李 莉，田士林，*，姜 俊，宋 麗

(1.黃淮學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，河南 駐馬店 463000； 2.駐馬店市農(nóng)業(yè)科學(xué)院 園藝研究所，河南 駐馬店 463000)

在植物生長過程中，逆境脅迫是植物生長經(jīng)常要面臨的問題，輕微的脅迫植物可以通過自身的調(diào)控來緩解逆境帶來的不利影響，通常植物通過啟動(dòng)抗氧化酶(SOD、POD、CAT)來抵御和清除活性氧，維持膜的穩(wěn)定性[1]；當(dāng)逆境脅迫超出植物自我調(diào)節(jié)能力時(shí)，植物體活性氧代謝失調(diào)從而導(dǎo)致自由基積累，并進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)損傷[1]。

光照不足是近年來設(shè)施園藝中常見的逆境脅迫。在弱光條件下，植物光合作用降低，葉綠素含量出現(xiàn)異常，這一現(xiàn)象常常與谷氨酰-tRNA還原酶基因(HEMA1)、葉綠素酸酯a氧化酶基因(CAO)、牻牛兒基牻牛兒焦磷酸基因(GGPP2)的失調(diào)密不可分[2]。GGPS2、CAO和HEMA1基因是調(diào)控植物進(jìn)行光合作用的關(guān)鍵基因，GGPS基因表達(dá)水平的高低不僅會影響植物光合器官中類胡蘿卜素的合成，而且會影響類異戊二烯途徑中葉綠素等物質(zhì)的合成[2]；CAO基因是催化脫植基葉綠素a形成葉綠素b的唯一基因，在弱光脅迫下通過調(diào)控葉綠素b含量使植物更好地適應(yīng)弱光環(huán)境[3]；HEMA1基因是代謝和環(huán)境調(diào)控的關(guān)鍵酶基因，該基因受光誘導(dǎo)，在光合組織中表達(dá)[3]。弱光環(huán)境下，上述3個(gè)基因的變化可以反映植物對弱光環(huán)境的適應(yīng)能力[2-3]，基因表達(dá)的變化會導(dǎo)致葉綠素的合成受阻，最終影響蔬菜的產(chǎn)量和品質(zhì)[4]。

近年來，隨著溫室大棚的廣泛應(yīng)用，蔬菜瓜果實(shí)現(xiàn)了周年供應(yīng)。受價(jià)格規(guī)律的影響，反季節(jié)蔬菜生產(chǎn)呈逐年上升的趨勢，然而，光照不足在大棚生產(chǎn)中最為常見[5]。辣椒屬于中光性植物，光照不足容易引起品質(zhì)降低[5]。因此，尋找一個(gè)簡單、快速、經(jīng)濟(jì)的栽培措施，用于緩解弱光對辣椒苗期生長所造成的不利影響至為重要。一氧化氮(nitric oxide，NO)既是一個(gè)氣態(tài)自由基也是一個(gè)多功能細(xì)胞信號傳導(dǎo)效應(yīng)器，在不同的生理過程中扮演著重要的作用[6]。研究表明，NO參與調(diào)控植物的抗病、氣孔關(guān)閉、非生物逆境脅迫、鐵離子平衡以及生長發(fā)育等方面[7]。硝普鈉(sodium nitroprusside，SNP)是外源NO的直接供體，利用SNP作為NO的發(fā)生器在植物逆境調(diào)控方面已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用[8-9]。有研究表明，適當(dāng)濃度的SNP能有效緩解逆境對多種植物生長造成的傷害[8-12]。付娟娟等[13]選用冷季型草坪草高羊茅為材料，通過研究不同遮陰強(qiáng)度和不同遮陰時(shí)間對高羊茅的膜透性及抗氧化酶活性的影響，結(jié)果表明，外源NO可以顯著提高遮陰脅迫下高羊茅葉片的葉綠素含量，降低質(zhì)膜相對透性的增加，減少膜質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA含量的升高，促進(jìn)脯氨酸的積累，提高超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)的活性。外源NO能否減輕弱光環(huán)境對辣椒植株造成的傷害尚未見相關(guān)報(bào)道。本研究擬設(shè)置不同程度的遮陰處理(輕度遮陰LS、中度遮陰MS、重度遮陰SS)模擬弱光環(huán)境條件，采用SNP作為NO的供體，探討外源NO對遮陰辣椒苗期抗氧化系統(tǒng)的影響，為辣椒耐弱光遺傳資源的篩選及設(shè)施栽培提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料為光強(qiáng)敏型辣椒材料WM-1，為早熟品種，果實(shí)朝天簇生，株高30～40 cm，果實(shí)初期乳白，成熟后淺紅，微辣。每簇結(jié)5～6個(gè)果，果長4～5 cm，果徑1 cm左右，單果質(zhì)量3～4 g，坐果力強(qiáng)。種子由河南省辣椒核心種質(zhì)資源創(chuàng)制及分子育種創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)提供。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)布置

試驗(yàn)于黃淮學(xué)院智能溫室內(nèi)進(jìn)行。當(dāng)辣椒長出3～4片真葉時(shí)，移栽于花盆(20 cm×14 cm)，盆土成分為泥炭、沙子和珍珠巖(體積比1∶1∶1)，每盆1株，按照隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)布置。2周后，選出70株相同苗齡、相同高度、相同莖粗、相同葉片數(shù)、相同健康程度的辣椒苗為試材。其中，對照(CK)10株、輕度遮陰(LS)20株、中度遮陰(MS)20株、重度遮陰(SS)20株。每3 d澆一次霍格蘭營養(yǎng)液，每盆每次澆200 mL。

1.2.2 遮陰處理

智能溫室內(nèi)采用黑色透氣遮陽網(wǎng)進(jìn)行遮陰，設(shè)置對照(CK)和3種遮陰處理(輕度遮陰、中度遮陰、重度遮陰)。對照(CK)光強(qiáng)，1 000 μmol·m-2·s-1；輕度遮陰(LS)光強(qiáng)，600 μmol·m-2·s-1；中度遮陰(MS)光強(qiáng)，300 μmol·m-2·s-1；重度遮陰(SS)光強(qiáng)，100 μmol·m-2·s-1。生長溫度：白天28 ℃/夜晚20 ℃，光照時(shí)間：白天10 h/夜晚14 h。

1.2.3 SNP配制及噴施

2000年11月，美國國會在水資源發(fā)展法中通過了大沼澤地綜合修復(fù)計(jì)劃。這是美國有史以來最大的環(huán)境修復(fù)工程，共有60個(gè)單項(xiàng)，計(jì)劃30年完成。該計(jì)劃的主要目標(biāo)：一是增加自然生態(tài)的空間面積，改善棲息環(huán)境及其相應(yīng)功能，增加原生態(tài)動(dòng)植物種群的數(shù)量和多樣性；二是增加區(qū)內(nèi)工農(nóng)業(yè)及城鎮(zhèn)供水量，降低洪水災(zāi)害。修復(fù)計(jì)劃有四項(xiàng)主要措施：

SNP購自Sigma公司，使用前30 min用蒸餾水配成0.1 mmol·L-1SNP工作液[9]，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。每天下?8:00進(jìn)行噴施，用SNP溶液分別對輕度遮陰、中度遮陰、重度遮陰辣椒植株進(jìn)行均勻噴施，每隔30 min噴施一次，連續(xù)噴施3次，分別對3組噴施過SNP溶液的遮陰植株進(jìn)行掛牌，標(biāo)記為LS+SNP(輕度遮陰+SNP)、MS+SNP(中度遮陰+SNP)、SS+SNP(重度遮陰+SNP)。

1.2.4 樣品采集

從SNP噴施后的第5天開始，分別采集不同處理組辣椒葉片，帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)測定。每5 d進(jìn)行一次采樣，至第15天采樣結(jié)束。

1.2.5 相關(guān)指標(biāo)測定

SOD、POD、CAT活性的測定分別采用氮藍(lán)四唑(NBT)法、分光光度法和紫外吸收法[3]；葉綠素a、葉綠素b、葉綠素a+b含量的測定采用葉綠素含量測定儀(SPAD502)；葉面積的測定采用數(shù)格子法：沿著葉子的形狀將其畫下來，畫在透明的坐標(biāo)紙上，然后數(shù)格子。計(jì)算格子時(shí)，葉片邊緣凡超過半格的計(jì)算為1，不足半格則不計(jì)數(shù)，根據(jù)數(shù)出的格子數(shù)就是葉片的面積數(shù)。以上所有指標(biāo)均重復(fù)測定3次，其結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

1.2.6 半定量RT-PCR

采用Trizol法提取辣椒葉片總RNA，用微量紫外分光光度計(jì)(ND-1000，美國)測定純度及定量(D260/D280、D260/D230)，-80 ℃保存。采用cDNA一鏈合成試劑盒(上海生工)，對純化后的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA一鏈，-20 ℃保存?zhèn)溆谩０凑瞻攵縍T-PCR的要求，重復(fù)3次。根據(jù)辣椒基因組中GGPS2、CAO和HEMA1基因相對應(yīng)的CDS序列和Ubi3基因序列，設(shè)計(jì)半定量RT-PCR引物(表1)。

表1 引物序列

Table1Primer sequences used for qPCR

基因Gene 序列號Accession number引物名稱Primer name引物序列Sequence(5′→3′)GGPS2Capana04g000412GGPS2-FGGPS2-RTTGAAGCAGCACAGACGGCGAGAAGGGAATAACGCAOCapana00g004119CAO-FCAO-RGCCACGAGACAAGGAACAGAGTCGGGGATTGATAGTHEMA1Capana04g000804HEMA1-FHEMA1-RAGTTCTGGTGGAAATGTGACTGGATACTAAGCCCAATGACUbi3AY486137.1Ubi3-FUbi3-RGTTGTCTCTCGTCTACCTTGTCAGAATAACACGAACCCCAC

Ubi3用作內(nèi)參基因，F(xiàn)為正向引物，R為反向引物。

Ubi3 was used as internal control (reference gene); F， Forward primer; R， Reverse primer.

以PCR擴(kuò)增出的條帶清晰可見為原則對模板濃度進(jìn)行調(diào)整，將反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA一鏈適當(dāng)稀釋至50 ng·mL-1，作為半定量RT-PCR模板。PCR擴(kuò)增體系為15 μL：上游引物和下游引物(10 mmol·L-1)各0.5 μL，5×Buffer(含Mg2+)1.5 μL，dNTP(2.5 mmol·L-1)0.3 μL，Taq酶0.12 μL，模板cDNA 1.5 μL，ddH2O至10.58 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，退火30 s，溫度分別為48 ℃(HEMA1、CAO的引物)、47℃(GGPS2、Ubi3的引物)，72 ℃延伸1 min，26～28個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃終止反應(yīng)。取10 μL PCR產(chǎn)物分別點(diǎn)樣至1%瓊脂糖凝膠樣品孔中，在1×TAE電泳緩沖液中檢測PCR產(chǎn)物，全自動(dòng)凝膠成像分析儀(上海培清JS-680C)照相分析電泳結(jié)果。

采用SAS (SAS Institute， version 8.2)對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，采用SigmaPlot10.0軟件進(jìn)行作圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 SNP對弱光脅迫下辣椒植株生長狀況的影響

由表2可以看出，隨著遮陰加重，辣椒結(jié)果能力減弱、分枝降低、葉片稀而少；經(jīng)SNP處理后，植株的株高、莖粗、葉面積比遮陰植株顯著增加；在輕度遮陰條件下，SNP可以提高果實(shí)的質(zhì)量。值得提出的是：經(jīng)SNP處理過的中度遮陰(MS)和重度遮陰(SS)植株，植株的分枝數(shù)明顯增加。

表2SNP對遮陰處理下辣椒生長指標(biāo)的影響

Table2Effect of SNP on pepper growth indicators under weak light stress

材料Material株高Plant height/cm莖粗Stem diameter/cm葉面積Leaf area/cm2分枝數(shù)Number of branches 果實(shí)質(zhì)量Fruit weight/gCKLSLS+SNPMSMS+SNPSSSS+SNP38.53 b38.48 c38.87 a33.21 f33.72 d31.14 g33.42 e0.75 a0.72 b0.75 a0.58 d0.62 c0.46 e0.59 d35.73 a35.65 b35.72 a27.81 e29.81 c23.67 f28.12 d5 a5 a5 a2 c3 b1 d3 b3.22 a2.31 c3.20 b————

CK，對照株，正常光照；LS，輕度遮陰；MS，中度遮陰；SS，重度遮陰；LS+SNP，對輕度遮陰植株采用SNP處理；MS+SNP，對中度遮陰植株采用SNP處理；SS+SNP，對重度遮陰植株采用SNP處理。同列數(shù)據(jù)后無相同字母的表示處理間差異顯著(P<0.05)。 “—”為未檢測到。

CK， The control (unshaded plants); LS， Light shaded treatment; MS， Moderate shaded treatment; SS， Severe shaded treatment; LS+SNP， SNP treatment on the light shaded plants; MS+SNP， SNP treatment on the moderate shaded plants; SS+SNP， SNP treatment on the severe shaded plants. Data marked without the same letters in the same column indicated significant difference atP<0.05. "—"， undetected.

2.2 SNP對不同弱光脅迫下辣椒幼苗SOD、POD和CAT活性的影響

從圖1-A中可以看出，處理第5、10、15天時(shí)，正常光照植株的SOD活性未發(fā)生明顯變化；不同程度遮陰處理后，辣椒植株SOD活性增加；與單獨(dú)遮陰處理相比，SNP處理后，遮陰植株葉片中的SOD活性普遍增加。說明SNP的施用提高了遮陰環(huán)境下辣椒植株的SOD活性，提高了弱光環(huán)境條件下辣椒的抗氧化能力。

從圖1-B中可以看出，遮陰處理后，取樣檢測結(jié)果表明，第5天、第10天、第15天對于正常光照植株來說，POD活性未發(fā)生明顯的變化；不同程度遮陰處理的辣椒植株P(guān)OD活性增加；與單純遮陰辣椒植株相比，采用SNP處理遮陰的辣椒植株，葉片的POD活性普遍增加。因此，SNP的施用提高了辣椒植株中POD活性，增強(qiáng)了弱光環(huán)境條件下辣椒的抗逆性。

從圖1-C中可以看出，遮陰處理后，取樣檢測結(jié)果表明，第5天，輕度遮陰未發(fā)生明顯變化，中度遮陰和重度遮陰經(jīng)SNP處理后效果明顯；第10天，無論是輕度遮陰、中度遮陰還是重度遮陰經(jīng)SNP處理后CAT活性明顯增加；第15天，除重度遮陰脅迫經(jīng)SNP處理后有輕微提高外，SNP處理15天時(shí)對遮陰植株CAT活性的提高已經(jīng)沒有影響，說明SNP處理有一定的時(shí)間效應(yīng)。因此，SNP的噴施提高了辣椒CAT活性，一定時(shí)期內(nèi)提高了弱光環(huán)境條件下辣椒的抗逆性。

圖1 SNP對不同弱光脅迫下辣椒幼苗SOD、POD和CAT活性的影響Fig.1 Effect of SNP on SOD， POD and CAT activity of pepper seedlings under different weak light stress

2.3 SNP對不同弱光脅迫下辣椒幼苗葉片葉綠素含量的影響

從圖2-A可以看出：第5天、第10天、第15天，相對于未噴施SNP辣椒植株來說，噴施SNP后辣椒葉片中的葉綠素a的SPAD值均表現(xiàn)為不同程度的提高，其中第15天SNP處理過的輕度遮陰植株葉綠素a的SPAD值與輕度遮陰植株差異顯著。因此，SNP的施用可以增強(qiáng)弱光脅迫下辣椒植株的抗逆能力。

從圖2-B可以看出：第5天、第10天，噴施SNP后辣椒葉片中的葉綠素b的SPAD值與未噴施SNP的遮陰植株相比均表現(xiàn)為不同程度的提高；噴施SNP后的第15天，辣椒葉片中的葉綠素b的SPAD值差異不顯著。

由圖2-C得知，第5天，SNP處理過的輕度遮陰和中度遮陰植株葉片中的葉綠素a+b的SPAD值略有提高，SNP處理過的重度遮陰植株葉片中的葉綠素a+b的SPAD值有不同程度的降低；第10天，SNP處理過的輕度遮陰和中度遮陰植株葉片中的葉綠素a+b的SPAD值略有提高，SNP處理過的重度遮陰植株葉片中的葉綠素a+b的SPAD值無顯著差異；第15天，SNP處理過的輕度遮陰、中度遮陰和重度遮陰植株葉片中的葉綠素a+b的SPAD值均有提高，但只有SNP處理過的輕度遮陰和中度遮陰葉綠素a+b值差異顯著；SNP提高了輕度遮陰和重度遮陰辣椒葉片中葉綠素a+b的SPAD值，對重度遮陰效果不明顯。

圖2 SNP對不同弱光脅迫下的辣椒幼苗葉綠素含量的影響Fig.2 Effect of SNP on chlorophyll content in pepper leaves under different weak light stress

2.4 SNP對葉綠素合成相關(guān)基因表達(dá)水平的影響

取不同處理的辣椒葉片1 μL總RNA，1%瓊脂糖凝膠電泳后，28S RNA和18S RNA條帶清晰，完整性較好，無明顯降解(圖3-A)。紫外分光光度計(jì)測得所提RNA的D260/D280值約為2.0，表明總RNA提取質(zhì)量較好，符合進(jìn)一步RT-PCR的要求；確定適宜的循環(huán)次數(shù)是保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性的關(guān)鍵因素之一，本試驗(yàn)以Ubi3為內(nèi)參基因[14]，在25～30個(gè)循環(huán)數(shù)內(nèi)來探索內(nèi)參基因和葉綠素酶基因的指數(shù)期，根據(jù)PCR電泳擴(kuò)增結(jié)果(圖3-B)，確定了內(nèi)參Ubi3基因在28個(gè)循環(huán)時(shí)達(dá)到指數(shù)期，參試的3個(gè)葉綠素酶基因HEMA1、CAO、GGPS2對應(yīng)的指數(shù)期分別為26、28和27個(gè)循環(huán)，分別以上述循環(huán)數(shù)進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增；從圖3-C中可以看出，弱光脅迫后，與對照(CK)相比，植株葉片中的GGPS2基因、CAO基因和HEMA1基因表達(dá)水平增強(qiáng)，而噴施過SNP的辣椒植株3個(gè)基因的表達(dá)水平更強(qiáng)。由此可知，SNP處理促進(jìn)了GGPS2基因、CAO基因和HEMA1基因的表達(dá)，增強(qiáng)了辣椒的耐弱光性。

3 討論

低溫弱光等環(huán)境因子是反季節(jié)設(shè)施蔬菜生產(chǎn)主要因素。在逆境脅迫下，植物形態(tài)特征變化可以直接反映植物的受傷害狀況，是評價(jià)植物抗逆性強(qiáng)弱的最直接指標(biāo)[4]。本研究中，遮陰導(dǎo)致辣椒植株葉片少、分枝差、植株生長勢弱；采用SNP處理后，處理組植株(MS+SNP和SS+SNP)長勢明顯好于遮陰組植株(MS和SS)。因此，對于反季節(jié)大棚辣椒，可以通過噴施SNP來緩解弱光對辣椒植株生長的影響。

A，RNA質(zhì)量；B，RT-PCR最佳循環(huán)數(shù)；C，相關(guān)基因表達(dá)水平。A， The quality of RNA; B， The optimal number of cycles for RT-PCR; C， The level of expression of related genes.圖3 HEMA1、CAO和GGPS2的表達(dá)水平的變化Fig.3 Changes in the expression levels of genes HEMA1， CAO and GGPS2

總之，在遮陰情況下，SNP能夠提高辣椒植株SOD、POD、CAT活性，增強(qiáng)了植株的耐弱光性；葉綠素a含量和葉綠素b含量的增加，提高了弱光環(huán)境下辣椒光合能力；同時(shí)，SNP處理也在一定程度上提高了葉綠素合成相關(guān)基因的表達(dá)水平。這些結(jié)論表明：NO有利于弱光環(huán)境下辣椒抗性的提高和光合能力的恢復(fù)，對于弱光環(huán)境下辣椒的生產(chǎn)提供參考。