL-10），IL-10是一種能調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和分化并參與炎癥和免疫反應(yīng)的多功能細(xì)胞因子[5]。輔助性Th17型細(xì)胞以分泌IL-17為特征，可通過誘導(dǎo)產(chǎn)生多種前炎性細(xì)胞因子，參與構(gòu)成腫瘤微環(huán)境[6]。有研究證實(shí)宮頸癌患者中外周血血清IL-10、IL-17的水平顯著升高[4-5]。因此，本研究主要探討人外周血CD4+CD25+Treg細(xì)胞數(shù)和血清IL-10，IL-17水平的變化與CIN及宮頸癌患者之間的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇CIN（宮頸上皮內(nèi)瘤變）患者20例，宮頸癌患者40例，其中Ⅰ～Ⅱ期20例（Ⅰ期9例，Ⅱ期11例）、Ⅲ～Ⅳ期20例（Ⅲ期13例，Ⅳ期7例），均選自沈陽市第四人民醫(yī)院2014年1月～2018年12月就診的患者，且經(jīng)手術(shù)及病理學(xué)檢查確診的患者。CIN組中，年齡35～60歲，平均（42.5±9.5）歲，宮頸癌組中，年齡32～64歲，平均（46.4±9.0）歲，均未進(jìn)行過放、化療及激素或免疫等抗腫瘤治療。對照組根據(jù)年齡匹配選取20名健康志愿者，年齡36～55歲，平均（44.2±8.5）歲。各組年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。本研究獲醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有被檢者均簽署知情同意書。

1.2 外周血CD4+CD25+Treg細(xì)胞檢測

采集各組研究對象外周血2.5 mL，置于EDTA抗凝管中，加入淋巴細(xì)胞分離液，離心，分離獲得PBMC，計(jì)數(shù)。取1×106 PBMC，加入anti-CD4-FITC及anti-CD25-APC進(jìn)行細(xì)胞表面染色，4℃，2 h。破膜固定后，加入anti-Foxp3-PE進(jìn)行胞內(nèi)染色，清洗，重懸細(xì)胞，上機(jī)檢測。anti-CD4-FITC、anti-CD25-APC及anti-Foxp3-PE均購自美國BD bioscience公司。

1.3 酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測IL-17、IL-10的分泌水平

抽取各組研究對象外周血，室溫靜置2 h，1500 rpm，離心30 min，分離上清，-70℃保存，待測。取100 μL稀釋的血清樣品或梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品，加入預(yù)先包被好的96孔板中。室溫孵育2 h，PBS洗板3次。加入檢測抗體100 μL，室溫孵育2 h，PBS洗板3次。加入Streptavidin-HRP 100 μL，避光孵育20 min，洗板3次。加底物避光室溫孵育30 min，加終止液50 μL。利用酶標(biāo)儀，在450 nm處讀板計(jì)算蛋白濃度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用單因素方差分析比較各組間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，當(dāng)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時，采用SNK法進(jìn)行組間比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組外周血中CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞及特異性轉(zhuǎn)錄因子Foxp3表達(dá)水平比較

采用流式細(xì)胞術(shù)檢測各組外周血CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的表達(dá)水平，結(jié)果表明，CIN組及宮頸癌患者外周血中CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞較對照組顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。見表1。

2.2 各組外周血中IL-17及IL-10分泌水平比較

用酶聯(lián)免疫吸附法檢測對照組、CIN患者及宮頸癌患者外周血血清中細(xì)胞因子的分泌水平。結(jié)果顯示，CIN及宮頸癌患者血清中IL-10、IL-17的分泌水平較對照組明顯升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。見表2。

3 討論

進(jìn)入21世紀(jì)，女性癌癥的發(fā)病率很高，宮頸癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率居?jì)D科惡性腫瘤的第三位[7]。CIN是宮頸癌前病變，其持續(xù)發(fā)展即為宮頸癌。近年來有研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤的發(fā)生發(fā)展與機(jī)體的免疫狀態(tài)密切相關(guān)，大量研究表明惡性腫瘤患者的免疫系統(tǒng)處于免疫耐受或免疫缺陷狀態(tài)，可以逃逸機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)[8]。有研究指出，當(dāng) Treg/Th17的平衡發(fā)生偏離時則會引起CIN的進(jìn)展甚至導(dǎo)致宮頸癌的發(fā)生與惡化[9]。

調(diào)節(jié)性T細(xì)胞是一類具有免疫抑制功能的T細(xì)胞亞群，以表達(dá)CD4、CD25為特征性表型，不僅能對抗外源性抗原，還可以抑制對抗自身抗原的免疫應(yīng)答，從而輔助腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)的識別及清除[10]。研究表明調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在婦科腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要的作用。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞介導(dǎo)宮頸癌的免疫逃逸[11-12]。研究顯示，在子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌、乳腺癌等多種腫瘤患者外周血中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的比例均顯著升高[13-15]。

腫瘤免疫微環(huán)境是近年來的研究熱點(diǎn)，免疫系統(tǒng)一方面可以通過免疫監(jiān)控，抑制腫瘤發(fā)生;另一方面腫瘤組織發(fā)揮負(fù)向調(diào)控免疫系統(tǒng)，誘導(dǎo)免疫耐受，促進(jìn)腫瘤惡性進(jìn)展。因此，闡明宮頸癌微環(huán)境的免疫調(diào)控機(jī)制可為宮頸癌的預(yù)防及治療提供理論基礎(chǔ)。由于免疫調(diào)控是一個極為復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，宮頸癌發(fā)病機(jī)制及其具體深入的免疫調(diào)控作用仍需進(jìn)一步研究證實(shí)。

本研究中，CIN及宮頸癌患者外周血中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的數(shù)量及功能均有明顯升高，表明調(diào)節(jié)性T細(xì)胞參與了調(diào)控CIN及宮頸癌發(fā)生發(fā)展。IL-10是調(diào)節(jié)性T細(xì)胞發(fā)揮免疫抑制功能的主要細(xì)胞因子，參與調(diào)控多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展。在CIN及宮頸癌患者外周血中，IL-10的分泌水平顯著增加，表明調(diào)節(jié)性T細(xì)胞可能同樣通過分泌IL-10來發(fā)揮其對CIN及宮頸癌病理進(jìn)程的調(diào)控作用。另一方面，以分泌IL-17為主要特征的Th17型免疫細(xì)胞被證實(shí)參與CIN及宮頸癌的發(fā)生發(fā)展。本研究中，CIN及宮頸癌患者外周血中IL-17的分泌水平顯著升高，提示Th17型炎癥反應(yīng)在CIN及宮頸癌中被大量誘導(dǎo)。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和Th17細(xì)胞均顯著增加，意味著調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和Th17細(xì)胞間相互平衡被打破，形成了有利于腫瘤發(fā)展的免疫炎性微環(huán)境。

綜上所述，隨著CIN逐漸發(fā)展為宮頸癌，輔助性T細(xì)胞17（Th17）/調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cells，Treg）細(xì)胞失衡，從而導(dǎo)致CIN及宮頸癌的發(fā)生發(fā)展，可能參與了腫瘤免疫內(nèi)環(huán)境的調(diào)節(jié)。

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（收稿日期：2019-05-20）