李文靜 李浩渤 王菲菲 劉從娜 郭 晗 王 燕

(河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院口腔內(nèi)科，石家莊 050000)

當(dāng)牙體組織受到外傷、齲病等因素而損傷牙髓時(shí)，部分成牙本質(zhì)細(xì)胞受到損傷發(fā)生變性，變性的牙本質(zhì)細(xì)胞可由牙髓未分化間充質(zhì)細(xì)胞代替形成牙本質(zhì)，保護(hù)牙髓。牙髓中的牙髓干細(xì)胞具有多向分化潛能，可分化為成牙本質(zhì)細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肌細(xì)胞、骨細(xì)胞等多種細(xì)胞，牙髓干細(xì)胞的增殖和分化在牙本質(zhì)的修復(fù)性形成中具有重要作用，因此探討牙髓干細(xì)胞增殖和凋亡的機(jī)制具有重要意義[1,2]。腎上腺髓質(zhì)素具有誘導(dǎo)成骨、調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、促進(jìn)血管生成、促進(jìn)細(xì)胞遷移等多種效應(yīng)，在牙本質(zhì)基質(zhì)形成和牙齒發(fā)育中具有重要作用[3,4]，有研究發(fā)現(xiàn)腎上腺髓質(zhì)素可促進(jìn)牙髓干細(xì)胞的增殖和分化[5]，但其通過哪種信號通路促進(jìn)牙髓干細(xì)胞增殖尚不清楚。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(Phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B，PI3K/Akt)信號通路在細(xì)胞增殖和凋亡中發(fā)揮重要作用，參與多種細(xì)胞的增殖和凋亡[6]。 本文對腎上腺髓質(zhì)素對人牙髓干細(xì)胞增殖和凋亡以及PI3K/Akt信號通路的影響進(jìn)行研究，探討腎上腺髓質(zhì)素在牙髓干細(xì)胞增殖和凋亡中的作用及可能機(jī)制，為臨床提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 組織來源：選取我院因正畸需要拔出的恒牙2顆，所選牙無根尖周炎、無齲壞、無牙周炎，且患者簽署知情同意書。主要試劑和儀器：腎上腺髓質(zhì)素、胰蛋白酶、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(美國CST公司)，PI3K/Akt通路抑制劑LY294002、四唑鹽(Tetrazolium salt，MTT)試劑盒、BCA蛋白濃度檢測試劑盒、細(xì)胞凋亡測定試劑盒(Annexin V-FITC/PI)(美國Invitrogen公司)，鼠抗人CD44抗體、鼠抗人CD34抗體、兔抗人增殖細(xì)胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen，PCNA)多克隆抗體、兔抗人Cleaved Caspase-3多克隆抗體、兔抗人PI3K多克隆抗體、兔抗人磷酸化Akt(Phosphorylated Akt，p-Akt)多克隆抗體、兔抗人Akt多克隆抗體等(美國Sigma公司)等。BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀(美國BD公司)等。

1.2方法

1.2.1牙髓干細(xì)胞培養(yǎng) 使用鉗子，將拔除后的離體牙放入液氮中，牙科金剛砂車針將離體牙縱向切開，使用無菌器械鑷子刮取牙髓組織，在DMEM培養(yǎng)基中將牙髓組織剪碎，用Ⅰ型膠原酶水浴消化1.5 h至組織塊松散，離心(1 000 r/min)5 min，棄去上清液，加入FBS培養(yǎng)基吹打成混懸液，移入6孔板中培養(yǎng)，隔日進(jìn)行半量換液，收集細(xì)胞的培養(yǎng)上清液離心(1 000 r/min)10 min，加入含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行原代培養(yǎng)，培養(yǎng)至出現(xiàn)細(xì)胞克隆，挑選細(xì)胞克隆轉(zhuǎn)移到96孔板中培養(yǎng)，達(dá)一定數(shù)量后依次轉(zhuǎn)移到24孔板中、6孔板中、培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，細(xì)胞達(dá)85%融合后進(jìn)行胰酶消化傳代。

1.2.2牙髓干細(xì)胞鑒定 將生長良好的第三代牙髓干細(xì)胞用胰酶消化，用培養(yǎng)基重懸調(diào)整牙髓干細(xì)胞濃度為1×108L-1，接種到6孔板中培養(yǎng)，24 h棄去上清液，加入PBS洗滌，干燥后用多聚甲醛固定，PBS洗滌，按免疫組化染色試劑盒說明書檢測牙髓干細(xì)胞中CD44和CD34的表達(dá)情況，陰性對照組不加一抗進(jìn)行孵育，陽性對照組加入一抗進(jìn)行孵育：用山羊血清封閉10 min，加入一抗過夜孵育，加入生物素標(biāo)記的二抗孵育30 min，加入辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素孵育30 min，DAB顯色10 min，中性樹膠封片。

1.2.3牙髓干細(xì)胞分組及處理 取第三代牙髓干細(xì)胞隨機(jī)分為對照組、腎上腺髓質(zhì)素組和腎上腺髓質(zhì)素+抑制劑組。腎上腺髓質(zhì)素組培養(yǎng)基中加入濃度為107mol/L的腎上腺髓質(zhì)素；腎上腺髓質(zhì)素+抑制劑組培養(yǎng)基中加入濃度為107mol/L的腎上腺髓質(zhì)素[5]和15 μmol/L的LY294002[7]；對照組培養(yǎng)基不加處理，培養(yǎng)48 h收集細(xì)胞。

1.2.4MTT測定牙髓干細(xì)胞增殖 將三組細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞密度為3×104ml-1接種到96孔板中，每孔200 μl，分別在培養(yǎng)1 d、3 d、7 d加入10 μl MTT試劑孵育4 h，用分光光度計(jì)測定波長490 nm處吸光度(A)值。

1.2.5流式細(xì)胞術(shù)測定牙髓干細(xì)胞凋亡 將三組細(xì)胞用PBS液洗滌，加入緩沖液重懸細(xì)胞，調(diào)整牙髓干細(xì)胞濃度為1×106ml-1，在流式管中加入100 μl細(xì)胞懸液，加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI室溫孵育15 min，上機(jī)測定各組牙髓干細(xì)胞凋亡情況。

1.2.6Western blot測定牙髓干細(xì)胞中PCNA、Cleaved Caspase-3和PI3K、p-Akt、Akt蛋白水平 取上述三組牙髓干細(xì)胞，加入RIPA裂解液裂解牙髓干細(xì)胞30 min，離心(12 000 r/min)10 min，收集上清液，測定各組牙髓干細(xì)胞蛋白濃度，將各組牙髓干細(xì)胞蛋白樣品和上樣液(上樣量30 μg)混合變性5 min，加入到制備好的SDS-PAGE凝膠上樣孔中電泳，轉(zhuǎn)膜1.5 h，脫脂奶粉封閉2 h，加入PCNA、Cleaved Caspase-3和PI3K、p-Akt、Akt一抗過夜孵育，加入辣根過氧化物標(biāo)記的羊抗兔IgG孵育2 h，ECL顯影，自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，以β-actin為內(nèi)參，目標(biāo)蛋白表達(dá)量以目標(biāo)蛋白灰度值/β-actin蛋白灰度值表示。

2 結(jié)果

2.1牙髓干細(xì)胞培養(yǎng) 培養(yǎng)72 h 細(xì)胞貼壁生長，有小細(xì)胞克隆形成，細(xì)胞多呈成纖維細(xì)胞樣；7 d時(shí)有較多細(xì)胞從組織塊周圍游離出來。細(xì)胞增殖至1 000 個(gè)細(xì)胞左右時(shí)消化傳代，傳代培養(yǎng)細(xì)胞呈長梭形，有細(xì)胞突起。見圖1。

圖1 牙髓干細(xì)胞培養(yǎng)形態(tài)特征Fig.1 Morphological characteristics of dental pulp stem cellsNote:A.Primary culture 24 h (×40)；B.Primary culture 7 d (×40)；C.Subculture 3rd generation (×100).

2.2牙髓干細(xì)胞鑒定 免疫組化結(jié)果顯示牙髓干細(xì)胞陽性表達(dá)CD44，陰性表達(dá)CD34，表明培養(yǎng)細(xì)胞為牙髓干細(xì)胞。見圖2。

圖2 免疫組化染色鑒定牙髓干細(xì)胞CD44和CD34表達(dá)(×200)Fig.2 Immunohistochemical staining for expression of CD44 and CD34 in dental pulp stem cells (×200)Note:A,B.CD44 positive and negative control;C.The dental pulp stem cell marker CD44;D,E.CD33 positive control and the negative control;F.The dental pulp stem cell mark CD34.

2.3各組牙髓干細(xì)胞增殖情況比較 腎上腺髓質(zhì)素+抑制劑組加入15 μmol/L的PI3K/Akt通路抑制劑LY294002，用分光光度計(jì)測定波長490 nm處的A值。培養(yǎng)1 d，對照組、腎上腺髓質(zhì)素組和腎上腺髓質(zhì)素+抑制劑組牙髓干細(xì)胞A值比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；培養(yǎng)3 d和7 d，各組牙髓干細(xì)胞A值比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與對照組比較，腎上腺髓質(zhì)素組和腎上腺髓質(zhì)素+抑制劑組牙髓干細(xì)胞A值升高(P<0.05)，與腎上腺髓質(zhì)素組比較，腎上腺髓質(zhì)素+抑制劑組牙髓干細(xì)胞A值降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組牙髓干細(xì)胞A值比較

Tab.1 Comparison of A values of dental pulp stem cells in each group

GroupsnA values1 d3 d7 dControl group70.82±0.171.58±0.181.94±0.15Adrenomedullin group70.93±0.221)2.12±0.211)2.65±0.181)Adrenomedullin +inhibitor group70.86±0.191)2)1.79±0.161)2)2.31±0.141)2)t0.57415.24135.545P0.573<0.001<0.001

Note：1)P<0.05 compared with control group；2)P<0.05 compared with adrenomedullin group.

2.4各組牙髓干細(xì)胞凋亡情況比較 各組牙髓干細(xì)胞凋亡率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與對照組比較，腎上腺髓質(zhì)素組和腎上腺髓質(zhì)素+抑制劑組牙髓干細(xì)胞凋亡率降低(P<0.05)，與腎上腺髓質(zhì)素組比較，腎上腺髓質(zhì)素+抑制劑組牙髓干細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05)。見表2和圖3。

表2 各組牙髓干細(xì)胞凋亡率比較

Tab.2 Comparison of apoptotic rate of dental pulp stem cells in each group

GroupsnApoptotic rateControl group712.41±1.26Adrenomedullin group75.24±1.131)Adrenomedullin +inhibitor group77.62±1.571)2)t52.550P<0.001

Note：Compared with control group，1)P<0.05；compared with adrenomedullin group，2)P<0.05.

圖3 流式細(xì)胞術(shù)測定各組牙髓干細(xì)胞凋亡Fig.3 Flow cytometry to determine apoptosis of dental pulp stem cells in each groupNote:PI.Propidium iodide；Annexin V FITC.Annexin V labeled with fluorescein isothiocyanate.A.Control group;B.Adrenomedullin group;C.Adrenomedullin+inhibitor group.

2.5各組細(xì)胞PCNA、Cleaved Caspase-3蛋白水平比較 PCNA可以反映細(xì)胞的增殖狀態(tài)，Cleaved Caspase-3可反映細(xì)胞凋亡情況，選擇PCNA、Cleaved Caspase-3了解細(xì)胞增殖和凋亡情況。各組牙髓干細(xì)胞PCNA、Cleaved Caspase-3蛋白水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與對照組比較，腎上腺髓質(zhì)素組和腎上腺髓質(zhì)素+抑制劑組牙髓干細(xì)胞PCNA蛋白水平升高(P<0.05)，Cleaved Caspase-3蛋白水平降低(P<0.05)，與腎上腺髓質(zhì)素組比較，腎上腺髓質(zhì)素+抑制劑組牙髓干細(xì)胞PCNA蛋白水平降低(P<0.05)，Cleaved Caspase-3蛋白水平升高(P<0.05)。見表3和圖4。

表3 各組細(xì)胞PCNA、Cleaved Caspase-3蛋白水平比較

Tab.3 Comparison of PCNA and Cleaved Caspase-3 protein levels in each group

GroupsnPCNACleaved Caspase-3Control group70.09±0.020.28±0.06Adrenomedullin group70.33±0.051)0.12±0.031)Adrenomedullin +inhibitor group70.16±0.041)2)0.23±0.021)2)t71.08928.714P<0.001<0.001

Note：Compared with control group，1)P<0.05；compared with adrenomedullin group，2)P<0.05.

圖4 Western blot測定各組細(xì)胞PCNA、Cleaved Caspase-3蛋白Fig.4 PCNA and Cleaved Caspase-3 proteins in each group by Western blotNote:A.Control group;B.Adrenomedullin group;C.Adrenomedullin +inhibitor group.

2.6各組細(xì)胞PI3K、p-Akt、Akt蛋白水平比較 各組牙髓干細(xì)胞PI3K、p-Akt蛋白水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與對照組比較，腎上腺髓質(zhì)素組牙髓干細(xì)胞PI3K、p-Akt蛋白水平升高(P<0.05)，與腎上腺髓質(zhì)素組比較，腎上腺髓質(zhì)素+抑制劑組牙髓干細(xì)胞PI3K、p-Akt蛋白水平降低(P<0.05)，各組牙髓干細(xì)胞Akt蛋白水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表4和圖5。

表4 各組細(xì)胞PI3K、p-Akt、Akt蛋白水平比較

Tab.4 Comparison of PI3K，p-Akt，Akt protein levels in each group

GroupsnPI3Kp-AktAktControl group70.78±0.120.51±0.160.39±0.11Adrenomedullin group70.95±0.141)0.91±0.191)0.38±0.121)Adrenomedullin +inhibitor group70.36±0.091)2)0.27±0.111)2)0.41±0.091)2)t46.00729.7450.142P<0.001<0.0010.869

Note：1)P<0.05 compared with control group；2)P<0.05 compared with adrenomedullin group.

圖5 Western blot測定各組細(xì)胞PI3K、p-Akt、Akt蛋白Fig.5 PI3K，p-Akt，Akt proteins in each group by Western blotNote:A.Control group;B.Adrenomedullin group;C.Adrenomedullin +inhibitor group.

3 討論

齲病的發(fā)展是一系列反應(yīng)，包括損傷、防御、修復(fù)三個(gè)方面，其中防御和修復(fù)在齲病的發(fā)展中具有重要作用，且具有明顯的臨床意義，因此成為齲病研究的重點(diǎn)。齲病的發(fā)展可侵犯牙髓組織，但臨床上保護(hù)牙髓活性的成功率比較低，因此通過分子細(xì)胞生物技術(shù)保護(hù)牙髓活性成為新的研究方向[8]。當(dāng)牙髓受到損傷時(shí)，其相對部位成牙本質(zhì)細(xì)胞壞死，牙髓組織中的前體細(xì)胞分化成成牙本質(zhì)細(xì)胞，形成成牙本質(zhì)基質(zhì)，形成修復(fù)性牙本質(zhì)。牙髓組織中的牙髓干細(xì)胞具有多向分化和自我更新潛能，可分化為成牙本質(zhì)細(xì)胞，具有形成牙本質(zhì)基質(zhì)的能力，因此牙髓干細(xì)胞在牙本質(zhì)再生和修復(fù)中具有重要意義[9]。

腎上腺髓質(zhì)素為一種多能性肽，具有誘導(dǎo)成骨、調(diào)節(jié)炎癥、調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移和凋亡等多種功能，在哺乳動(dòng)物的發(fā)育中具有重要作用[10]。腎上腺髓質(zhì)素可由牙本質(zhì)細(xì)胞表達(dá)，在牙齒發(fā)育的關(guān)鍵時(shí)間點(diǎn)也有腎上腺髓質(zhì)素表達(dá)，腎上腺髓質(zhì)素的表達(dá)對牙本質(zhì)細(xì)胞的形成和牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞有影響，腎上腺髓質(zhì)素可具有促進(jìn)骨形成的作用[11,12]。腎上腺髓質(zhì)素也具有促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡的作用[13,14]，如孫晶等[15]研究發(fā)現(xiàn)抑制腎上腺髓質(zhì)素可抑制胃癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)：腎上腺髓質(zhì)素可升高牙髓干細(xì)胞增殖A值、降低牙髓干細(xì)胞凋亡率，升高牙髓干細(xì)胞PCNA蛋白水平，降低牙髓干細(xì)胞Cleaved Caspase-3蛋白水平。PCNA存在于腫瘤細(xì)胞和正常增殖細(xì)胞內(nèi)，和細(xì)胞DNA合成有密切關(guān)系，參與細(xì)胞增殖的啟動(dòng)過程，可以反映細(xì)胞的增殖狀態(tài)[16]；Caspase-3為一種蛋白酶，是細(xì)胞凋亡中最重要的終末剪切酶，是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵蛋白，在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用，正常組織中Caspase-3以無活性形成存在，在凋亡途徑中最終可引起Caspase-3活化[17,18]。因此本研究結(jié)果表明腎上腺髓質(zhì)素可促進(jìn)牙髓干細(xì)胞增殖、抑制牙髓干細(xì)胞凋亡。

PI3K/Akt在多種細(xì)胞中廣泛存在，屬于絡(luò)氨酸激酶受體介導(dǎo)信號通路，參與細(xì)胞生長、增殖和分化過程[19,20]。PI3K/Akt信號通路是經(jīng)典的信號傳導(dǎo)通路，在多種腫瘤細(xì)胞中PI3K/Akt信號通路處于激活狀態(tài)，在PI3K/Akt信號通路中，Akt位于樞紐部分，PI3K可引起Akt磷酸化而發(fā)揮生物學(xué)功能[21-23]，如張小三等[7]研究發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt信號通路參與食管癌細(xì)胞的增殖和凋亡過程。本研究發(fā)現(xiàn)腎上腺髓質(zhì)素可升高牙髓干細(xì)胞PI3K、p-Akt蛋白水平，給予PI3K/Akt信號通路抑制劑處理后，牙髓干細(xì)胞PI3K、p-Akt蛋白水平降低，且抑制腎上腺髓質(zhì)素對牙髓干細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用和對牙髓干細(xì)胞凋亡的抑制作用。表明腎上腺髓質(zhì)素可能通過激活PI3K/Akt通路促進(jìn)牙髓干細(xì)胞增殖、抑制牙髓干細(xì)胞凋亡。

綜上所述，腎上腺髓質(zhì)素可促進(jìn)牙髓干細(xì)胞增殖、抑制牙髓干細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與其激活PI3K/Akt信號通路有關(guān)。