范書華，董清山*，趙團結(jié)，解國慶，王 艷，趙云彤，時新瑞

（1.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院牡丹江分院，黑龍江 牡丹江 157000；2.南京農(nóng)業(yè)大學，江蘇 南京 210095）

馬鈴薯（Solanum tuberosum L.）淀粉包含支鏈淀粉和直鏈淀粉，馬鈴薯支鏈淀粉具有抗老化性、改善凍融平衡、高膨脹性、高吸水性及增稠作用等功能，被廣泛應用于食品、包裝材料的制作、醫(yī)藥和建筑工業(yè)等領(lǐng)域[1]。工業(yè)生產(chǎn)上分離直鏈淀粉和支鏈淀粉工藝復雜、費時、費力[2]，因此，培育出支鏈淀粉含量更高的馬鈴薯品種具有重要的經(jīng)濟和社會意義[3]。

通過對豌豆突變體[4]、馬鈴薯[5]及禾谷類突變體[6]的研究表明，植物體內(nèi)如果缺少GBSS 蛋白，直鏈淀粉就不能合成。劉玉匯等[7]利用RNAi 技術(shù)降低GBSS 基因轉(zhuǎn)錄水平獲得了支鏈淀粉含量比對照高10.31%～20.92%的馬鈴薯，并發(fā)現(xiàn)支鏈淀粉含量與基因沉默效率呈極顯著正相關(guān)關(guān)系。劉永強[8]通過轉(zhuǎn)基因的方法干擾GBSS 基因表達從而獲得了支鏈淀粉比例高達99.2%的馬鈴薯材料。Andersson等[9]通過基因編輯的方法獲得了馬鈴薯GBSS突變體材料‘P24023’，GBSS基因功能喪失后，馬鈴薯支鏈淀粉含量明顯升高。馬鈴薯栽培品種‘克新12號’是黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院馬鈴薯研究所利用自交種子選育而成的高淀粉品種[10]，具有高產(chǎn)、抗病、淀粉含量高的優(yōu)點，已經(jīng)在全國多地推廣[11]。‘克新12號’屬加工型品種，總淀粉含量為16.5%，直鏈淀粉占24.7%，支鏈淀粉占總淀粉比例為75.3%左右[12]。為了培育更適合加工生產(chǎn)支鏈淀粉的馬鈴薯種質(zhì)，本課題組通過有性雜交的方法把高支鏈淀粉基因gbss由‘P24023’導入到‘克新12號’。

高分辨率熔解曲線（High resolution melting，HRM）是近些年發(fā)展起來的新技術(shù)，該技術(shù)可以分辨單個堿基的基因突變，具有靈敏度高，成本低，操作簡便的特點，已在水稻、玉米等作物上廣泛應用[13]。本研究針對gbss 基因的功能性變異位點，將其開發(fā)為HRM分子標記，為進一步將gbss基因?qū)氲礁嗟倪m合本地栽培的馬鈴薯品種中，創(chuàng)制更多高支鏈淀粉馬鈴薯品種提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究中所用馬鈴薯突變體材料‘P24023’由瑞士農(nóng)業(yè)科學大學Hofvander教授饋贈，支鏈淀粉含量占總淀粉含量比例為99.5%；其余11份馬鈴薯材料由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院牡丹江分院收集保存（表1）。這12份馬鈴薯材料用于GBSS基因突變位點多態(tài)性檢測。

為了培育適合本地種植的高支鏈淀粉馬鈴薯品種，以‘P24023’突變體為供體，利用gbss 基因改良‘克新12號’。以‘克新12號’為母本和‘P24023’為父本，通過去雄雜交，得到雜交F1代實生種子，F(xiàn)1代自交結(jié)實得到F2代實生種子。由于12份馬鈴薯材料中有11份材料GBSS基因的突變區(qū)域沒有多態(tài)性，為控制試驗規(guī)模，挑選6個當?shù)剞r(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的主栽品種，‘克新12號’、‘尤金’、‘早大白’、‘東農(nóng)303’、‘大西洋’、‘夏波蒂’和高支鏈淀粉突變體材料‘P24023’以及‘克新12號’和‘P24023’的F2代群體用于分子標記功能分析。每個單株取健康葉片用于提取基因組DNA。

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1.2 引物設(shè)計及信息

根據(jù)‘P24023’突變體中的GBSS 基因序列設(shè)計HRM引物gbss-F/gbss-R（gbss-F：5'-tctctataca ggtcatggacgc-3'，gbss-R：5'-cctcaagtctgccgatgaa gcc-3'），引物由深圳華大基因公司合成。

1.3 PCR擴增以及HRM檢測

依據(jù)劉玉匯等[7]的方法提取馬鈴薯葉片基因組DNA。PCR 反應體系如下：10 ng 基因組DNA，Buffer（Mg2+plus），250 μmol/L dNTPs，0.1 μmol/L gbss-F/gbss-R 引 物， 0.5 U rTaq DNA 聚 合 酶（TaKaRa，Japan）和0.1 μL 20×EvaGreen 熒光染料（Biotium USA），加ddH2O 補足至10 μL。PCR 擴增程序如下：94 ℃4 min；94 ℃30 s，57 ℃30 s，72 ℃10 s，39 個循環(huán)；72 ℃1 min；95 ℃1 min；25 ℃1 min。PCR結(jié)束后，每個反應體系中加入1 μL溫度內(nèi)參，2 500 r/min 離心1 min 后即可進行高分辨率熔解曲線采集及分型，后續(xù)具體操作參考金名捺等[13]的方法。

表1 12份用于GBSS多態(tài)性分析的馬鈴薯品種Table 1 Twelve potato varieties used for polymorphism analysis of GBSS

PCR產(chǎn)物同時送到華大基因進行DNA測序，確定不同馬鈴薯材料的基因類型；序列比對使用Lasergene軟件。

1.4 淀粉含量測定

采用水沉淀法[14]制備馬鈴薯塊莖淀粉，采用雙波長法分別測定支鏈淀粉和直鏈淀粉含量，兩者和為總淀粉含量，計算支鏈淀粉占淀粉的百分率。測定直鏈淀粉含量采用的波長分別為λ1=500 nm，λ2= 600 nm；測定支鏈淀粉采用的波長分別為λ3=700 nm，λ4=590 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 GBSS功能基因特異性分子標記開發(fā)

為了給高支鏈淀粉馬鈴薯育種提供快速檢測的分子標記，本研究在‘P24023’突變體的GBSS基因突變位點兩側(cè)設(shè)計了gbss-F/gbss-R 引物，分別以12份馬鈴薯葉片基因組DNA為模板進行PCR擴增。結(jié)果顯示PCR擴增特異性好，片段大小也與預測的一致（圖1）。

通過對12份馬鈴薯材料（表1）的基因組進行擴增、測序，對測序結(jié)果進行比對分析發(fā)現(xiàn)，除‘P24023’外，其他11份材料在GBSS基因突變區(qū)域均沒有多態(tài)性（圖2）。

2.2 gbss基因功能分子標記的驗證

由于12份馬鈴薯材料中有11份材料GBSS基因的突變區(qū)域沒有多態(tài)性，選擇了6份栽培品種‘克新12號’、‘尤金’、‘早大白’、‘東農(nóng)303’、‘大西洋’、‘夏波蒂’和帶有g(shù)bss 突變的‘P24023’以及‘P24023’ב克新12號’的雜交F2代群體用于標記的功能驗證。種植F2代實生種子共得到單株208 株，利用gbss-F/gbss-R引物對上述馬鈴薯育種材料進行HRM 分型檢測，結(jié)果被檢測群體被分為3 種類型（圖3）。一種是與‘P24023’分為一類的峰圖（長實線）共6 株，除‘P24023’外，有5 株F2代單株，簡稱‘P群’；一種是與普通栽培品種分為的峰圖（空心曲線）共10株，除6個栽培品種外，有4株F2代單株，簡稱‘K群’；而F2代群體中絕大多數(shù)被分為第三類（實心連續(xù)曲線），共199株，簡稱‘F2雜群’。每份材料做3次重復，每次結(jié)果都一致，證明該標記具有很好的穩(wěn)定性。

圖1 引物gbss-F和gbss-R對馬鈴薯基因組DNA的擴增效果檢測Figure 1 Detection of amplification effects of primers gbss-F and gbss-R for potato genomic DNA

2.3 淀粉含量測定

根據(jù)HRM 分型結(jié)果，每種群體（P 群、F2雜群和K群）植株分別挑選4個單株，對應植株所結(jié)塊莖用于淀粉含量測定。結(jié)果顯示P群植株塊莖支鏈淀粉占總淀粉比例為99.1%，與‘P24023’相當；K群植株的塊莖支鏈淀粉占總淀粉比例為75.5%，與‘克新12號’支鏈淀粉比例相同；而F2雜群植株的塊莖支鏈淀粉占總淀粉比例為80.5%（圖4）。說明通過雜交轉(zhuǎn)育gbss基因可以使塊莖中的支鏈淀粉含量占總淀粉的比例顯著上升。

以上結(jié)果表明，HRM能夠?qū)︸R鈴薯支鏈淀粉基因的改良過程進行很好的跟蹤。因此，gbss-F/gbss-R可以作為鑒定和檢測高支鏈淀粉基因gbss的特異性功能分子標記，為馬鈴薯種質(zhì)資源的創(chuàng)制和分子標記輔助改良提供技術(shù)支持。

圖2 12份馬鈴薯材料GBSS基因位點擴增產(chǎn)物的測序結(jié)果比對分析Figure 2 Sequence analysis of amplified products of GBSS locus from 12 potato materials

圖3 引物gbss-F和gbss-R對馬鈴薯群體的HRM分型效果Figure 3 HRM genotyping results of potato populations by gbss-F/gbss-R primer sets

圖4 馬鈴薯支鏈淀粉含量測定Figure 4 Amylopectin content of different potato tubers

3 討 論

馬鈴薯是黑龍江省重要作物[15]，除作為食物外，大部分用于工業(yè)生產(chǎn)淀粉原料使用。馬鈴薯淀粉包括直鏈淀粉和支鏈淀粉，由于性質(zhì)不同，工業(yè)上需要把兩種淀粉分別純化。如果農(nóng)業(yè)生產(chǎn)出的馬鈴薯只含有一種淀粉，就省去淀粉分離成本。關(guān)于直鏈淀粉的合成關(guān)鍵基因已有深入的研究，通過反義或干涉表達GBSS基因可以得到高支鏈淀粉含量馬鈴薯[4-6]。

隨著分子生物學的發(fā)展，分子輔助育種得到越來越多的應用，分子標記可以準確跟蹤一些重要的作物性狀，而不受環(huán)境影響。目前馬鈴薯的分子標記主要是采用DNA電泳的方法進行[16]，該方法存在費時、費力、高成本、低效率等缺陷；改進后的小片段HRM方法是一種準確、高效、低成本的突變位點檢測方法，高度靈敏性以及優(yōu)良的準確性使得HRM方法在作物分子標記育種上具有巨大的應用潛力。栽培馬鈴薯是四倍體作物，四倍體基因組雜合度較高，其基因型研究相對二倍體復雜，其F2代分離單株應該有多種基因型。本研究所開發(fā)的標記將雜交群體后代分為3種類型（圖3），是因為‘F2雜類’的199 株單株應該包括了除親本類型的多種基因型，所以單株間高分辨率熔解曲線有些差別（圖3），具體有哪些基因型還需進一步實驗驗證。

本研究基于GBSS基因突變位點設(shè)計的HRM標記分型檢測方法能夠高效、準確地進行高支鏈淀粉馬鈴薯資源的鑒定及改良后代群體的高通量篩選檢測。本研究創(chuàng)制的高支鏈淀粉馬鈴薯新種質(zhì)，總淀粉含量跟‘克新12號’相當，但支鏈淀粉含量大幅度升高，為將來生產(chǎn)上提供更適合加工的馬鈴薯品種提供了優(yōu)質(zhì)資源。