許曉敬 郭傳濱 禹寶成 唐培培 楊立均 孫會(huì)忠

摘 要：以從煙草根際土壤中分離到的具β-甘露聚糖酶活性菌株ZMD13為出發(fā)菌株，對(duì)其開(kāi)展了紫外線(xiàn)誘變選育研究。結(jié)果表明，出發(fā)菌株ZMD13在功率15W，紫外燈距離30cm，照射時(shí)間1.5min的誘變條件下的致死率達(dá)到75%，確定為適宜劑量;試驗(yàn)獲得的產(chǎn)β-甘露聚糖酶正突變菌株（編號(hào)為ZMD13-2）的最高酶活性達(dá)到了32.0U/mL，是出發(fā)菌株ZMD13最高酶活性（6.0U/mL）的5.3倍。突變菌株ZMD13-2可作為煙草土壤保育制劑開(kāi)發(fā)的備用菌株。

關(guān)鍵詞：煙草;β-甘露聚糖酶;誘變選育

中圖分類(lèi)號(hào) S-3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào) 1007-7731（2019）22-00012-03

Ultraviolet Mutagenesis and Breeding of the Strain ZMD13 Producing β-mannanase

Xu Xiaojing1 et al.

（1Zhumadian branch of Henan provincial tobacco company，Zhumadian Henan 463000，China）

Abstract：The strain ZMD13 with beta manganase activity isolated from tobacco rhizosphere soil was used as the starting strain to carry out UV mutagenesis and breeding. The results showed that the mutagenesis rate of ZMD13 strain was 75% under the condition of 15 W power， 30 cm distance of uv lamp and 1.5 min exposure time， and the appropriate dose was determined. The positive mutant strain producing β-mannanase （numbered ZMD13-2） had the highest enzyme activity of 32.0 U/mL， 5.3 times that of the original strain ZMD13 with the highest enzyme activity of 6.0 U/mL. The mutant ZMD13-2 could be used as a reserve strain for tobacco soil conservation preparation.

Key words：Tobacco;β-mannanase;Mutation breeding

甘露聚糖是由β-1，4-D-吡喃甘露糖連接而成的線(xiàn)狀多聚體，是半纖維素的第二大組分，廣泛存在于生物有機(jī)體中，尤其是植物細(xì)胞壁的核心結(jié)構(gòu)成分[1，2]。β-甘露聚糖酶是水解以β-1，4-D-吡喃甘露糖為主鏈的甘露寡糖、甘露多糖的內(nèi)切水解酶，其在動(dòng)物、植物和微生物中均有所發(fā)現(xiàn)，自然界中分布較為廣泛，但得到實(shí)際應(yīng)用的β- 甘露聚糖酶主要來(lái)自微生物[3，4]。因?yàn)棣?甘露聚糖酶在高分子化合物纖維素的降解過(guò)程中起重要作用，所以β-甘露聚糖酶有利于加速土壤中的作物秸稈降解，調(diào)控耕作層土壤的碳素循環(huán)，是土壤保育劑和益生菌制劑開(kāi)發(fā)重要的靶標(biāo)物質(zhì)之一[5]。本研究在前期研究中獲得1株具有β-甘露聚糖酶活性菌株，編號(hào)為ZMD13，為了進(jìn)一步提高其開(kāi)發(fā)應(yīng)用價(jià)值，筆者以改土著菌株作為出發(fā)菌株，進(jìn)行了紫外線(xiàn)誘變選育，以期獲得產(chǎn)酶能力強(qiáng)的菌株。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 出發(fā)菌株ZMD13：分離于煙草根際土壤，保存于駐馬店市煙草公司生產(chǎn)技術(shù)中心實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)室。魔芋粉鑒別培養(yǎng)基：魔芋精粉5g，硫酸鎂5g，硝酸鈉3g，磷酸鉀1g，硫酸鐵0.01g，瓊脂粉20g，蒸餾水1000mL，自然pH[2]?；罨捅２嘏囵B(yǎng)基：LB斜面培養(yǎng)基[6]。

1.2 出發(fā)菌株的紫外線(xiàn)誘變選育 首先利用LB培養(yǎng)基將出發(fā)菌株ZMD13進(jìn)行活化培養(yǎng)，收集菌體，并用滅菌生理鹽水水洗3次，在顯微鏡下借助于血球計(jì)數(shù)板統(tǒng)計(jì)菌體數(shù)，將菌體濃度調(diào)制成108個(gè)/mL，然后分別吸取3mL菌懸液，滴加到直徑為90mm滅菌培養(yǎng)皿中，之后再用照功率為15W的紫外燈進(jìn)行照射，紫外燈與培養(yǎng)皿中菌液之間的距離定為30cm，照射時(shí)間設(shè)定0.5、1、1.5、2和2.5min4個(gè)梯度。將紫外線(xiàn)照射處理過(guò)的菌懸液用生理鹽水進(jìn)行10倍梯度稀釋?zhuān)x取10-4、10-5、10-6 3個(gè)梯度分別涂布于魔芋粉鑒別培養(yǎng)基，30℃條件下避光恒溫培養(yǎng)48h。設(shè)未照射紫外線(xiàn)的對(duì)照處理。

紫外線(xiàn)誘變的致死率計(jì)算公式如下[6]：

致死率（%）[對(duì)照毫升菌數(shù)-處理后每毫升菌數(shù)對(duì)照毫升菌數(shù)]×100

1.3 β-甘露聚糖酶活性評(píng)估 初步評(píng)估：采用魔芋粉鑒別培養(yǎng)基培養(yǎng)突變株，觀(guān)察水解圈的大小。定量評(píng)估：DNS法測(cè)定菌株發(fā)酵液中的β-甘露聚糖酶活性。操作過(guò)程：將魔芋粉調(diào)制成0.5%作為底物，在0.9mL底物中加入0.1mL粗酶液（待測(cè)菌株在不加瓊脂的魔芋粉鑒別培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)液），置于55℃的水浴鍋中反應(yīng)10min，之后加入2.0mLDNS試劑，煮沸5min以終止魔芋粉在β-甘露聚糖酶催化下的水解反應(yīng)，快速冷卻后用蒸餾水定容至25mL，用空白液將分光光度計(jì)歸零，在波長(zhǎng)540nm處測(cè)吸光度，設(shè)ZMD13的對(duì)照組。酶活力計(jì)算：在上述反應(yīng)條件下，用0.5%濃度的魔芋膠作為底物，1min時(shí)段內(nèi)釋放1μmol相當(dāng)于D-甘露糖的還原糖所需的酶量為1個(gè)酶活單位（U）[2，7]。

2 結(jié)果與分析

2.1 誘變致死率 以誘變的照射時(shí)間為橫坐標(biāo)，菌體致死率為縱坐標(biāo)繪制致死率曲線(xiàn)（圖1）。由致死率曲線(xiàn)可知，在功率15W、紫外燈距離30cm、照射時(shí)間1.5min條件下，致死率達(dá)到75%，故確定為出發(fā)菌株ZMD13的誘變?cè)囼?yàn)劑量。

2.2 誘變效果 在功率15W、紫外燈距離30cm、照射時(shí)間1.5min誘導(dǎo)條件下對(duì)出發(fā)菌株ZMD13進(jìn)行誘變，將誘變處理在魔芋粉鑒別培養(yǎng)基上進(jìn)行37℃恒溫避光培養(yǎng)，48h后染色，依據(jù)水解圈直徑與菌落直徑比值（HC）大小，確定ZMD13的誘變效果，結(jié)果見(jiàn)表1。選取不同平板中正向突變菌落中HC比最大的3株正突變菌株并依次編號(hào)為ZMD13-1、ZMD13-2和ZMD13-3，見(jiàn)圖2。為了考察3株菌正向突變遺傳穩(wěn)定性，在魔芋粉鑒別培養(yǎng)基上連續(xù)進(jìn)行了5次傳代培養(yǎng)，見(jiàn)表2，判斷依據(jù)是HC值的大小。結(jié)果顯示，正突變株ZMD13-1、ZMD13-2和ZMD13-3的β-甘露聚糖酶活性在五代平板培養(yǎng)結(jié)果之間區(qū)別不明顯，方差分析結(jié)果差異未達(dá)顯著水平，故ZMD13-1、ZMD13-2和ZMD13-3 3株正突變株產(chǎn)β-甘露聚糖酶活性的遺傳穩(wěn)定性較好。

2.3 3株正突變菌株的產(chǎn)酶能力 以出發(fā)菌株ZMD13作為對(duì)照，對(duì)誘變效果最好的3個(gè)正向突變菌株ZMD13-1、ZMD13-2和ZMD13-3的β-甘露聚糖酶活性進(jìn)行定量測(cè)定（圖3）。結(jié)果顯示，ZMD13-1、ZMD13-2和ZMD13-3 3個(gè)突變菌株在搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)的過(guò)程中，β-甘露聚糖酶活性均比對(duì)照出發(fā)菌株要高，其中突變株ZMD13-2的β-甘露聚糖酶活性最高，發(fā)酵6h時(shí)達(dá)到峰值32.0U/mL，是出發(fā)菌株RYXP最高值6.0U/mL的5.3倍。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)紫外線(xiàn)對(duì)出發(fā)菌株ZMD13進(jìn)行誘變處理，結(jié)果明顯提高了土著菌株RYXP產(chǎn)β-甘露聚糖酶活性，ZMD13-1、ZMD13-2和ZMD13-3等3個(gè)突變菌株豐富了備選菌株資源庫(kù)，擴(kuò)大了產(chǎn)酶條件優(yōu)化、功能菌劑開(kāi)發(fā)等下游研究的選擇空間。

3 討論

土壤中的微生物種類(lèi)繁多，通過(guò)各種技術(shù)手段獲得的土著功能微生物資源的產(chǎn)酶活性往往較低，很多時(shí)候功能菌株無(wú)法達(dá)到或滿(mǎn)足實(shí)際開(kāi)發(fā)應(yīng)用的水平[4，5，8]。為此，積極開(kāi)展土著微生物資源的誘變選育成了功能菌資源開(kāi)發(fā)必然選項(xiàng)。在此背景下，本文對(duì)煙草根際土壤中獲得的產(chǎn)β-甘露聚糖酶活性菌株ZMD13進(jìn)行紫外線(xiàn)誘后，獲得ZMD13-1、ZMD13-2和ZMD13-3活性較強(qiáng)的正突變株，通過(guò)平板鑒別初評(píng)和DNS法定量測(cè)定，明確了ZMD13-1、ZMD13-2和ZMD13-3各自的基本產(chǎn)酶活性特征，其中突變株ZMD13-2的最高酶活性達(dá)到了32.0U/mL，與出發(fā)菌株相比優(yōu)勢(shì)明顯，最具開(kāi)發(fā)潛力。但菌株的產(chǎn)酶活性受復(fù)雜因素的影響[9]，故本試驗(yàn)獲得的ZMD13-1、ZMD13-2和ZMD13-3突變株仍需要后期進(jìn)行大量的復(fù)合誘變、產(chǎn)酶條件優(yōu)化等基礎(chǔ)工作。

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（責(zé)編：張 麗）