李文慧，劉飛，劉江，趙巧玲，董娟，*

（1.石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆石河子832000；2.喀什大學(xué)生命與地理科學(xué)學(xué)院，新疆喀什844006；3.新疆賽里木現(xiàn)代農(nóng)業(yè)股份有限公司，新疆博樂833400）

葡萄在世界上無論是栽培還是產(chǎn)量都在水果里占有很大的比例，全世界葡萄的每年產(chǎn)量大概有6 000萬噸，我國年產(chǎn)量達(dá)到200多萬噸，由于對葡萄籽不合理利用和加工，造成了葡萄籽副產(chǎn)物不可避免的浪費(fèi)[1]。葡萄籽蛋白含有人體8種必需氨基酸，脫脂葡萄籽粕中含有蛋白質(zhì)約13%～16%，而脫殼榨油后的籽粕中蛋白質(zhì)含量高達(dá)30%，以酶解的方法能夠水解葡萄籽蛋白并且成功得到葡萄籽活性多肽，多肽分子量很小并且沒有免疫原性、易吸收，同時為我國動植物生物活性多肽的研究提供強(qiáng)有力的理論基礎(chǔ)[2]。

本文通過酶法改性、冷凍干燥制備葡萄多肽，再根據(jù)自由基清除能力、抗油脂氧化酸敗和還原能力的測定，分析葡萄多肽的抗氧化活性；最后通過試驗設(shè)計優(yōu)化工藝流程關(guān)鍵技術(shù)參數(shù)，確定最佳工藝參數(shù)，可提高葡萄籽的附加值，具有較好的發(fā)展前景[3]。不但能夠充分利用新疆優(yōu)越的資源優(yōu)勢，推動多肽食品的開發(fā)，而且還能推動新疆的農(nóng)作物經(jīng)濟(jì)發(fā)展，實(shí)現(xiàn)資源的有效利用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

曬干的葡萄籽：瑪納斯縣新天國際葡萄酒業(yè)有限公司。以脫脂葡萄籽粕為原料，采用酶輔助堿溶酸沉法得到脫脂葡萄籽中的蛋白質(zhì)。

石油醚、氫氧化鈉、甲醛、DPPH試劑：天津永晟精細(xì)化工有限公司；95%乙醇：烏魯木齊碘伏消毒液有限責(zé)任公司；考馬斯亮藍(lán)G-250：背景博奧拓達(dá)科技有限公司；牛血清白蛋白、木瓜蛋白酶（＞200 U/mg）、堿性蛋白酶（＞200 U/mg）：安馳科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

小鋼磨粉碎機(jī)：溫嶺市林大機(jī)械有限公司；ZXRD-7080全自動新型鼓風(fēng)烘箱：上海智城分析儀器制造有限公司；DK-8D數(shù)顯恒溫水浴鍋：金壇市醫(yī)療儀器廠；Multifuge X3R 離心機(jī)：Thermo Fisher scientific；UVmini-1240分光光度計：日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 葡萄籽多肽的制備工藝流程

脫脂葡萄籽蛋白→復(fù)合酶解（堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶）→離心→干燥→酶解物（葡萄籽多肽）

1.3.2 水解度的測定

蛋白質(zhì)在水解過程中肽鍵會斷裂生成多肽或游離氨基酸[4]。因此，水解度=游離氨基氮含量/總氮含量。游離氨基氮含量采用甲醛滴定法，總氮含量測定采用凱式定氮法（GB 5009.5-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的測定》）。

1.3.3 復(fù)合酶解單因素試驗設(shè)計

分別以復(fù)合酶質(zhì)量比（0∶10、4∶6、5∶5、7∶3、9∶1、10∶0）、酶濃度（0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%）、pH（6.2、6.6、7.0、7.4、7.8）、酶解溫度（40、45、50、55、60 ℃）和酶解時間（1、2、3、4、5 h）為影響因素考察其對水解度的影響[5]。

1.3.4 試驗設(shè)計

通過單因素試驗確定了復(fù)合酶質(zhì)量比為7∶3，在單因素試驗得到最佳值的基礎(chǔ)上，使用Design-Expert 8.9.6軟件程序，根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗設(shè)計原理，選擇如表1所示的響應(yīng)面分析法，以水解度為響應(yīng)值，通過響應(yīng)面分析對提取條件進(jìn)行優(yōu)化，選擇出葡萄籽多肽水解度最高的提取條件為最佳提取工藝[6-7]。各因素、水平的正交試驗，因素水平見表1。

表1 響應(yīng)面因素水平表Table 1 Response surface factor level

1.3.5 葡萄籽多肽抑制油脂氧化活性的研究

采用最優(yōu)工藝提取出的葡萄籽蛋白多肽，分別溶于葵花籽油中，在65℃強(qiáng)化條件下，定期（每隔2天）測定油脂的過氧化值，相同條件下與VC、VE做對照試驗，觀察葡萄籽蛋白多肽對葵花籽油氧化的抑制作用[8]。

1.3.6 清除DPPH自由基能力的測定[9]

將1 mL不同濃度葡萄籽蛋白復(fù)合蛋白酶酶解物與3 mL的DPPH反應(yīng)，反應(yīng)平衡時517 nm處測定吸光度，研究其對DPPH自由基的清除率。

式中：A0為空白吸光度值；A為517 nm下加入樣品的DPPH的吸光度值；Ab為517 nm下不加入樣品的DPPH的吸光度值。

1.3.7 數(shù)據(jù)分析

試驗中每組試驗重復(fù)3次，OriginPro8.5進(jìn)行制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果分析

2.1.1 復(fù)合酶的配比對葡萄籽蛋白水解度的影響

復(fù)合酶的配比對葡萄籽蛋白水解度的影響見圖1。

圖1 復(fù)合酶的配比對葡萄籽蛋白水解度的影響Fig.1 Effect of the ratio of compound enzyme on the degree of hydrolysis of grape seed protein

根據(jù)圖1可知，使用質(zhì)量比為堿性蛋白酶∶木瓜蛋白酶=7∶3時，蛋白多肽水解度達(dá)到17.93%，當(dāng)加入堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶時，蛋白多肽被分解為分子質(zhì)量更小的多肽和氨基酸，因此效果最佳[10]。

2.1.2 復(fù)合酶濃度的影響

設(shè)定酶解pH7.0、酶解溫度45℃、酶解時間3 h，考慮不同酶濃度（0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%）對水解度的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 復(fù)合酶濃度對水解度的影響Fig.2 Effect of the concentration of complex enzyme on the degree of hydrolysis

由圖2可知，在pH值、酶解溫度、酶解時間一定的情況下，隨著酶濃度的增大，反應(yīng)速度越快，蛋白質(zhì)水解度也越高，但當(dāng)酶濃度為2%以后水解度基本不再增加[11-12]。

2.1.3 pH值的影響

設(shè)定酶濃度為2%、酶解溫度45℃、酶解時間3 h，考慮不同pH值對水解度的影響，結(jié)果見圖3。

由圖3可知，在酶濃度、酶解溫度、酶解時間一定的情況下，使用復(fù)合蛋白酶水解pH 7.4左右時，水解度達(dá)到最大，高于或低于此值，酶的活性都會受到抑制[12-14]。

圖3 pH值對水解度的影響Fig.3 Effect of pH on the degree of hydrolysis

2.1.4 酶解溫度的影響

設(shè)定酶濃度為2%、pH為7.4、酶解時間3 h，考慮不同酶解溫度對水解度的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 溫度對水解度的影響Fig.4 Effect of temperature on degree of hydrolysis

酶是具有很強(qiáng)專一性的蛋白質(zhì)，所以只有達(dá)到某種溫度時，酶才有最強(qiáng)的活性，當(dāng)加熱溫度過高時，會導(dǎo)致酶蛋白變性，使酶喪失催化能力。由圖4可知，在酶濃度、pH值、酶解時間一定的情況下，使用復(fù)合蛋白酶水解脫脂葡萄籽，酶解溫度50℃時，水解度達(dá)到最大[15-18]。

2.1.5 酶解時間的影響

設(shè)定酶濃度為2%、pH為7.4、酶解溫度50℃，考慮不同酶解時間對水解度的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 時間對水解度的影響Fig.5 Effect of time on the degree of hydrolysis

由圖5可知，在前3 h內(nèi)，水解度有一個較快的增加，但是酶解3 h以后再延長酶解時間，水解度基本上不再增加。因此，考慮到生產(chǎn)成本，選擇3 h為最佳酶解時間。

2.2 響應(yīng)面法試驗結(jié)果及回歸方程分析

2.2.1 響應(yīng)面法試驗方案及結(jié)果

在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，選定酶解時間（A）、酶解溫度（B）、酶解pH值（C）為因素，以水解度為響應(yīng)值，根據(jù)響應(yīng)面分析方法，設(shè)計三因素三水平試驗方案，試驗設(shè)計方案及結(jié)果見表2，試驗設(shè)計方案共17個試驗點(diǎn)，12個為分析試驗，其余5個為中心試驗（用于估算試驗誤差）。

表2 響應(yīng)面試驗方案及結(jié)果Table 2 Response plan experiments and results

2.2.2 回歸方程的建立與方差分析

回歸方程方差分析見表3。

表3 回歸方程方差分析Table 3 Analysis of variance of regression equation

續(xù)表3 回歸方程方差分析Continue table 3 Analysis of variance of regression equation

試驗結(jié)果進(jìn)行多元擬合回歸，得到以葡萄籽蛋白水解度（Y）為因變量，以酶解時間（A）、酶解溫度（B）、酶解pH值（C）為自變量的回歸方程為：Y=23.33-1.23 A+0.30B+2.88C+0.020AB+2.15AC-0.16BC-1.05A2-2.73B2-1.64C2

由表3可知，回歸模型P小于0.000 1，水平為極顯著，能夠正確反映葡萄籽蛋白水解度與各因素之間的關(guān)系，失擬項P值為0.921 1，P＞0.05，表示其不顯著，說明回歸模型與實(shí)際實(shí)驗擬合較好，多元相關(guān)系數(shù)R2=0.996 6，表明實(shí)測值和預(yù)測值間有很好的擬合度，此模型調(diào)整R2為0.986 5，表明有98.65%的得率變異分布在所研究的3個相關(guān)因素中。方程的B、BC表現(xiàn)為顯著，A、C、AC、A2、B2、C2表現(xiàn)為極顯著，說明這3個因素對葡萄籽蛋白水解度影響都較大。根據(jù)F值大小，可知影響因素的主次順序為酶解pH值＞酶解時間＞酶解溫度。方差分析結(jié)果顯示該回歸模型適用，可適用于葡萄籽多肽提取試驗。

2.3 響應(yīng)面分析

利用軟件對試驗結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計并生成響應(yīng)曲面圖及等高線圖，見圖6～圖11。

圖6 時間-溫度等高線圖Fig.6 Time-temperature contour map

圖7 時間-溫度響應(yīng)曲面圖Fig.7 Time-temperature response surface map

圖8 溫度-pH等高線圖Fig.8 Temperature-pH contour map

圖9 溫度-pH響應(yīng)曲面圖Fig.9 Temperature-pH response surface map

等高線圖的形狀一般趨于橢圓形和圓形，橢圓形表示因素作用顯著，而圓形則與其相反。同樣，從響應(yīng)曲面圖曲面的平緩或陡峭也可以反映出兩因素交互作用的強(qiáng)弱，若曲面較平緩，說明兩因素交互作用不顯著，若曲面較陡，則表示兩因素交互作用顯著[12]。

從以上時間-溫度等高線圖可以看出，等高線的形狀為橢圓形，表示時間、溫度兩個因素的交互作用顯著，從時間-溫度響應(yīng)曲面圖可以看出，隨著C（酶解時間）、B（酶解溫度）的增加，葡萄籽蛋白的水解度有明顯的變化趨勢，最佳的酶解時間和酶解溫度都在一個范圍內(nèi)，酶解溫度越高、酶解時間越長，葡萄籽蛋白的水解度都有所下降，所以，酶解溫度和酶解時間對葡萄籽蛋白的水解度有所影響。

圖10 時間-pH等高線圖Fig.10 Time-pH contour map

圖11 時間-pH響應(yīng)曲面圖Fig.11 Time-pH response surface map

從以上溫度-pH值等高線圖的形狀（橢圓）可以看出，酶解溫度和酶解pH值兩個因素的交互作用顯著，從溫度-pH值的響應(yīng)曲面圖可以看出，隨著pH值和酶解溫度的增加，葡萄籽蛋白的水解度有明顯的變化，表現(xiàn)為曲面變陡，因此，酶解溫度與酶解pH值對葡萄籽多肽的提取有極其顯著的效果。

從以上時間-pH值等高線圖的形狀（橢圓）可以看出，酶解時間、酶解pH值兩個因素的交互作用顯著，從時間-pH響應(yīng)曲面圖可以看出隨著A（酶解時間）、C（酶解pH值）的增加，葡萄籽蛋白的水解度有明顯的變化，表現(xiàn)為曲面變得較陡，因此，酶解溫度與酶解pH值對提取效果的影響較顯著。

2.4 最佳工藝的確定及驗證試驗

對二次多項回歸方程求偏導(dǎo)得最優(yōu)工藝組合為酶添加量為2%、酶解溫度50.47℃，酶解時間3.61 h，酶解pH7.39，預(yù)測響應(yīng)值為24.47%。為檢驗響應(yīng)面法（response surface method，RSM）法的可靠性，采用最優(yōu)工藝組合進(jìn)行試驗證明，基于試驗操作的可行性，選取酶添加量為2%、酶解溫度50℃、酶解pH7.4、酶解時間3 h，得到的響應(yīng)值為24.33%，是理論值的95.34%，十分接近預(yù)測響應(yīng)值，符合要求[19-20]。

2.5 葡萄籽蛋白酶解產(chǎn)物抑制油脂氧化活性的結(jié)果分析

不同濃度葡萄籽蛋白酶解物對葵花籽油過氧化值的影響見圖12。

圖12 不同濃度葡萄籽蛋白酶解物對葵花籽油過氧化值的影響Fig.12 Effect of different concentrations of grape seed protein hydrolysate on peroxide value of sunflower oil

由圖12明顯看出，葡萄籽蛋白酶解物對葵花籽油氧化的抑制作用隨著濃度增大而增強(qiáng)，第8天添加0.15%葡萄籽提取物的葵花籽油過氧化值明顯增高，綜合考慮，遵循經(jīng)濟(jì)原則，葡萄籽提取物用量為0.15%時抗氧化效果較好。

不同抗氧化劑對葵花籽油過氧化值的影響見圖13。

圖13 不同抗氧化劑對葵花籽油過氧化值的影響Fig.13 Effect of different antioxidants on peroxide value of sunflower oil

由圖13可知，葡萄籽蛋白酶解物和所選抗氧化劑對葵花籽油的氧化均有抑制作用，在抗氧化劑濃度都為0.15%時，葡萄籽蛋白酶解物與VC、VE相比對葵花籽油過氧化值的影響較大，抗氧化效果更好。

2.6 葡萄籽酶解物清除自由基的能力

質(zhì)量濃度與DPPH自由基清除率的關(guān)系見圖14。

圖14 質(zhì)量濃度與DPPH自由基清除率的關(guān)系Fig.14 The relationship between DPPH free radical scavenging rate and mass concentration

由圖14可知，葡萄籽蛋白復(fù)合蛋白酶酶解物對清除DPPH 自由基有一定的作用，在120 μg/mL～600 μg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，其清除DPPH自由基的能力為19.25%～41.03%，并且葡萄籽蛋白復(fù)合酶酶解物對清除自由基的能力隨著其濃度的增加而增強(qiáng)。

3 結(jié)論

以曬干的葡萄籽為原料，用復(fù)合酶解法提高了葡萄籽多肽的提取得率，與VC、VE相比，葡萄籽多肽用量為0.15%時抗氧化效果較好，對自由基也有一定的清除作用，因此可以將其作為抗氧化劑在食品生產(chǎn)中得到廣泛應(yīng)用。