楊華婷，李 輝，李興才，趙忠海，師新彩

（貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，高原山地動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽 550025）

肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2（Myocyte Enhancer Factor 2，MEF2）屬于轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子MADS-Box 家族，是一種特定的轉(zhuǎn)錄因子。在脊椎動(dòng)物中，MEF2基因家族由4 個(gè)基因組成，包括MEF2A、MEF2B、MEF2C和MEF2D，它們?cè)诩∪馍伞⑸窠?jīng)系統(tǒng)發(fā)育和分化、肝纖維化方面均有重要作用[1-2]。MEF2 是廣泛存在于肌肉細(xì)胞的DNA 結(jié)合活性因子，可與大多數(shù)肌肉發(fā)育相關(guān)基因的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子結(jié)合，激活其活性，對(duì)肌肉發(fā)生具有重要作用[3]。Brand[4]研究發(fā)現(xiàn)，MEF2 能和肌肉肌酸酶（Muscle Creatine Kinase，MCK）基因啟動(dòng)子中A/T DNA 序列特異性結(jié)合，增強(qiáng)MCK 的轉(zhuǎn)錄活性。MEF2 作為一種重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，其特定的結(jié)構(gòu)可使它與其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用。溫見燕等[5]研究發(fā)現(xiàn)，MEF2C 可以通過作用于DOK5 啟動(dòng)子區(qū)的MEF2 結(jié)合位點(diǎn)，調(diào)節(jié)DOK5 的轉(zhuǎn)錄活性；王煒[6]報(bào)道，MEF2C 與IPO13 啟動(dòng)子上E-BOX 元件結(jié)合之后，促進(jìn)了IPO13 的表達(dá)。臨床上MEF2C 已成為治療人類先天性心臟病[7]、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤[8]以及心血管發(fā)育異常[9-10]等疾病的靶向基因。畜禽中相關(guān)研究報(bào)道，MEF2C基因中新發(fā)現(xiàn)的多態(tài)性（RFLP/Bsr I）可能成為牛胴體和肉質(zhì)性狀的潛在遺傳標(biāo)記[11]，MEF2C基因多態(tài)位點(diǎn)可以作為黃牛生長早期輔助標(biāo)記選擇的分子標(biāo)記[12]。程波[13]確定了MEF2C基因與山羊臂三頭肌肌纖維直徑和密度分別呈極顯著負(fù)相關(guān)和顯著正相關(guān)。這些研究主要集中在MEF2C基因多態(tài)性、表達(dá)差異及關(guān)聯(lián)性分析等方面。

近年來，對(duì)特定基因的啟動(dòng)子研究層出不窮，但關(guān)于MEF2基因家族的啟動(dòng)子研究報(bào)道較少，且關(guān)于鴨MEF2C基因的研究報(bào)道鮮見。因此，本實(shí)驗(yàn)以興義鴨作為研究對(duì)象，直接測(cè)序結(jié)合DNAStar 篩選啟動(dòng)子區(qū)SNPs 位點(diǎn)；生物信息學(xué)在線軟件預(yù)測(cè)該序列轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)和核心啟動(dòng)子區(qū)，分析其SNPs 位點(diǎn)對(duì)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的影響，并對(duì)SNPs 位點(diǎn)與屠宰性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析，以期為MEF2C基因功能的深入研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 隨機(jī)選取來自貴州省興義市落火坪村52只55 日齡的飼養(yǎng)環(huán)境一致、健康的興義鴨作為實(shí)驗(yàn)材料。根據(jù)《家禽生產(chǎn)性能名詞術(shù)語和度量統(tǒng)計(jì)方法》（NY/T 823-2004）進(jìn)行屠宰測(cè)定，其余樣品由冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室，根據(jù)組織基因組DNA 提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]說明書步驟分別提取52 只興義鴨組織DNA，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA 效果，利用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA 濃度，-20℃保存?zhèn)溆?。DNA 提取試劑盒、DL2000 Marker、Goldview Ⅰ型核酸染料等主要試劑購自天根生化科技（北京）。

1.2 引物設(shè)計(jì)及PCR 擴(kuò)增 根據(jù)GenBank 上已公布的鴨MEF2C基因序列（登錄號(hào)：NW_004677103.1），利用Primer3.0 設(shè)計(jì)1 對(duì)特異性引物擴(kuò)增MEF2C基因啟動(dòng)子區(qū)域。上游引物：5'-TGACACATTCTGCGTTACGG-3'，下游引物：5'-AGCCTCCTTCTTCAGCACTT-3'，擴(kuò)增片段長度為1 780 bp，退火溫度62℃。以DNA 樣品為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 擴(kuò)增為30 μL 體系：2×Taq PCR Master Mix（With Dye）15 μL，上、下游引物各2 μL、基 因 組DNA（100 ng/μL）2 μL、ddH2O 9 μL。PCR 反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性45 s，62℃退火35 s，72℃延伸55 s，31 個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR 產(chǎn)物，合格樣送往英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司進(jìn)行PCR 直接測(cè)序。

1.3 生物信息學(xué)分析

1.3.1 鴨MEF2C基因核心啟動(dòng)子預(yù)測(cè) 運(yùn)用3 種生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)鴨MEF2C基因核心啟動(dòng)子區(qū)域，其在線軟件分別為Promoter Scan：https://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/proscan/；Neural Network Promoter Prediction：http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html；Promoter 2.0：http://www.cbs.dtu.dk/services/Promoter/。

1.3.2MEF2C基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè) 運(yùn)用生物信息學(xué)在線軟件預(yù)測(cè)MEF2C基因啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)以及可能結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子，3 種在線軟件分別是Alibaba2.1：http://gene-regulation.com/pub/programs/alibaba2/index.html；JASPAR：http://jaspar.binf.ku.dk/Tfsitescan：http://www.ifti.org/。

1.4 SNPs 篩選及關(guān)聯(lián)性分析 擴(kuò)增好的PCR 產(chǎn)物送往英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序，利用DNASTAR 軟件等對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接比對(duì)，篩選SNPs 位點(diǎn)。運(yùn)用SPSS 18.0 軟件進(jìn)行基因多態(tài)性與屠宰性狀的關(guān)聯(lián)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因PCR 擴(kuò)增結(jié)果 1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)MEF2C基因啟動(dòng)子片段，經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)觀察可知，PCR 產(chǎn)物擴(kuò)增條帶特異性良好，明亮清晰、單一無雜帶，且與預(yù)期目的片段大小相符（圖1），可用于下一步分析。

圖1 興義鴨MEF2C 基因啟動(dòng)子區(qū)PCR 結(jié)果

2.2 序列分析 Megalign、SeqMan 程序BLAST 分析發(fā)現(xiàn)，興義鴨MEF2C基因啟動(dòng)子區(qū)存在8 個(gè)SNPs 位點(diǎn)，分別為T-190A、A-232G、A-285G、A-617T、G-1420A、A-1437C、T-1504G、A-1524G（圖2）。

圖2 8 個(gè)SNPs 位點(diǎn)測(cè)序峰圖

2.3MEF2C基因核心啟動(dòng)子預(yù)測(cè)結(jié)果 生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)MEF2C基因核心啟動(dòng)子區(qū)域，結(jié)果表明，MEF2C基因啟動(dòng)子具備顯著的核心啟動(dòng)子識(shí)別特征。各在線軟件預(yù)測(cè)核心啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)果見表1。3 種在線軟件均預(yù)測(cè)得到MEF2C基因核心啟動(dòng)子區(qū)，Promoter 2.0 軟件在-800 bp 處預(yù)測(cè)出1 個(gè)極大可能性的核心啟動(dòng)子區(qū)域；Neural Network Promoter Prediction 軟件在-1 229～-1 279 bp 范圍內(nèi)也預(yù)測(cè)出了1 個(gè)高評(píng)分的核心啟動(dòng)子區(qū)域。大部分SNPs 位于核心啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)，由此推測(cè)這些突變位點(diǎn)可能影響著MEF2C基因的表達(dá)調(diào)控。

表1 核心啟動(dòng)子區(qū)分析結(jié)果

2.4MEF2C基因SNPs 突變對(duì)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的影響不同在線軟件分析預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，MEF2C基因啟動(dòng)子區(qū)突變位點(diǎn)造成重要的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生明顯變化（表2）。通過Alibaba2.1 在線軟件預(yù)測(cè)得到MEF2C基因啟動(dòng)子區(qū)堿基突變前后轉(zhuǎn)錄因子的變化結(jié)果（表3），-190處發(fā)生T＞A 突變，可能導(dǎo)致原來的HOXA4、GCN4 2個(gè)轉(zhuǎn)錄因子消失而重新生成了新的轉(zhuǎn)錄因子Oct-1 的結(jié)合位點(diǎn)；-232 位點(diǎn)（A＞G）可能引起原有的Pit-1a 轉(zhuǎn)錄因子消失；在-1420 位點(diǎn)（G＞A），突變可能使原來的IRF-1 轉(zhuǎn)錄因子改變成了ICSBP。因此，這些SNP位點(diǎn)導(dǎo)致一部分原有的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的消失和新轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的生成，很有可能對(duì)MEF2C基因表達(dá)產(chǎn)生重要影響。

表2 不同軟件對(duì)MEF2C 基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的預(yù)測(cè)結(jié)果

2.5MEF2C基因啟動(dòng)子SNPs 與屠宰性狀的關(guān)聯(lián)性分析結(jié)合Chromas、SeqMan 2 種軟件分析發(fā)現(xiàn)，有6 個(gè)多態(tài)位點(diǎn)僅檢測(cè)出1 種基因型，分別是A-232G（GG）、A-285G（GG）、A-617T（TT）、A-1437C（CC）、T-1504G（TG）、A-1524G（AG），該6 個(gè)突變位點(diǎn)不具備基因多態(tài)性，所以不列入分析討論。而另外的T-190A、G-1420A 位點(diǎn)在本實(shí)驗(yàn)群體中存在TT、TA（GA、AA）2 種基因型，2 個(gè)多態(tài)位點(diǎn)的基因型頻率、等位基因頻率、雜合度、有效等位基因數(shù)及多態(tài)信息含量見表4。T 等位基因?yàn)門-190A 位點(diǎn)優(yōu)勢(shì)等位基因，該等位基因頻率高達(dá)0.817 3；同時(shí)經(jīng)χ2適合性檢驗(yàn)得到2 個(gè)多態(tài)位點(diǎn)符合Hardy-Weinberg 平衡（P＞0.05）。T 檢驗(yàn)分析T-190A、G-1420A2 個(gè)位點(diǎn)與屠宰性狀的相關(guān)性，結(jié)果見表5。T-190A 位點(diǎn)對(duì)活重的影響達(dá)到顯著水平（P＜0.05），對(duì)屠體重（P=0.096）、半凈膛（P=0.095）、半凈膛率（P=0.076）3 個(gè)屠宰指標(biāo)的影響接近顯著水平，而對(duì)其他屠宰性狀無顯著影響。G-1420A 位點(diǎn)對(duì)腿肌率的影響達(dá)到顯著水平（P＜0.05）。

表3 MEF2C 基因啟動(dòng)子區(qū)SNP 突變前后轉(zhuǎn)錄因子變化結(jié)果

表4 MEF2C 基因啟動(dòng)子多態(tài)位點(diǎn)的遺傳特性

3 討 論

MEF2C基因?qū)儆贛EF2基因家族成員，廣泛存在許多細(xì)胞和組織中，對(duì)細(xì)胞分化、肌肉發(fā)育具有重要的調(diào)控作用。啟動(dòng)子是位于基因中轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游的特定DNA 片段，是基因中不可缺少的部分，在基因的表達(dá)過程中，轉(zhuǎn)錄起始階段最為關(guān)鍵，這一階段主要發(fā)生RNA 聚合酶與啟動(dòng)子的相互作用，啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)改變會(huì)影響其與RNA 聚合酶的親和力、啟動(dòng)子序列的變異，直接影響基因的表達(dá)水平。王帥[14]報(bào)道，MEF2C基因啟動(dòng)子的低頻突變可作為預(yù)防和治療心肌梗死的新靶點(diǎn)；邱進(jìn)等[15]研究發(fā)現(xiàn)，MEF2C基因啟動(dòng)區(qū)SNPs位點(diǎn)大大提高其轉(zhuǎn)錄活性而使得人類先心病發(fā)病率上升；Materna 等[9]研究發(fā)現(xiàn)，MEF2C 對(duì)血管發(fā)育的需求僅次于心臟的需求，小鼠在敲除MEF2C基因之后出現(xiàn)心功能不全而導(dǎo)致血管重構(gòu)失??；Jin 等[16]研究表明，生肌決定因子MyoD 參與MEF2C基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，突變或缺失都會(huì)影響其轉(zhuǎn)錄活性。目前，關(guān)于畜禽類MEF2C基因啟動(dòng)子相關(guān)報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)在興義鴨MEF2C基因啟動(dòng)子區(qū)鑒定得到8 個(gè)SNPs，對(duì)興義鴨屠宰性狀均產(chǎn)生影響。不同軟件預(yù)測(cè)核心啟動(dòng)子區(qū)結(jié)果有差異。本研究綜合多個(gè)軟件分析，大大提高了預(yù)測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。本實(shí)驗(yàn)得到的突變位點(diǎn)處于核心啟動(dòng)子區(qū)域，其突變可能在調(diào)控MEF2C基因表達(dá)中發(fā)揮重要作用，T-190A 可能消除了HOXA4 和GCN4 轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)，新產(chǎn)生Oct-1 轉(zhuǎn)錄因子。HOXA4 轉(zhuǎn)錄因子是HOX基因家族成員之一，對(duì)細(xì)胞分化、增殖及信號(hào)傳導(dǎo)等產(chǎn)生重要影響[17]，GCN4 轉(zhuǎn)錄因子具有特異性識(shí)別DNA 序列的功能，從而影響許多基因的轉(zhuǎn)錄[18]，新生的Oct-1 既具有轉(zhuǎn)錄抑制作用，又具有激活作用，Oct-1 本身直接與啟動(dòng)子結(jié)合，又可以結(jié)合其他轉(zhuǎn)錄因子作用在啟動(dòng)子上來調(diào)控基因的表達(dá)[19]。T-190A、G-1420A 對(duì)附近的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)影響顯著，說明2個(gè)SNPs 位點(diǎn)可直接影響轉(zhuǎn)錄因子與調(diào)控序列的結(jié)合。

表5 T-190A、G-1420A 與興義鴨屠宰性狀的關(guān)聯(lián)分析

本研究發(fā)現(xiàn)，T-190A 突變位點(diǎn)對(duì)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)影響較大，TT 基因型頻率遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于TA 基因型頻率，T 為該突變位點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)等位基因。關(guān)聯(lián)性分析發(fā)現(xiàn)，得到T-190A 與活重有顯著關(guān)聯(lián)，而與屠體重、半凈膛、半凈膛率的關(guān)聯(lián)性接近顯著，G-1420A 與腿肌率的關(guān)聯(lián)性達(dá)到顯著水平，與其他性狀未達(dá)到顯著水平，可能是實(shí)驗(yàn)群體樣本數(shù)少，需增加樣本數(shù)進(jìn)行更深入的研究。T-190A、G-1420A 突變可能是重要的功能性SNPs 位點(diǎn)，MEF2C基因SNPs 研究結(jié)果為進(jìn)一步分析MEF2C基因啟動(dòng)子功能提供理論基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

興義鴨MEF2C啟動(dòng)子序列測(cè)定共檢測(cè)到8 個(gè)SNPs，生物信息學(xué)預(yù)測(cè)得到MEF2C基因核心啟動(dòng)子區(qū)域，其中部分SNPs 位點(diǎn)可能導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子以及轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的改變，從而導(dǎo)致基因表達(dá)的改變。T-190A 和T-1420A2 個(gè)突變位點(diǎn)可能是重要的功能性突變位點(diǎn)，對(duì)MEF2C基因表達(dá)的影響需要加大樣本量來作進(jìn)一步研究。本研究對(duì)MEF2C基因啟動(dòng)子區(qū)SNP 的結(jié)果為進(jìn)一步分析MEF2C基因啟動(dòng)子功能和闡明MEF2C基因表達(dá)調(diào)控奠定基礎(chǔ)。