靳 健，楊 荔，魏宗友，吳圣龍，包文斌*

（1.揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009；2.江蘇省太倉市畜牧獸醫(yī)站，江蘇太倉 215400）

殺菌/通透性增強(qiáng)蛋白（Bactericidal/Permeability-Increasing Protein，BPI）作為一種重要的抗菌蛋白[1]，具備殺滅革蘭陰性菌、中和內(nèi)毒素以及免疫調(diào)節(jié)等重要生物學(xué)功能，尤其是其對細(xì)菌不易產(chǎn)生耐藥性，具有替代抗生素的應(yīng)用前景[2]。細(xì)菌性和病毒性腹瀉是導(dǎo)致初生到斷奶階段仔豬死亡的重要接觸性傳染病，其中大腸桿菌是引起仔豬細(xì)菌性腹瀉的主要病原菌之一[3]。雖然當(dāng)前飼養(yǎng)管理水平的提高和疫苗的使用在一定程度上減少了仔豬細(xì)菌性腹瀉的發(fā)生，但從遺傳本質(zhì)上提高仔豬抗腹瀉能力，才是當(dāng)代育種追求的目標(biāo)。在臨床中發(fā)現(xiàn)在斷奶后仔豬細(xì)菌性腹瀉的發(fā)病率呈現(xiàn)十分明顯的下降趨勢，特別是到了成年以后，該病的發(fā)病率幾乎為零。目前已有研究表明，BPI基因表達(dá)水平可能對斷奶仔豬抵抗大腸桿菌 F18 菌株起到重要的調(diào)控作用[4-5]。

本課題組前期通過分析蘇太斷奶仔豬抗大腸桿菌 F18菌株侵染抗性組和易感組之間小腸組織BPI基因的差異表達(dá)，推斷BPI基因在腸道組織中的高度表達(dá)有利于斷奶仔豬對大腸桿菌F18 菌株侵染的抵抗[6]。Zhu 等[7]研究發(fā)現(xiàn)，在35 日齡時(shí)，蘇太豬空腸和十二指腸中BPI基因表達(dá)水平有顯著差異。本研究以中國優(yōu)良地方品種梅山豬為實(shí)驗(yàn)對象，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測初生、斷奶和成年（性成熟和體成熟）等4 個(gè)重要發(fā)育時(shí)期（1、35、134、158 日齡）的12 個(gè)組織中BPI基因的mRNA表達(dá)水平，比較分析BPI基因在各組織中的表達(dá)差異以及不同發(fā)育時(shí)期同一組織中BPI基因的表達(dá)規(guī)律，為進(jìn)一步研究BPI基因的功能和調(diào)控機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 本實(shí)驗(yàn)所用梅山豬來自江蘇省太倉市梅山豬國家級保種場，分別從5 個(gè)家系中篩選出毛色、體形和體重等外貌表型基本一致的健康全同胞個(gè)體，保持飼養(yǎng)條件一致且飼養(yǎng)管理良好。分別在初生、斷奶、性成熟、體成熟4 個(gè)重要發(fā)育時(shí)期（即1、35、134、158日齡）從5 個(gè)不同家系中各隨機(jī)宰殺1 頭，即每個(gè)發(fā)育時(shí)期各5 頭，取心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胃、肌肉、胸腺、淋巴結(jié)、十二指腸、空腸和回腸共12 個(gè)組織樣品，現(xiàn)場隨即液氮保存，帶回實(shí)驗(yàn)室備用。

1.2 引物設(shè)計(jì)及合成 參照GenBank 數(shù)據(jù)庫中BPI基因序列（登錄號：NM_001159307），利用Primer Premier 5.0軟件，遵照引物跨外顯子的原則設(shè)計(jì)BPI基因qPCR 引物；分別以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase，GAPDH）和β肌動(dòng)蛋白（β-actin，ACTB）基因作為內(nèi)參基因，引物合成交由生工生物工程（上海）公司完成。引物信息見表1。

1.3 總RNA 提取以及cDNA 合成 利用Trizol（諾唯贊生物科技有限公司，南京）法提取不同發(fā)育時(shí)期梅山豬各組織總RNA，提取步驟嚴(yán)格按照Trizol Reagent說明書操作，并以1% 甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 完整性，使用ND-1000 核酸/ 蛋白濃度測定儀測定濃度與純度，產(chǎn)物-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（諾唯贊生物科技有限公司，南京）合成cDNA。反應(yīng)體系10 μL：5×qRT SuperMix II 2 μL，總RNA 500 ng，RNase free ddH2O 補(bǔ)足至10 μL。反應(yīng)程序?yàn)?5℃ 10 min，50℃ 30 min，85℃ 5 min，4℃保存。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 分析 使用qPCR 試劑盒（諾唯贊生物科技有限公司，南京）進(jìn)行反應(yīng)。20 μL 反應(yīng)體系：cDNA 2.0 μL，正、反向引物（10 μmol/L）各0.4 μL，（2×）AceQ qPCR SYBR Green Master Mix 10 μL，（50×）ROX Reference Dye II 0.4 μL，滅 菌 蒸 餾 水6.8 μL，每個(gè)樣本設(shè)置3 個(gè)重復(fù)組進(jìn)行檢測。qPCR 反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性 5 min；（95℃ 10 s，60℃ 34 s）× 40 個(gè)循環(huán)反應(yīng)。為了檢測有無非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)生，在擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后采集多個(gè)信息點(diǎn)，進(jìn)行熔解曲線分析。反應(yīng)程序：95℃反應(yīng) 15 s，60℃反應(yīng) 1 min；95℃反應(yīng)15 s。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 相對定量結(jié)果采用2-ΔΔCt 法進(jìn)行分析處理[8]，以1 日齡肌肉組織的平均△Ct 為參照。利用SPSS 17.0 軟件對BPI基因在梅山豬不同組織中的表達(dá)差異進(jìn)行比較均值（M）單因素（ANOVA）分析；對BPI在同一組織不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)差異采用一般線性模型（GLM）的Multivariate 統(tǒng)計(jì)方法分析。P＜0.01表示差異極顯著，P＜0.05 代表差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA 的純度與完整性 對提取的組織總RNA 經(jīng)1%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果呈現(xiàn)28 S、18 S、5 S 共3 條清晰明亮的條帶（圖1），A260nm/A280nm在1.8～1.9，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 組織總RNA 凝膠電泳結(jié)果

2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 的擴(kuò)增曲線、熔解曲線 由圖2可知，熔解曲線是單峰曲線，說明反應(yīng)特異性好，無引物二聚體及非特異性擴(kuò)增，可用于進(jìn)一步分析。

2.3BPI基因在梅山豬不同組織中表達(dá)譜分析 由圖3可知，4 個(gè)不同發(fā)育時(shí)期BPI基因在不同組織中均表現(xiàn)出相對一致的組織表達(dá)譜，即BPI基因在心臟、肝臟、脾臟、肌肉和胸腺中的表達(dá)普遍很低，而在腸道組織（十二指腸、空腸和回腸）中的表達(dá)從初生到成年一直都非常高。值得注意的是，在初生和35 日齡斷奶時(shí)，BPI基因在胃中的表達(dá)水平很低，成年階段在胃中高度表達(dá)。

2.4 不同發(fā)育階段梅山豬胃腸道組織表達(dá)差異分析 由圖4 可知，胃中BPI基因的相對表達(dá)量從初生到成年158 日齡逐漸增加，且158 日齡的表達(dá)水平極顯著高于其他日齡，而初生和斷奶階段表達(dá)程度差異不明顯。35日齡斷奶時(shí)，小腸組織中BPI基因的mRNA 表達(dá)水平均極顯著高于其他3 個(gè)日齡。在斷奶后十二指腸、空腸和回腸的相對表達(dá)量逐步下降，134 日齡與158 日齡的表達(dá)水平均極顯著低于35 日齡。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 引物

圖2 不同基因qPCR 產(chǎn)物的熔解曲線和擴(kuò)增曲線

圖3 不同日齡梅山豬各組織中BPI 基因的表達(dá)譜

3 討 論

本研究結(jié)果表明，BPI基因在小腸組織中的表達(dá)量一直保持較高水平，而在心臟、肝臟、脾臟、肌肉和胸腺中表達(dá)水平一直很低或基本不表達(dá)，可見，在梅山豬中BPI基因的表達(dá)也具有十分明顯的組織特異性，與本課題前期研究的蘇太斷奶仔豬BPI基因的組織表達(dá)譜結(jié)果一致[5]。腸道是大腸桿菌等革蘭陰性細(xì)菌感染和定殖的主要部位，BPI基因在4 個(gè)不同發(fā)育時(shí)期梅山豬腸道組織中均具有很高的表達(dá)水平，提示BPI基因在腸道組織中發(fā)揮了重要的生物學(xué)功能，BPI基因?qū)ψ胸i抵御腸道中大腸桿菌等革蘭陰性細(xì)菌的侵染可能具有直接調(diào)控作用。斷奶應(yīng)激是造成仔豬腹瀉的重要因素[9-10]，在35日齡斷奶時(shí)小腸和胃組織中BPI基因的表達(dá)均發(fā)生明顯上調(diào)，提示仔豬可能通過提高消化系統(tǒng)中BPI基因的表達(dá)量來發(fā)揮體內(nèi)細(xì)菌清除等功能。此外，不同組織中BPI基因的表達(dá)水平隨著日齡的增加呈現(xiàn)不一致的變化規(guī)律。其中肌肉中BPI基因相對表達(dá)量在不同發(fā)育時(shí)期均沒有顯著差異，一直處于穩(wěn)定且低水平表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)中，盡管BPI基因在4 個(gè)不同發(fā)育時(shí)期心臟和肝臟中的表達(dá)水平有所差異，但總體表達(dá)水平均較低，該結(jié)果與本課題組前期在其他品種中的研究結(jié)果一致[7]。因此，可以確定在梅山豬整個(gè)生長發(fā)育的不同時(shí)期，心臟、肝臟和肌肉這些組織都不是BPI基因發(fā)揮生物學(xué)功能的主要場所。

BPI基因在豬胃腸道中高表達(dá)是由于大腸桿菌等革蘭陰性菌入侵胃腸道之后發(fā)生還是先天性免疫以抵抗大腸桿菌，這種因果關(guān)系并不清晰。在沒有無特定病原體（Specific Pathogen Free，SPF）豬作為實(shí)驗(yàn)材料的局限下，本實(shí)驗(yàn)在相對無菌環(huán)境下選取初生梅山豬（剛剛出生，仔豬尚未吃初乳），這種情況下仔豬受到外界大腸桿菌等革蘭陰性菌的侵染微乎其微，但值得關(guān)注的是，在斷奶和成年階段腸道和胃中特異性高度表達(dá)的BPI基因，此時(shí)在腸道中依然高度表達(dá)，在胃中表達(dá)量卻很低。消化器官胃組織中BPI基因的相對表達(dá)量在35 日齡斷奶后隨著日齡增加而急劇上升，且158 日齡時(shí)的表達(dá)水平極顯著高于其他日齡。眾所周知，仔豬在斷奶期間自身的免疫系統(tǒng)尚未完全發(fā)育成熟，加之沒有了母乳提供的被動(dòng)免疫，此時(shí)，不成熟的腸道功能面臨自身和被動(dòng)免疫力之間的缺口、斷奶期飼料中微生物的感染以及大量應(yīng)激因子；此外，中性粒細(xì)胞是仔豬抵御感染的第一道防線，但是應(yīng)激狀態(tài)會(huì)縮短豬中性粒細(xì)胞的壽命[11]。上述諸多因素導(dǎo)致斷奶仔豬容易受大腸桿菌等革蘭陰性菌侵染，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)菌性腹瀉等疾病的發(fā)生。有研究表明，相對于外來品種，我國地方豬品種梅山豬具有很強(qiáng)的抗病力[12]，結(jié)合本研究結(jié)果，推斷梅山豬表現(xiàn)出具有較強(qiáng)的腹瀉病抗性可能與BPI基因在其胃腸道中持續(xù)高度表達(dá)具有直接關(guān)系。BPI蛋白是中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、外周血單核細(xì)胞產(chǎn)生的，并非腸道細(xì)胞分泌[13-14]，因而推斷梅山仔豬腸道中BPI基因的高度表達(dá)可能是來自于腸道細(xì)菌侵染部位的中性粒細(xì)胞等所分泌，從而使得仔豬具備較強(qiáng)的抗病能力。

圖4 不同日齡梅山豬胃腸道中BPI 基因的表達(dá)變化趨勢

4 結(jié) 論

本研究揭示了BPI基因在中國地方豬品種梅山豬不同生長發(fā)育時(shí)期的組織表達(dá)規(guī)律，發(fā)現(xiàn)BPI基因在胃腸道組織中特異性高度表達(dá)，提示腸道和胃組織是BPI基因發(fā)揮生物學(xué)功能的主要場所，BPI基因在腸道介導(dǎo)的免疫反應(yīng)過程中可能起到了重要的調(diào)控作用，腸道中BPI基因的高度表達(dá)是仔豬從初生就具有的抵抗大腸桿菌等病原感染的固有免疫的一部分，而在胃中的表達(dá)很可能是其后天為了抵御不斷侵染的大腸桿菌等病原的結(jié)果。本研究結(jié)果為今后利用生物工程手段開展仔豬抵抗細(xì)菌性腹瀉的分子育種提供了一定的理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。