李京偉，姜小艷，陳玉琴，吳海濱，李海文，李 健，黃 彬*

(1.深圳市中醫(yī)院,廣東 深圳518033;2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第四臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 深圳518033)

胃癌作為癌癥死亡的第二大原因，每年均有大量的新發(fā)病例，在這些新發(fā)病例中近三分之二發(fā)生在發(fā)展中國家，它與飲食，生活水平和醫(yī)療條件等密切相關(guān)[1]。 在中國，胃癌是最常見的癌癥之一，已成為城市中癌癥引起死亡的主要原因[2]。晚期胃癌患者的預(yù)后較差，復(fù)發(fā)率較高，深入研究胃癌發(fā)病、發(fā)展的分子機制，對于胃癌的預(yù)防和治療具有重要意義[3]。富含亮氨酸重復(fù)序列的G蛋白偶聯(lián)受體5(Leucine-rich Repeat Containing G Protein-coupled Receptor 5，Lgr5，又名 GPR49)，為Wnt/β-catenin信號通路的靶基因Lgr5編碼，Lgr5+細(xì)胞具有多向分化潛能，與多種消化道腫瘤的進(jìn)展及預(yù)后關(guān)系密切，但Lgr5促進(jìn)腫瘤發(fā)生、發(fā)展的具體機制尚未完全闡明[4,5]。本研究通過檢測不同分化程度胃癌臨床組織樣本和細(xì)胞系中相關(guān)蛋白的表達(dá)，探索Lgr5與Wnt/β-catenin通路在胃癌進(jìn)程中表達(dá)變化及其作用，為胃癌的基因治療提供潛在的治療方法和靶點。

1 材料與方法

1.1 臨床樣本收集與細(xì)胞培養(yǎng)30例胃癌組織和10例正常胃黏膜組織標(biāo)本，來自于深圳市中醫(yī)院，所有參與者均已簽署書面知情同意書。樣本經(jīng)臨床和組織病理學(xué)診斷，根據(jù)日本胃癌協(xié)會[6]的標(biāo)準(zhǔn)，分為三種類型：低分化胃癌，中分化胃癌和高分化胃癌，每種類型10例。手術(shù)切除獲得的臨床樣品，部分立即固定在4%多聚甲醛溶液中，部分新鮮冷凍在液氮中并儲存在-80℃下用于PCR測定。人胃正常黏膜上皮細(xì)胞GES-1，人未分化胃癌細(xì)胞株HGC-27， 人低分化胃癌細(xì)胞株BGC-823，人中分化胃癌細(xì)胞株MGC-803和人高分化胃癌細(xì)胞株AGS購自上海細(xì)胞庫，均培養(yǎng)于10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。本研究經(jīng)過深圳中醫(yī)院機構(gòu)審查委員會批準(zhǔn)。

1.2 qRT-PCR檢測組織樣本經(jīng)液氮研磨Trizol提供總RNA，細(xì)胞樣本用Trizol直接提取總RNA。以提取的總RNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA；按照qRT-PCR試劑盒SYBR Green法步驟進(jìn)行擴增，擴增42個循環(huán)周期，每個樣本重復(fù)3次，并以β-actin基因為內(nèi)參，3次獨立實驗后得到的數(shù)據(jù)運用相對表達(dá)量(Relative quantification，RQ)公式RQ=2-ΔΔCt的方法進(jìn)行分析。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.3 Western blot檢測組織樣本經(jīng)機械破碎后，蛋白裂解液提取總蛋白，細(xì)胞樣本直接提取總蛋白。BCA法檢測總蛋白濃度，計算并確定上樣量，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，條件為濃縮膠60 V電泳60 min，分離膠120 V電泳70 min。濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，條件為100 V，60 min；5%BSA封閉60 min后，分別進(jìn)行一抗(Abcam,USA)和二抗(博奧森，中國)孵育，洗滌3次后，ECL化學(xué)發(fā)光，X線底片顯影。采用Image J軟件分析蛋白的表達(dá)量。

1.4 免疫磁珠法分選Lgr5-和Lgr5-細(xì)胞胰酶消化收集AGS細(xì)胞，加入10 μl Lgr5抗體孵育20 min；PBS洗滌后，磁珠緩沖液重懸細(xì)胞并加入40 μl免疫磁珠孵育20 min，PBS洗滌后，重懸細(xì)胞移入到分離柱中，收集流出液體，得到Lgr5-細(xì)胞；將分離柱移出磁場，加入分選緩沖液分選得到Lgr5+細(xì)胞。

1.5 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖活性分別取分選的Lgr5+和Lgr5-細(xì)胞，消化收集并計數(shù)，接種于96孔板內(nèi)，5×103個/孔，5%CO2，37 ℃分別培養(yǎng)0、24、48和72 h后，每孔加入10 μl CCK-8檢測試劑(碧云天，中國)，置于培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)1 h，在酶標(biāo)儀OD450 nm處測量各孔的吸光度值。每個時間點設(shè)5個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。

1.6 細(xì)胞侵襲實驗分別取分選的Lgr5+和Lgr5-細(xì)胞，消化收集并計數(shù)，將1×105個細(xì)胞接種于Transwell小室上室，上室加入無血清培養(yǎng)基，下室為含10%胎牛血清的培養(yǎng)基。培養(yǎng)48 h后棄掉培養(yǎng)基，用PBS清洗兩次，4%多聚甲醛固定15 min后，0.5%結(jié)晶紫染色20 min，棉簽刮掉上室內(nèi)的細(xì)胞，在倒置顯微鏡下隨機讀取5個視野觀察并計數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 不同分化程度臨床胃癌組織和細(xì)胞樣本中Lgr5、β-catenin、 c-MYC和MMP-7 的表達(dá)情況

qRT-PCR和Western blot分析結(jié)果顯示(圖1和圖2)，正常組(正常胃黏膜組織)，低分化、中分化和高分化胃癌組織中Lgr5、β-catenin、 c-MYC和MMP-7 mRNA及其蛋白表達(dá)水平依次升高，其中，中分化和高分化胃癌組織與正常組相比具有顯著性差異(均P<0.05)。對于GES-1，HGC-27，BGC-823，MGC-803和AGS細(xì)胞而言，其Lgr5、β-catenin、 c-MYC和MMP-7 mRNA及其蛋白表達(dá)水平亦依次升高，但僅中分化的MGC803和高分化的AGS細(xì)胞與人胃正常黏膜上皮細(xì)胞GES-1相比具有顯著性差異。Lgr5、β-catenin、 c-MYC和MMP-7表達(dá)情況在成熟人胃癌細(xì)胞株和臨床胃癌組織樣本中相一致。

圖1 qRT-PCR檢測不同分化程度臨床胃癌組織(A)和細(xì)胞樣本(B)中Lgr5、β-catenin、 c-myc和MMP-7 mRNA表達(dá)水平

圖2 Western blot檢測不同分化程度臨床胃癌組織(A和C)和細(xì)胞樣本(B和D)中Lgr5、β-catenin、 c-myc和MMP-7蛋白表達(dá)水平

2.2 Lgr5+細(xì)胞和Lgr5-細(xì)胞的增殖活力檢測結(jié)果

Lgr5+細(xì)胞和Lgr5-細(xì)胞的增殖活力檢測結(jié)果見圖3，在起始細(xì)胞數(shù)量相同的情況下，經(jīng)過一段時間的培養(yǎng)，Lgr5+細(xì)胞的OD值明顯高于Lgr5-細(xì)胞，表明了此時Lgr5+細(xì)胞的數(shù)量明顯高于Lgr5-細(xì)胞，說明了Lgr5+細(xì)胞的增殖活力顯著高于Lgr5-細(xì)胞。

2.3 Lgr5+細(xì)胞和Lgr5-細(xì)胞的侵襲能力檢測結(jié)果

Transwell小室檢測結(jié)果顯示，Lgr5+細(xì)胞組細(xì)胞的侵襲數(shù)量明顯多于Lgr5-細(xì)胞組，見圖4。 對5個視野觀察并計數(shù)的結(jié)果顯示，Lgr5+細(xì)胞組發(fā)生侵襲的細(xì)胞數(shù)量為145.00±13.64，Lgr5-細(xì)胞組為51.80±7.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(表2，P<0.05)。

圖3 CCK-8檢測Lgr5+ 細(xì)胞和Lgr5-細(xì)胞的增殖活力

圖4 Transwell法檢測Lgr5+ 細(xì)胞和Lgr5-細(xì)胞的侵襲能力(結(jié)晶紫染色，×400)

表2 Lgr5+ 細(xì)胞和Lgr5-細(xì)胞的侵襲數(shù)量統(tǒng)計結(jié)果

2.4 Lgr5+細(xì)胞和Lgr5-細(xì)胞中β-catenin、 c-MYC和MMP-7 的表達(dá)情況

qRT-PCR和Western blot分析結(jié)果顯示(圖5)，Lgr5+細(xì)胞組Lgr5、β-catenin、 c-MYC和MMP-7 mRNA及其蛋白表達(dá)顯著高于Lgr5- 細(xì)胞組(均P<0.05)。

圖5 qRT-PCR和westen blot檢測Lgr5+ 細(xì)胞和Lgr5-細(xì)胞中β-catenin、 c-MYC和MMP-7 mRNA(A)和蛋白(B)表達(dá)水平

3 討論

β-catenin是Wnt信號通路的核心物質(zhì)，其在胞核中累積是Wnt信號激活的標(biāo)志，作為一種粘連蛋白，其高表達(dá)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲性生長，與多種腫瘤的不良預(yù)后相關(guān)[7,8]。c-MYC是Wnt通路的第二個靶體，β-catenin移位進(jìn)入細(xì)胞核后與Tcf/Lef家族中的轉(zhuǎn)錄因子發(fā)生反應(yīng)，β-catenin/Tcf復(fù)合體激活靶基因c-MYC和cyclinDl等，使細(xì)胞異常增殖與分化，最終導(dǎo)致腫瘤的形成與發(fā)展[9]。MMP-7屬于基質(zhì)金屬蛋白酶家族的成員，具有強大的基質(zhì)降解活性和底物特異性，在各類腫瘤的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移中均可見其過度表達(dá)[8-11]。本研究，通過對不同分化程度的胃癌組織和細(xì)胞系分析發(fā)現(xiàn)，β-catenin，c-MYC和MMP-7的表達(dá)水平隨著分化程度的升高而升高，高分化的胃癌細(xì)胞表現(xiàn)出更高水平的Wnt/β-catenin通路激活，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的粘連性下降，最終發(fā)展為侵襲性生長和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，這是腫瘤復(fù)發(fā)的主要原因。

Lgr5，作為Wnt信號通路的靶基因，主要表達(dá)于腺窩基底的柱狀細(xì)胞上，被認(rèn)為是癌癥干細(xì)胞標(biāo)志物之一[12]，其陽性表達(dá)患者預(yù)后較差，平均生存期較短，Lgr5 的表達(dá)水平可在一定程度上預(yù)測腫瘤的治療效果及預(yù)后[13]。Wnt通路異常激活可引起Lgr5表達(dá)水平的變化，從而對細(xì)胞的增殖分化和腫瘤的發(fā)生和發(fā)展起到重要作用。Choi YJ等人指出，Lgr5 可能是通過增強Wnt/β-catenin信號促進(jìn)胃癌腫瘤血管的形成，最終加快胃癌進(jìn)程[14]。Simon E等人通過對100例原發(fā)性胃癌患者臨床樣本進(jìn)行定量RT-PCR和免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)胃癌組織中Lgr5 mRNA平均表達(dá)水平是正常組織的5倍，與β-catenin表達(dá)具有正相關(guān)性，在非腫瘤組織中僅分布有極少數(shù)的Lgr5+細(xì)胞[15]。本研究通過免疫磁珠法，分選出AGS細(xì)胞中Lgr5+和Lgr5-細(xì)胞，對其分別進(jìn)行增殖和侵襲能力比較發(fā)現(xiàn)，Lgr5+細(xì)胞具有更強的增殖和侵襲能力，與上述研究結(jié)果一致，這說明Lgr5的表達(dá)水平可在一定程度上預(yù)測腫瘤的治療效果及預(yù)后。

綜上所述，Lgr5與Wnt/β-catenin在胃癌進(jìn)程中發(fā)揮著重要作用，可作為胃癌臨床監(jiān)控的標(biāo)志物。Lgr5的高表達(dá)以及Wnt/β-catenin通路的異常激活可促進(jìn)胃癌的惡化和復(fù)發(fā)，而人為降低Lgr5表達(dá)，抑制Wnt/β-catenin通路激活，可能是胃癌基因治療的方法之一。