朱彥賓 平措占堆 洛桑頓珠

摘要? ? 本研究利用MHC基因區(qū)域2個遺傳標記（BF1和BM1258）對改則縣的本地牦牛（GZD，16頭）和半野血牦牛（GZY，18頭）進行遺傳多樣性評估。結(jié)果表明，BF1位點的期望雜合度（HE=0.719 96）和多態(tài)信息含量（PIC=0.660 63）以及等位基因數(shù)（NA=11）都要高于BM1258位點（HE=0.567 73、PIC=0.455 53、NA=6），但BF1位點的觀測雜合度（HO=0.303 31）小于BM1258位點（HO=0.664 71）。就群體而言，GZD的期望雜合度為0.672 7±0.093 4（HE±SD）、觀測雜合度為0.556 3±0.089 2（HO±SD）以及PIC為0.585 34，均高于GZY。GZD的近交系數(shù)（FIS=0.178）小于GZY（FIS=0.337）。通過2個微衛(wèi)星位點基因型共構(gòu)建了17種單倍型，GZD中含有12種單倍型，GZY中存在11種單倍型。在單倍型水平上，GZD的期望雜合度（HE）為0.875 9，觀測雜合度為0.800 0±0.103 3，多態(tài)信息含量為0.832 3，也略高于GZY相關(guān)參數(shù)。2個群體之間的遺傳分化指數(shù)在2個水平差異不顯著，F(xiàn)ST=-0.013 70（位點水平），F(xiàn)ST=-0.003 00（單倍型水平）?？傮w而言，2個牦牛群體的MHC免疫區(qū)域遺傳多樣性豐富，暗示其抗病性和適應(yīng)性遺傳基礎(chǔ)優(yōu)秀，2個群體遺傳差異不明顯，加之半野血牦牛種群近交系數(shù)偏高，故建議對2個群體采取混群合并保種，提高種畜利用率，防止近交系數(shù)持續(xù)增高。

關(guān)鍵詞? ? 牦牛;MHC;遺傳多樣性;西藏改則

中圖分類號? ? S823? ? ? ? ?文獻標識碼? ? A

文章編號? ?1007-5739（2019）21-0209-03? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?開放科學(xué)（資源服務(wù)）標識碼（OSID）

Abstract? ? In this study，two genetic markers（BF1 and BM1258）of the MHC gene region were used to evaluate the genetic diversity of local yak（GZD，16 individuals）and semi-wild yak（GZY，18 individuals）in the Gaize County.The results showed that the expected heterozygosity（HE=0.719 96）and polymorphic information content（PIC=0.660 63）and allele number（NA=11）of BF1 locus were higher than BM1258 locus（HE=0.567 73，PIC=0.455 53，NA=6），but the observed heterozygosity of the BF1 locus（HO=0.303 31）was smaller than the BM1258 locus（HO=0.664 71）.In terms of population，the expected heterozygosity of GZD was 0.672 7±0.093 4（HE±SD），the observed heterozygosity was 0.556 3±0.089 2（HO±SD），and the PIC was 0.585 34，all of them in GZD were higher than GZY.The inbreeding coefficient of GZD（FIS=0.178） was smaller than GZY（FIS=0.337）.A total of 17 haplotypes were constructed by two MHC microsatellite loci，12 haplotypes in GZD and 11 haplotypes in GZY.At the haplotype level，the expected heterozygosity（HE） of GZD was 0.875 9，the observed heterozygosity was 0.800 0±0.103 3，and the polymorphic information content was 0.832 3，which was also slightly higher than the genetic differentiation index between the two populations of GZY related parameters.The two levels showed no significant difference，F(xiàn)ST=-0.013 70（site level），F(xiàn)ST=-0.003 00（haplotype level）.In general，the rich genetic diversity of the MHC immunization regions of the two yak popu-lations suggests that the genetic basis of disease resistance and adaptation is excellent，and the genetic difference between the two yak populations is not obvious，and the inbreeding coefficient of the semi-wild yak is high.In addition，we recommended the two populations were mixed and preserved to improve the utilization rate of the breeding stock and conflict to the inbreeding coefficient from increasing.

主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility compl-ex，MHC）是一組編碼動物主要組織相容性復(fù)合物基因群的統(tǒng)稱。由于MHC的多基因特性，依據(jù)其編碼分子的結(jié)構(gòu)、組織分布與功能差異，可分為MHC I類、MHC II類、MHC III類基因，分別編碼MHC I類分子、MHC II類分子、MHC III類分子[1-2]。MHC區(qū)域參與免疫反應(yīng)的編碼受體基因含有高度的多態(tài)性。MHC的主要功能包括抗原遞呈加工、細胞間相互作用、調(diào)控免疫應(yīng)答、誘導(dǎo)免疫反應(yīng)、抑制細胞活性等[3]。

目前，國內(nèi)外已有很多學(xué)者研究MHC分子在不同物種中的遺傳多樣性。Wang等[4]在2017年研究了中國白鷺中的MHC I的遺傳多樣性。Gillingham等[5]對地中海地區(qū)的大火烈鳥的不同群體之間的MHC II B的遺傳多樣性進行了分析。Mishra等[6]在2019年研究了MHC在印度牦牛中的遺傳多樣性。陳李鵬[7]在2017年研究MHC在不同的山羊品種以及牛中的遺傳多樣性。張 棟等[8]研究了不同尼羅羅非魚群體 MHC II A基因多態(tài)性和遺傳分化。屠云潔等[9]對狼山雞保種群不同世代MHC BF基因遺傳多樣性進行了研究。肖 衎等[10-11]對中華鱘野生群體及遷地群體的MHC Ia和MHC II B基因分別進行了遺傳多樣性分析。黃勛和等[12-14]研究了MH-CB區(qū)域復(fù)合微衛(wèi)星位點LEI0258在麒麟雞、華南家雞和貴妃雞中的遺傳多樣性。魏 磊等[15]研究了MHC基因在皖南黃牛和14個地方黃牛中遺傳多樣性，并進行了系統(tǒng)分析。岳遠瑞等[16]對新疆7個綿羊品種MHC區(qū)段微衛(wèi)星進行了遺傳多樣性分析。因此，MHC基因區(qū)域遺傳標記已經(jīng)被廣泛的用于家養(yǎng)動物遺傳多樣性研究。

本研究對西藏阿里地區(qū)改則縣半野血牦牛和當(dāng)?shù)丶茵B(yǎng)動物牦牛群體，利用MHC區(qū)域遺傳標記進行遺傳多樣性評估，以期對該地區(qū)2個牦牛群體的免疫遺傳多樣性進行鑒定的同時，對2個種群的結(jié)構(gòu)差異程度進行評估，為當(dāng)?shù)匕胍把笈ＹY源的保護與開發(fā)利用提供數(shù)據(jù)參考。

1? ? 材料與方法

1.1? ? 試驗材料

系統(tǒng)內(nèi)隨機抽樣選擇西藏阿里地區(qū)改則縣本地牦牛（GZD）16頭和半野血牦牛（GZY）18頭，共34頭，采集靜脈血，帶回實驗室，于-80 ℃的冰箱中保存?zhèn)溆?。用提取試劑盒（DP304，天根生化科技有限公司）提取全血基因組DNA，于-20 ℃保存。

1.2? ? 試驗訪求

2對MHC引物信息。BF1：F為CAACGGTCTGCAACCG-AATTACC，R為CAATCCGTGGGTTGGAACACAA，退火溫度為 58 ℃。BM1258：F為GTATGTATTTTTCCCACCCTGC，R為GTCAGACATGACTGAGCCTG。

采用20 μL反應(yīng)體系，其中各組分的終濃度分別為dN-TPs 0.2 mmol/L、Mg2+ 1.5 mmol/L、混合上下游引物0.5 mmol/L、Taq酶5 U/μL、DNA模板1 μL（約60 ng）。PCR反應(yīng)程序為94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，經(jīng)過35個循環(huán);于72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。本研究的PCR產(chǎn)物采用8%聚丙烯酰胺凝膠電泳進行檢測分析;PCR產(chǎn)物用ABI 3130 xl全自動基因分析儀進行分型檢測。

用Microsatellite Toolkit軟件[17]計算各遺傳位點的等位基因數(shù)（Number of alleles，NA）、多態(tài)信息含量（Polymorphic information content，PIC）、觀察雜合度（Observed Heterozygos-ity，HO）和期望雜合度（Expected Heterozygosity，HE）等參數(shù)。用Arlequin 3.5軟件[18]計算物種內(nèi)群體間遺傳分化指數(shù)（FST）并構(gòu)建單倍型。用GENEPOP 3.4軟件[19]進行哈德溫伯格平衡檢驗（Hardy-Weinberg Equilibrium，HWE）。用FSTAT 2.9軟件[20]計算群體近交系數(shù)（FIS）。

2? ? 結(jié)果與分析

2.1? ? 2個位點的遺傳多樣性

由表1可知，從2個位點在2個牦牛群體中平均水平來看，BF1位點的期望雜合度（HE=0.719 96）、多肽信息含量（PIC=0.660 63）、等位基因數(shù)（NA=11）都要高于BM1258位點的HE值（0.567 73）、PIC值（0.455 53）、NA值（6）;BF1位點的觀測雜合度HO值為0.303 31，低于BM1258位點（HO=0.664 71）。2個位點中，BF1位點的觀望雜合度值小于其期測雜合度，而BM1258位點的期望雜合度卻小于其觀測雜合度。BF1位點在2個群體中均偏離了哈代溫伯格平衡，而BM1258位點則均未偏離哈代溫伯格平衡。這可能是由于不同座位所在區(qū)域基因功能差異所致，尤其是大量MHC區(qū)域編碼基因與環(huán)境適應(yīng)性和抗病免疫等諸多生物學(xué)作用相關(guān)，故而不同區(qū)域或基因座位受到不同選擇的形式和選擇程度存在差異。

2.2? ? 2個牦牛群體的遺傳多樣性

由表2可知，改則縣本地牦牛的期望雜合度（HE±SD為0.672 7±0.093 4）、觀測雜合度（HO±SD為0.556 3±0.089 2）以及多態(tài)信息含量（PIC=0.585 340）均高于改則縣半野血牦牛的期望雜合度（HE±SD為0.615 0±0.058 8）、觀測雜合度（HO±SD為0.411 8±0.084 4）以及多態(tài)信息含量（PIC=0.530 822）。說明2個牦牛群體均呈現(xiàn)高度遺傳多樣性。同時，GZD的遺傳多樣性豐富程度較GZY略高，暗示可能由于GZY群體始祖群建立初期，純種野牦牛血緣數(shù)量限制所致。

從近交系數(shù)來看，GZD的近交系數(shù)為0.178，較低于GZY的近交系數(shù)（FIS=0.337），說明本地牦牛的遺傳多樣性比半野血牦牛的保護情況稍好，但就FIS值來看，2個群體還是不同程度上存在近交的可能。其次，雖然2個群體中的平均等位基因數(shù)均為5.50±2.12，但部分低頻率基因型種類仍存在一定程度差異，暗示了半野血群體內(nèi)由于棲息地交叉而導(dǎo)致血緣交融，但仍然由于遺傳背景差異使得部分種群特異遺傳物質(zhì)得以保留，同時也說明當(dāng)?shù)谿ZD牦牛群體并沒有完全受到野牦牛及GZY牦牛的大規(guī)模血緣侵染。另外，2個群體之間的遺傳分化指數(shù)（FST）為-0.013 70，卡方顯著性檢驗顯示二者種群遺傳差異不顯著（P>0.05）。

另外，剔除2個位點基因型缺失個體數(shù)據(jù)后，分別剩余牦牛GZD群體15頭和GZY群體16頭。利用2個MHC位點的片段長度基因型對這31頭牦牛的MHC 2個位點進行單倍型的重構(gòu)，單倍型的種類頻率如表3所示。可以看出，2個群體共攜帶17種單倍型，其中GZD群體攜帶12種單倍型，GZY群體攜帶11 種單倍型;其中有6種高頻率單倍型是GZD和GZY群體所共有的，GZD群體攜帶6種私有單倍型，每種單倍型的發(fā)現(xiàn)頻數(shù)均為1;GZY群體獨有單倍型數(shù)量為5種，頻數(shù)均為1。最高頻的為單倍型4（Haplotype-4），其總體頻數(shù)為16，在GZD和GZY群體中頻數(shù)分別為9和7。這個結(jié)果暗示了2個牦牛種群間存在大量遺傳物質(zhì)交換的可能，這與2個牦牛群體地理分布的交叉性是密不可分的。

利用單倍型對2個群體進行遺傳多樣性分析，結(jié)果如表4所示?？梢钥闯?，利用單倍型數(shù)據(jù)進行遺傳多樣性分析的結(jié)果與利用單個位點進行遺傳多樣性分析的結(jié)果相似。如GZD群體期望雜合度（HE±SD為0.875 9±0.000 0）、觀測雜合度（HO±SD為0.800 0±0.103 3）、多態(tài)信息含量（PIC=0.832 3）高于GZY群體的期望雜合（HE±SD為0.869 0±0.000 0）、觀測雜合度（HO±SD為0.687 5±0.115 9）、多態(tài)信息含量（PIC=0.823 7）。GZD群體的近交系數(shù)為0.089，低于GZY群體的近交系數(shù)（0.214）。在哈代溫伯格檢測中，2個群體中MHC單倍型都偏離了哈代溫伯格平衡，2個群體間的群體遺傳分化指數(shù)為-0.003 00，表明2個群體之間差異不顯著。以上結(jié)果進一步暗示從MHC單倍型水平來看，2個群體的遺傳結(jié)構(gòu)相似。同時，MHC單倍型的高度多態(tài)和雜合度在一定程度上反映出2個地方牦牛種群具有極其豐富的免疫相關(guān)的MHC變異，這可能是由于當(dāng)?shù)刈匀蝗后w受到人為選種選育壓力低所致，最重要是可能與2個群體具有高度的環(huán)境適應(yīng)性能力存在聯(lián)系。

3? ? 結(jié)論

本研究利用MHC區(qū)域遺傳標記位點對西藏阿里地區(qū)改則縣半野血牦牛及當(dāng)?shù)丶茵B(yǎng)牦牛群體遺傳多樣性進行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2個群體免疫區(qū)域遺傳多樣性豐富，同時2個種群盡管存在一定特有MHC基因型和單倍型，但總體遺傳差異不明顯。另外，由于半野血牦牛群體近交系數(shù)較高，存在近交風(fēng)險，故建議今后對2個群體進行混群保種，加大外源野牦牛血液滲透的同時，提高現(xiàn)有種群種畜利用率和參與度，以保障該地區(qū)牦牛資源群體的可持續(xù)發(fā)展利用。

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