郗艷麗，周旋，霍明洋，翟曉瑞，馬鵬，馬一芯，張栩銘，徐斌

（吉林醫(yī)藥學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，吉林吉林132013）

香水檸檬[Citrus Limon（L.Burm.F.）]為臺灣培育品種，屬于須根系植物，性喜溫暖、耐陰、耐寒、不怕熱，其果型修長，果大色美，長圓型，該果香氣濃郁且維持較持久，完全沒有其他檸檬的酸澀味道，因其汁水香氣濃郁，故有“香水檸檬”之稱，因其無籽也叫“無籽檸檬”。香水檸檬一年四季花果同期，所以也稱“臺灣四季香水檸檬”。其最大特點(diǎn)是高產(chǎn)早產(chǎn)、果形美觀、汁多味香。成熟時(shí)果皮黃綠至淡黃色，形狀美觀，果皮光滑，味道清甜，肉嫩汁多，氣味香郁，無苦澀味，可以直接榨成果汁。香水檸檬能生津止渴，清熱解暑，行氣消食，化痰止咳，具有美容護(hù)膚、調(diào)味、補(bǔ)充鐵鈣、殺菌等功效，更是養(yǎng)顏美容、瘦身之佳品[1]。香水檸檬是世界上最有藥用價(jià)值的水果之一，它富含維生素B1、維生素 B2、維生素 B6、維生素 C、P、檸檬酸、煙酸、蘋果酸、高量鉀元素和低量鈉元素等，具有防止腎結(jié)石形成、防治心血管疾病、防治動(dòng)脈血管硬化和血栓的形成、止血、抗癌、治療腹瀉、預(yù)防流感等作用[2-3]。香水檸檬果汁具有較好的抗氧化作用[4]，其對預(yù)防老年性疾病有較好的作用。香水檸檬果皮富含色素、果膠和檸檬精油等成分，與檸檬果皮一樣，可成為生產(chǎn)香精香料及食品工業(yè)、輕紡工業(yè)、醫(yī)藥業(yè)的重要原材料[5-10]。為有效利用資源，變廢為寶，本研究擬采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化香水檸檬果皮綠色素的提取工藝，為香水檸檬的開發(fā)應(yīng)用提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

香水檸檬：產(chǎn)地海南，吉林市市售；無水乙醇（分析純）：北京化工廠；維生素C（Vitamin C，VC）、TiO2（分析純）：上海生工生物工程有限公司；檸檬酸、NaOH（分析純）：西隴化工股份有限公司；山梨酸鉀（食品級）、可溶性淀粉（食品級）、氯化鈉、葡萄糖、β-環(huán)胡精、聚乙二醇、AgNO3：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；MgSO4、KCl（分析純）：麥克林公司；Al（NO3）3（分析純）：天津市大茂化學(xué)試劑廠；FeSO4（分析純）：天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；FeCl3（分析純）：阿拉丁有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DK-S26數(shù)顯恒溫水浴鍋：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；MS-H-Pro磁力加熱攪拌器：大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；UV-2700紫外分光光度計(jì)：日本島津公司；QUINITIX124-1CN電子精密分析天平：德國賽多利斯有限公司；KQ-800KDE高功率超聲波清洗儀：昆山舒美超聲儀器有限公司；ZN多功能粉碎機(jī)：中南制藥機(jī)械廠；202-1型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：天津泰森儀器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 香水檸檬果皮綠色素的前處理及提取工藝

參考文獻(xiàn)[11]，將新鮮的香水檸檬洗凈后剝皮，將皮切成碎片后經(jīng)60℃烘干至恒重，粉碎過60目篩后備用。稱取一定量的香水檸檬果皮樣品，加入一定量的提取劑超聲輔助提取，3 000 r/min離心10 min，取上清液過濾后即為香水檸檬果皮綠色素提取液。

1.3.2 香水檸檬果皮綠色素最佳吸收波長的確定

精確稱取0.5 g香水檸檬果皮粉末，加入體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液25 mL，在480 W功率下進(jìn)行超聲波輔助提取45 min，3 000 r/min離心10 min，取上清液定容至25 mL，以提取溶劑作為空白對照，在300 nm～800 nm波長處測定綠色素的吸光度，確定香水檸檬果皮綠色素的最佳吸收波長。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

以香水檸檬果皮綠色素吸光度值為指標(biāo)，在固定提取條件下考察提取時(shí)間、提取功率、乙醇體積分?jǐn)?shù)和液料比對香水檸檬果皮綠色素提取效果的影響。提取時(shí)間分別為 15、30、45、60、75、90 min，提取功率分別為320、400、480、560、640W，乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為50%、60%、70%、80%、90%，液料比分比為15∶1、30 ∶1、45 ∶1、60 ∶1、75 ∶1、90 ∶1（mL/g）。其中固定提取條件為：提取時(shí)間45 min、提取功率480 W、乙醇體積分?jǐn)?shù)70%以及液料比45∶1（mL/g），每克香水檸檬果皮的提取液定容至100 mL后檢測吸光度值。

1.3.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取提取時(shí)間、提取功率、乙醇體積分?jǐn)?shù)和液料比4個(gè)因素，采用Box-Behenken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，進(jìn)行四因素三水平試驗(yàn)，試驗(yàn)因素水平表如表1所示。

表1 試驗(yàn)因素水平表Table 1 Experimental factors and levels

1.3.5 香水檸檬果皮綠色素穩(wěn)定性研究

按優(yōu)化的工藝提取香水檸檬果皮綠色素，每克香水檸檬果皮綠色素提取液定容至60 mL。按照下列步驟檢測不同條件對綠色素穩(wěn)定性的影響。

1.3.5.1 溫度對香水檸檬果皮綠色素穩(wěn)定性的影響

精確吸取香水檸檬果皮綠色素粗提取液5 mL分別在 4、20、40、60、80、100 ℃條件下處理 0、30、60、90、120、150、180 min，觀察香水檸檬果皮綠色素色澤變化，并在波長415 nm處測定吸光度值。

1.3.5.2 光照對香水檸檬果皮綠色素穩(wěn)定性的影響

精確吸取香水檸檬果皮綠色素粗提取液5 mL，分別置于避光、室內(nèi)自然光和日光直射處放置0、2、4、6、8、10、12、14 d，觀察香水檸檬果皮綠色素色澤變化，并在波長415 nm處測定吸光度值。

1.3.5.3 常用食品添加劑對香水檸檬果皮綠色素穩(wěn)定性的影響

精確吸取香水檸檬果皮綠色素粗提取液5 mL，分別加入0.05 mol/L山梨酸、可溶性淀粉、檸檬酸、葡萄糖、β-環(huán)胡精、VC、氯化鈉和聚乙二醇溶液各5 mL，經(jīng)漩渦混勻器搖勻后，室溫處理60 min，觀察香水檸檬果皮綠色素色澤變化，并在波長415 nm處測定吸光度值，以等體積含有食品添加劑的溶液在0 min時(shí)測定的吸光度為對照。

1.3.5.4 金屬離子對香水檸檬果皮綠色素穩(wěn)定性的影響

精確吸取香水檸檬果皮綠色素粗提取液5 mL，分別加入 0.05 mol/L Mg2+、K+、Ti4+、Al3+、Fe2+、Fe3+、Ag+和Na+溶液各5 mL，經(jīng)漩渦混勻器搖勻后，室溫處理10 h，觀察香水檸檬果皮綠色素色澤變化，并在波長415 nm處測定吸光度值，以等體積含有金屬離子的溶液在0min時(shí)測定的吸光度為對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 香水檸檬果皮綠色素最大吸收波長的選擇

香水檸檬果皮綠色素吸收光譜見圖1。

圖1 香水檸檬果皮綠色素吸收光譜Fig.1 Absorption spectrum of green pigment from Citrus Limon（L.Burm.F.）peel

從圖1可知，香水檸檬果皮綠色素在415 nm和666 nm處均有明顯吸收峰，其中在415 nm處峰值最高，故選415 nm為測定香水檸檬果皮綠色素吸光度值的檢測波長。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 提取時(shí)間對香水檸檬果皮綠色素提取的影響

提取時(shí)間對香水檸檬果皮綠色素提取效果的影響見圖2。

圖2 提取時(shí)間對香水檸檬果皮綠色素提取效果的影響Fig.2 Effect of extraction time on extraction efficiency of green pigment from Citrus Limon（L.Burm.F.）peel

由圖2可知，隨著提取時(shí)間的延長，綠色素溶液吸光度值不斷增大，只是因?yàn)槌曁幚淼臅r(shí)間延長、細(xì)胞破碎的程度增大后，細(xì)胞內(nèi)部的綠色素物質(zhì)開始向外擴(kuò)散，使溶劑中的綠色素含量迅速上升。當(dāng)提取時(shí)間為60 min時(shí)，色素溶液吸光度值達(dá)到最大值。當(dāng)提取時(shí)間繼續(xù)延長時(shí)，綠色素溶液吸光度值反而下降，這表明60 min時(shí)香水檸檬果皮綠色素已提取完全，而隨著綠色素在空氣中暴露的時(shí)間延長，導(dǎo)致部分綠色素降解氧化，造成綠色素含量下降。而且提取時(shí)間過長，乙醇容易揮發(fā)，溶劑與原料的接觸也不十分充分，綠色素不能完全溶出，提取率相應(yīng)降低。因此選取60 min為最佳提取時(shí)間進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2.2 提取功率對香水檸檬果皮綠色素提取的影響

提取功率對香水檸檬果皮綠色素提取效果的影響見圖3。

圖3 提取功率對香水檸檬果皮綠色素提取效果的影響Fig.3 Effect of extraction power on extraction efficiency of green pigment from Citrus Limon（L.Burm.F.）peel

由圖3可知，隨著提取功率的增大，綠色素吸光度值呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，并在提取功率為560 W時(shí)達(dá)到最大。當(dāng)提取功率超過560 W時(shí)，綠色素吸光度值反而降低。增大超聲波功率強(qiáng)化傳質(zhì)同時(shí)使細(xì)胞的破碎程度增加，從而有利于綠色素的提取[12-13]。但當(dāng)超聲波功率過大時(shí)，會引起綠色素結(jié)構(gòu)被破壞或降解。因此，選取560 W為最佳提取功率進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對香水檸檬果皮綠色素提取的影響

乙醇體積分?jǐn)?shù)對香水檸檬果皮綠色素提取效果的影響見圖4。

圖4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對香水檸檬果皮綠色素提取效果的影響Fig.4 Effect of ethanol concentration on extraction efficiency of green pigment from Citrus Limon（L.Burm.F.）peel

由圖4可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高，綠色素溶液吸光度值逐漸升高，但在70%之后逐漸下降。這可能與綠色素中葉綠素的親水基團(tuán)有關(guān)。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到70%時(shí)，親水基團(tuán)基本與水結(jié)合并充分溶解于水中。當(dāng)乙醇中的水分含量越低，綠色素分子的親水基團(tuán)不易與蛋白質(zhì)分離，不利于綠色素從類囊體膜中游離出來，親水基團(tuán)與水結(jié)合的能力相應(yīng)降低，提取效果隨之降低[14]。因此，選取70%的乙醇體積分?jǐn)?shù)為最佳液料比進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2.4 液料比對香水檸檬果皮綠色素提取的影響

液料比對香水檸檬果皮綠色素提取效果的影響見圖5。

圖5 液料比對香水檸檬果皮綠色素提取效果的影響Fig.5 Effect of liquid-solid ratio on extraction efficiency of green pigment from Citrus Limon（L.Burm.F.）peel

由圖5可知，隨著液料比增加，乙醇滲透細(xì)胞膜的效果越明顯，超聲波對細(xì)胞的作用越強(qiáng)，利于綠色素從細(xì)胞中分離進(jìn)入提取溶劑中，因而提取效果也越好，綠色素溶液吸光度值越高。當(dāng)液料比為45∶1（mL/g）時(shí)，綠色素萃取的比較完全，當(dāng)液料比繼續(xù)增加后，綠色素提取效果逐漸降低，吸光度值逐漸下降。而且，液料比太大，增加了濃縮操作的困難，浪費(fèi)能源[15]。綜合考慮，為節(jié)約生產(chǎn)成本，選取 45∶1（mL/g）為最佳液料比進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.3 香水檸檬果皮綠色素提取條件的優(yōu)化

由圖2～圖5可知，在不同提取時(shí)間、提取功率、乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比下，香水檸檬果皮綠色素的提取效果均存在差異，故而在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Benhken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選取提取時(shí)間A、提取功率B、乙醇體積分?jǐn)?shù)C、液料比D作為4個(gè)因素，并以綠色素提取液吸光度作為響應(yīng)值，試驗(yàn)方案及結(jié)果見表2。

對數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，獲得回歸方程：Y=0.44+0.01A+0.03B+0.019C+0.017D+0.008 5AB+0.02AC-0.000 25AD+0.007 5BC-0.028BD-0.11CD-0.014A2-0.029B2-0.017C2-0.012D2。為驗(yàn)證方程的有效性，對上述結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，方差分析結(jié)果見表3。響應(yīng)值的可信度分析的模型相關(guān)系數(shù)R2=0.908 6，接近于1，表示模型相關(guān)度很好。校正系數(shù)R2Adj=0.817 2，該模型能解釋81.72%響應(yīng)值的變化，因而該模型擬合程度比較好。變異系數(shù)C.V.=3.75%，說明該數(shù)學(xué)模型的置信度較好，可以用此模型對超聲提取香水檸檬果皮綠色素進(jìn)行分析和預(yù)測。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Experimental design and results for Box-Behnken analysis

表3 回歸方程方差分析Table 3 Variance analysis of the regression equation

續(xù)表3 回歸方程方差分析Continue table 3 Variance analysis of the regression equation

由表3可知，該模型的F值為9.940 921，P值＜0.000 1，判斷該模型是極顯著的；響應(yīng)值的模型失擬項(xiàng)P=0.352 5，說明模型失擬項(xiàng)不顯著。綜上所述，該模型對綠色素溶液吸光度值的擬合程度好，試驗(yàn)誤差小。該試驗(yàn)中4個(gè)單因素對綠色素提取效果的影響排序?yàn)樘崛」β剩疽掖俭w積分?jǐn)?shù)＞液料比＞提取時(shí)間。模型方程回歸系數(shù)和顯著性檢驗(yàn)結(jié)果表明，模型一次項(xiàng)B、C、D 極顯著，A 顯著；二次項(xiàng) B2極顯著，A2、C2顯著，D2不顯著；交互項(xiàng)BD極顯著，AC顯著，AB、AD、BC、CD不顯著。因此各個(gè)具體試驗(yàn)因素與響應(yīng)值都不是線性關(guān)系。

提取時(shí)間、提取功率、乙醇體積分?jǐn)?shù)和液料比的交互作用對香水檸檬果皮綠色素提取的影響響應(yīng)面圖見圖6。

圖6 提取時(shí)間、提取功率、乙醇體積分?jǐn)?shù)和液料比的交互作用對香水檸檬果皮綠色素提取的影響響應(yīng)面圖Fig.6 The response surface figure of effects of extraction time，extraction power，ethanol concentration，and liquid-solid ratio on the extraction of green pigment from Citrus Limon（L.Burm.F.）peel

圖6a表示提取功率和提取時(shí)間對綠色素提取的影響，隨著提取功率和提取時(shí)間的上升，綠色素吸光度呈先增加后下降的趨勢，但交互作用不大。圖6b表示乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取時(shí)間交互作用對綠色素提取的影響，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取時(shí)間的增加，綠色素吸光度呈先增加后降低的趨勢，兩者交互作用顯著。隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，綠色素吸光度值上升，但乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到一定比例后，綠色素吸光度值變化不大。這可能與綠色素本身特性有關(guān)。乙醇體積分?jǐn)?shù)過高，可能使極性較大的物質(zhì)無法溶出，因而綠色素的吸光度值下降。延長提取時(shí)間，在一定范圍內(nèi)可以得到較高的綠色素吸光度值。圖6c表示液料比和提取時(shí)間交互作用對綠色素提取的影響，隨著液料比和提取時(shí)間的增加，綠色素吸光度值變化不大，呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，但其交互作用不顯著。圖6d表示乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取功率交互作用對綠色素提取的影響，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取功率的增加，綠色素吸光度值先增加后降低，但其交互作用不顯著。乙醇體積分?jǐn)?shù)對綠色素提取的影響高于提取功率對綠色素提取的影響。圖6e表示液料比和提取功率交互作用對綠色素提取的影響，隨著液料比和提取功率的增加，綠色素吸光度值先升高后降低，且交互作用非常顯著。增加液料比和提取功率，在一定范圍內(nèi)可得到較高的綠色素吸光度值。圖6f表示液料比和乙醇體積分?jǐn)?shù)交互作用對綠色素的影響，隨著液料比和乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，綠色素吸光度值先逐漸升高后逐漸降低，但交互作用不顯著。

以提取時(shí)間、提取功率、乙醇體積分?jǐn)?shù)和液料比為考察因素，以吸光度值為響應(yīng)值，經(jīng)Desigh Expert 8.0.6軟件分析可得最佳工藝條件為提取時(shí)間75 min，提取功率639.53 W，乙醇體積分?jǐn)?shù)80%，液料比31.17∶1（mL/g），相應(yīng)的響應(yīng)面二次模型預(yù)測綠色素吸光度最大值為0.466。為了試驗(yàn)操作方便，本研究選取提取功率640 W和液料比31∶1（mL/g）為試驗(yàn)條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。在最佳條件下重復(fù)3次試驗(yàn)，得到果皮中綠色素的吸光度均值為0.459，與回歸方程預(yù)測的數(shù)值相似，說明香水檸檬果皮綠色素的提取工藝準(zhǔn)確可行，在此條件下提取綠色素進(jìn)行以下試驗(yàn)。

2.4 香水檸檬果皮綠色素穩(wěn)定性結(jié)果分析

2.4.1 溫度對香水檸檬果皮綠色素穩(wěn)定性的影響

溫度對香水檸檬果皮綠色素穩(wěn)定性的影響見表4。

表4 溫度對香水檸檬果皮綠色素穩(wěn)定性的影響Table 4 Effect of temperature on stability of green pigment from Citrus Limon（L.Burm.F.）peel

由表4可知，4℃～60℃范圍內(nèi)處理0 min～180 min，提取的綠色素吸光度值逐漸降低，顏色由黃綠色變?yōu)榈S色，綠色素提取后處理的時(shí)間越長，降解失活的越多，因此顏色逐漸變淡。而100℃處理后，隨著處理時(shí)間的延長，綠色素吸光度值逐漸升高，這可能與高溫狀態(tài)下，溶劑不斷蒸發(fā)，而綠色素出現(xiàn)濃縮有關(guān)。結(jié)果表明，提取的綠色素可在常溫條件下保存。

2.4.2 光照對香水檸檬果皮綠色素穩(wěn)定性的影響

光照對香水檸檬果皮綠色素穩(wěn)定性的影響見表5。

表5 光照對香水檸檬果皮綠色素穩(wěn)定性的影響Table 5 Effect of light on stability of green pigment from Citrus Limon（L.Burm.F.）peel

由表5可知，隨著室內(nèi)自然光和日光照射時(shí)間的延長，綠色素的吸光度值逐漸降低，顏色由黃綠色逐漸變成淡黃色。照射處理2天時(shí)，日光照射后綠色素的吸光度值顯著低于室內(nèi)自然光照射后綠色素的吸光度值。光照處理14天后，避光處理的綠色素吸光度值略有降低，但降低的不十分明顯，而室內(nèi)自然光照射和日光照射處理的綠色素吸光度值降低顯著。結(jié)果表明綠色素在避光條件下保存，可避免降解，而在接觸日光的條件下，綠色素容易降解，不利于保存。

2.4.3 常用食品添加劑對香水檸檬果皮綠色素穩(wěn)定性的影響

常用食品添加劑對香水檸檬果皮綠色素穩(wěn)定性的影響見表6。

表6 常用食品添加劑對香水檸檬果皮綠色素穩(wěn)定性的影響Table 6 Effect of food additives on stability of green pigment from Citrus Limon（L.Burm.F.）peel

由表6可知，提取的綠色素中加入不同的食品添加劑處理后，綠色素的吸光度值幾乎無變化，顏色也為黃綠色。說明食品添加劑對提取的綠色素影響不大。

2.4.4 金屬離子對香水檸檬果皮綠色素穩(wěn)定性的影響

金屬離子對香水檸檬果皮綠色素穩(wěn)定性的影響見表7。

表7 金屬離子對香水檸檬果皮綠色素穩(wěn)定性的影響Table 7 Effect of metal ions on stability of green pigment from Citrus Limon（L.Burm.F.）peel

由表7可知，Mg2+和Ag+使綠色素由黃綠色變成淡黃色，Al3+使提取的綠色素由黃綠色變?yōu)榈S色沉淀，吸光度值變化較大。Fe2+和Fe3+使綠色素由黃綠色變?yōu)樯铧S色。K+、Ti4+和Na+對綠色素的穩(wěn)定性無影響。

3 結(jié)論

研究超聲輔助提取香水檸檬果皮中綠色素的工藝，結(jié)果表明以乙醇為提取溶劑，提取時(shí)間75 min，提取功率 640 W，乙醇體積分?jǐn)?shù) 80%，液料比 31∶1（mL/g）條件下，提取的綠色素含量最高，效果最佳。在此條件下，提取的綠色素吸光度均值為0.459。穩(wěn)定性試驗(yàn)表明，保存溫度對綠色素由一定的影響，溫度越高，綠色素的穩(wěn)定性越差。光照條件下會降低綠色素的穩(wěn)定性，避光條件有利于綠色素的保存。Al3+、Fe2+和Fe3+對綠色素的穩(wěn)定性影響較大。