吳 青，金 星，王忠霞，王 偉

(1.鹽城市第三人民醫(yī)院，江蘇 鹽城 224001;2.鹽城工學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院，江蘇 鹽城 224002)

吡羅昔康(PRX)，又稱安爾克或吡氧噻嗪，學(xué)名2-甲基-4-羥基-N-(2-吡啶基)-2H-1,2-苯并噻嗪-3-甲酰胺-1,1-二氧化物，是一種典型的非甾體類抗炎鎮(zhèn)痛藥[1]。在臨床上被廣泛用于治療許多疾病，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎和急性疼痛等[2]。但是，一日內(nèi)服用PRX超過20 mg將會(huì)產(chǎn)生一系列副作用，如頭痛、頭暈、耳鳴及胃潰瘍等[3-4]。因此，為了有效控制藥物用量，建立快速有效的PRX檢測(cè)傳感技術(shù)顯得尤為重要。目前，檢測(cè)PRX有多種方法，如高效液相色譜法(HPLC)[5]、分光光度法[6]、伏安法[7]、毛細(xì)管電泳法[8]等。盡管這些方法具有較高的靈敏度，但是也存在檢測(cè)耗時(shí)較長(zhǎng)、前處理過程復(fù)雜、儀器設(shè)備昂貴且操作要求較高等問題[9]。因此，尋求一種簡(jiǎn)單、靈敏、選擇性高的檢測(cè)方法具有重要的研究意義。

熒光碳點(diǎn)(CDs)作為一種新型的熒光納米材料，因其獨(dú)特的光學(xué)特性、物理化學(xué)性質(zhì)、良好的生物相容性和較高的光學(xué)穩(wěn)定性等優(yōu)點(diǎn)，已成為生物醫(yī)學(xué)和傳感應(yīng)用等領(lǐng)域的明星材料[10-11]。研究表明，相對(duì)于傳統(tǒng)的熒光CDs，雜元素?fù)诫s的熒光CDs在光學(xué)性質(zhì)、物理化學(xué)性能以及量子產(chǎn)率等方面都會(huì)得到明顯的改善，因此在實(shí)際樣品檢測(cè)中具有更高的實(shí)用價(jià)值[12-15]。例如，Chen等[16]以乳糖為原材料成功地合成了熒光碳點(diǎn)，進(jìn)行葉酸定量檢測(cè)，其線性范圍在8×10-8～6×10-5mol/L，進(jìn)一步評(píng)估了熒光碳針檢測(cè)人體尿液樣本中葉酸的實(shí)用性。Niu等[17]以水溶性胺包覆碳點(diǎn)為基礎(chǔ)，利用苦味酸(PA)與碳點(diǎn)表面的陰陽離子對(duì)產(chǎn)生的強(qiáng)靜電相互作用建立了一種簡(jiǎn)單、低毒的PA納米傳感器，其胺包覆碳點(diǎn)在水溶液中對(duì)PA的檢測(cè)限約為1×10-6mol/L。Das等[18]通過在碳點(diǎn)中摻入氮和硫，合成具有高量子產(chǎn)率(69.27%)的摻雜碳點(diǎn)，硫和氮的協(xié)同作用為熒光探針提供了優(yōu)異的發(fā)光性能，為檢測(cè)有機(jī)分子丙酮提供了識(shí)別位點(diǎn)，其最低檢測(cè)限為7.2×10-7mol/L。盡管摻雜碳基納米材料作為熒光探針已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于傳感體系，但是這些熒光CDs發(fā)射位置大多位于短波區(qū)域，因此，結(jié)合碳點(diǎn)無毒性可應(yīng)用于細(xì)胞等生物組織成像的特點(diǎn)，尋求制備一種長(zhǎng)余輝發(fā)射的熒光CDs材料成為一個(gè)亟待解決的問題。

本研究中，我們以鄰苯二胺、谷氨酸及硼酸為前軀體，通過簡(jiǎn)單的一步水熱法成功制備硼氮共摻雜熒光碳點(diǎn)(B,N-CDs)。研究表明，B,N-CDs具有較好的分散性、優(yōu)異的水溶性和突出的光學(xué)及物化性能，且B,N-CDs在長(zhǎng)波長(zhǎng)區(qū)域發(fā)射(λex=650 nm，λem=700 nm、731 nm)，研究過程中發(fā)現(xiàn)PRX可以有效地淬滅B,N-CDs的熒光，具體合成及淬滅過程如圖1所示。

圖1 合成B,N-CDs及檢測(cè)吡羅昔康的原理圖Fig 1 Schematic diagram of synthesis B,N-CDs and detection of piroxicam

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑和儀器

實(shí)驗(yàn)中使用的所有化學(xué)試劑均為分析純。其中，鄰苯二胺(C6H8N2)、谷氨酸(C5H9NO4)、硼酸(H3BO3)、吡羅昔康(C15H13N3O4S)購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，甲醇購(gòu)自上海阿拉丁化學(xué)試劑有限公司，實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

實(shí)驗(yàn)儀器:紫外—可見分光光度計(jì)(UV-Vis)，UV-2450，Shimadzu，Japan；熒光光譜儀(配備1 mL石英比色皿)，F(xiàn)luormax-4，Horiba，USA；透射電子顯微鏡(TEM)，JEM-2010，JEOL，Japan；傅里葉變換紅外光譜儀(FT-IR)，Nicolet-5700，USA。

1.2 硼氮共摻雜碳點(diǎn)的制備

以鄰苯二胺、谷氨酸和硼酸作為碳源、氮源和硼源，利用簡(jiǎn)便的水熱法合成雙發(fā)射硼氮共摻雜的熒光碳點(diǎn)(B,N-CDs)[19]。具體實(shí)驗(yàn)步驟如下：將0.11 g鄰苯二胺、0.11 g谷氨酸和0.055 g硼酸溶于5 mL甲醇，避光超聲30 min形成均勻溶液；然后將上述5 mL混合溶液轉(zhuǎn)移至聚四氟乙烯(Teflon)作為內(nèi)襯的高壓反應(yīng)釜(30 mL)中，180 °C下加熱反應(yīng)16 h，反應(yīng)結(jié)束后自然冷卻至室溫；最后，在10 000 r/min的條件下離心30 min去除大顆粒，收集上清液得到黃褐色的B,N-CDs，置于冰箱中保存待用。

1.3 吡羅昔康(PRX)的檢測(cè)

吡羅昔康(PRX)定量檢測(cè)的步驟如下：在12個(gè)1.5 mL離心管中分別加入10 μL B,N-CDs、50 μL PBS緩沖液(pH 7.0)及不同濃度的PRX標(biāo)準(zhǔn)溶液，加二次蒸餾水定容至500 μL，漩渦儀攪拌幾秒鐘靜置反應(yīng)30 min，在650 nm的激發(fā)波長(zhǎng)條件下，通過熒光光譜研究不同濃度的PRX標(biāo)準(zhǔn)溶液在相同條件下的熒光變化。激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)的狹縫寬度均為5 nm。

1.4 選擇性研究

在選擇性實(shí)驗(yàn)中，將10 μL B,N-CDs和50 μL PBS緩沖液(pH 7.0)分別置于14個(gè)1.5 mL離心管中，然后依次加不同種類的干擾物質(zhì)，包括L-半胱氨酸(Cys)、谷胱甘肽(GSH)、多巴胺(Dop)、葡萄糖(Glu)、乳糖(Lactose)、腎上腺素(Adrenaline)、卡托普利(Cap)、6-巰基嘌呤(6-MP)、抗壞血酸(AA)、茶多酚(GTP)、尼美舒利(Nim)、阿昔洛韋(Acy)、蔗糖(Sucrose)和腺苷三磷酸(ATP)，孵化幾分鐘后用二次蒸餾水定容至500 μL。在激發(fā)波長(zhǎng)650 nm，狹縫均為5 nm條件下測(cè)定熒光圖譜。其中PRX、GTP和Acy的濃度為2×10-4mol/L，其他干擾物的濃度為3×10-4mol/L。

1.5 實(shí)際樣品檢測(cè)

抽取市售相同的PRX片(10片)，用研缽將其研磨均勻，準(zhǔn)確稱取0.0331 g PRX粉末用10 mL乙醇溶解，用二次蒸餾水定容至100 mL。采用標(biāo)準(zhǔn)加入法進(jìn)行實(shí)樣測(cè)定，在3個(gè)1.5 mL離心管中分別加入10 μL B,N-CDs、50 μL PBS緩沖液(pH 7.0)及不同體積的上述配置溶液，加二次蒸餾水定容至500 μL，漩渦儀攪拌幾秒鐘后靜置反應(yīng)30 min，在650 nm的激發(fā)波長(zhǎng)條件下，通過熒光光譜研究不同濃度的PRX在相同條件下的熒光變化。激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)的狹縫寬度均為5 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 碳點(diǎn)的表征

為了研究碳點(diǎn)的形貌，采用TEM對(duì)B,N-CDs顆粒形貌進(jìn)行表征,如圖2所示。由圖2a可知,該碳納米材料由碳點(diǎn)聚集組成且呈團(tuán)聚狀態(tài)，在電子束下表現(xiàn)出很好的穩(wěn)定性。為了進(jìn)一步研究該碳點(diǎn)的組成結(jié)構(gòu)，對(duì)a圖中矩形部分材料進(jìn)行放大，結(jié)果如圖2b所示。發(fā)現(xiàn)該聚集材料由粒徑約20 nm的B,N-CDs聚集而成。應(yīng)用EDS對(duì)其進(jìn)行元素組成分析，分析結(jié)果如圖2c所示。數(shù)據(jù)結(jié)果表明B,N-CDs主要有B、C、N、O等4種元素組成，說明通過簡(jiǎn)單的一步水熱合成技術(shù)成功合成了硼氮共摻雜的碳基熒光納米材料。

圖2 B,N-CDs的TEM圖(a,b)和EDS圖(c)Fig 2 TEM diagram (a,b) and EDS diagram (c) of B,N-CDs

使用FT-IR對(duì)B,N-CDs的表面狀態(tài)進(jìn)行表征，如圖3所示。在3191 cm-1處的寬吸收帶是-OH伸縮振動(dòng)峰或N-H伸縮振動(dòng)峰[20-21]，1 685 cm-1處的吸收峰是C=O伸縮振動(dòng)峰[22]，1 395 cm-1和1 255 cm-1處的吸收峰歸因于C-N/B-N和B-C的彎曲振動(dòng)[23-24]，748 cm-1處的吸收峰歸因于苯環(huán)上Ar-H的彎曲振動(dòng)。FT-IR結(jié)果表明，B,N-CDs表面含有大量的羧基、氨基及含硼羥基等親水基團(tuán)，直接為B,N-CDs具有良好的水溶性提供了證據(jù)。

圖3 B,N-CDs的紅外光譜圖Fig 3 Infrared spectrogram of B,N-CDs

2.2 碳點(diǎn)光學(xué)性質(zhì)研究

不同激發(fā)波長(zhǎng)下B,N-CDs的熒光發(fā)射圖譜如圖4所示。由圖4可以看出，隨著激發(fā)波長(zhǎng)的增加，碳點(diǎn)發(fā)射峰的位置并沒有隨之改變，且在激發(fā)波長(zhǎng)增加到650 nm時(shí)，發(fā)射峰值強(qiáng)度達(dá)到最大。隨著激發(fā)波長(zhǎng)的繼續(xù)增大其熒光強(qiáng)度逐漸減小，表明B,N-CDs的發(fā)射光譜并不依賴碳點(diǎn)的激發(fā)波長(zhǎng)。這可能是由于碳點(diǎn)尺寸分布均勻?qū)е碌腫25]。B,N-CDs的紫外—可見吸收光譜和熒光光譜如圖5所示，由圖5中的曲線a可以看出，B,N-CDs在250 nm、271 nm處有明顯的特征吸收峰，是由C-C鍵的π-π*躍遷引起的[26];在374 nm處有一小的吸收峰，是由摻雜元素引起的n-π*躍遷[27]。由圖5中的曲線b可以看出，所制備的B,N-CDs在長(zhǎng)波區(qū)域具有很明顯的長(zhǎng)余輝發(fā)射。

2.3 傳感機(jī)制的研究

使用熒光光譜研究PRX對(duì)B,N-CDs的熒光淬滅效果，結(jié)果如圖6所示。結(jié)果表明，PRX可以有效地淬滅B,N-CDs的熒光。由圖6中的曲線b可知，當(dāng)加入1×10-4mol/L PRX后，60%的B,N-CDs熒光強(qiáng)度被PRX淬滅，說明可以利用制備的B,N-CDs定量檢測(cè)PRX。為了進(jìn)一步探索PRX對(duì)碳點(diǎn)的熒光淬滅機(jī)理，使用紫外光譜對(duì)其進(jìn)行研究，結(jié)果如圖7所示。實(shí)驗(yàn)表明，單純的碳點(diǎn)和加入PRX的碳點(diǎn)的紫外—可見光圖譜并沒有明顯改變，說明加入PRX分子并沒有改變B,N-CDs的分子結(jié)構(gòu)，僅是通過簡(jiǎn)單的電子或者能量轉(zhuǎn)移使其熒光發(fā)生淬滅[28]。

圖4 不同激發(fā)波長(zhǎng)下B,N-CDs的熒光發(fā)射圖譜Fig 4 Fluorescence emission spectra of B,N-CDs at different excitation wavelengths

圖6 B, N-CDs對(duì)PRX的熒光響應(yīng)圖譜Fig 6 Fluorescence response spectra of B,N-CDs for PRX

圖5 B,N-CDs的紫外—可見吸收光譜和熒光光譜Fig 5 UV-Vis absorption and fluorescence spectra of B, N-CDs

圖7 B, N-CDs對(duì)PRX的紫外響應(yīng)圖譜Fig 7 UV-Vis response spectra of B,N-CDs for PRX

2.4 PRX定量檢測(cè)

基于上述研究結(jié)果，利用B,N-CDs對(duì)PRX進(jìn)行定量檢測(cè)。B,N-CDs熒光強(qiáng)度與PRX濃度的變化關(guān)系如圖8所示。由圖8可以看出，隨著PRX標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的不斷增加(0～5×10-4mol/L)，B,N-CDs的熒光強(qiáng)度逐漸降低。說明B,N-CDs對(duì)PRX的檢測(cè)具有較高的靈敏度。實(shí)驗(yàn)中相對(duì)熒光強(qiáng)度與PRX濃度的線性關(guān)系如圖9所示。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，B,N-CDs對(duì)PRX的定量檢測(cè)在2×10-7～1.5×10-4mol/L的濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，在3倍的標(biāo)準(zhǔn)偏差下測(cè)量，得到PRX的最低檢測(cè)限為5.7×10-8mol/L，與其他文獻(xiàn)中的PRX最低檢測(cè)限相比要低得多[29-32]。

2.5 干擾實(shí)驗(yàn)

除了靈敏度，選擇性是衡量熒光探針優(yōu)劣的重要因素之一。為了研究B,N-CDs熒光探針的選擇性，在最佳的實(shí)驗(yàn)條件下，分別加入潛在的不同種類的干擾物質(zhì),包括Cys、GSH、Dop、Glu、Lactose、Adrenaline、Cap、6-MP、AA、GTP、Nim、Acy、Sucrose和ATP,對(duì)其選擇性進(jìn)行研究。其中，PRX、GTP和Acy的濃度是2×10-4mol/L，其他干擾物的濃度均為3×10-4mol/L。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖10所示,從圖中可以看出，B,N-CDs對(duì)PRX具有較高的選擇性，這主要是由于B,N-CDs具有特異性結(jié)合PRX的活性位點(diǎn)，而與其他干擾物沒有明顯特異性反應(yīng)的結(jié)果。

圖8 B,N-CDs對(duì)不同濃度PRX的熒光響應(yīng)圖譜Fig 8 Fluorescence response of B,N-CDs for different concentrations of PRX

圖9 B,N-CDs相對(duì)熒光強(qiáng)度與PRX濃度的線性關(guān)系圖Fig 9 Linear relationship between the relative fluorescence intensity of B,N-CDs and PRX concentration

圖10 B,N-CDs對(duì)不同干擾物質(zhì)的熒光響應(yīng)圖譜及其對(duì)應(yīng)的柱狀圖譜Fig 10 Fluorescence response spectra of B,N-CDs for different interfering substances and their corresponding column patterns

2.6 實(shí)際樣品檢測(cè)

為了驗(yàn)證設(shè)計(jì)合成的B,N-CDs熒光探針的實(shí)用性，選擇市售的PRX作為實(shí)際樣品進(jìn)行分析，藥物樣品中PRX的測(cè)定結(jié)果如表1所示?？梢钥闯?，本方法對(duì)PRX的加標(biāo)回收率在94.3%～103.3%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在2.69%～4.54%之間，表明該方法對(duì)于檢測(cè)實(shí)際樣品中的PRX具有一定的可行性。

表1藥物樣品中PRX的測(cè)定結(jié)果
Table1Determination results of PRX in pharmaceutical samples

樣品藥片含量(±SD)a/(10-6mol·L-1)加入含量a/(10-6mol·L-1)檢測(cè)含量(±SD)a/(10-6mol·L-1)回收率a/%相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=5)a/%110.9±1.0510.019.7±1.2694.32.69210.3±1.0220.031.3±0.88103.34.54310.6±1.03100.099.2±0.10598.53.72

注：回收率測(cè)定時(shí)要使被測(cè)PRX的含量在2×10-7～1.5×10-4mol/L范圍內(nèi)；a每一個(gè)數(shù)據(jù)平行測(cè)定3次；SD為標(biāo)準(zhǔn)差。

3 結(jié)論

通過簡(jiǎn)單的一步水熱法成功制備了硼氮共摻雜碳點(diǎn)B,N-CDs。采用B和N原子摻雜很大程度上改善了碳點(diǎn)的電子性質(zhì)和表面化學(xué)活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示B,N-CDs作熒光探針對(duì)PRX具有很高的靈敏度，其最低檢測(cè)限為5.7×10-8mol/L，這一結(jié)果優(yōu)于當(dāng)前的大多數(shù)PRX分析方法。因此，基于B,N-CDs構(gòu)建的PRX傳感器具有高選擇性、高靈敏性的優(yōu)點(diǎn)。同時(shí)，其在市售PRX藥物測(cè)定中的成功應(yīng)用，進(jìn)一步驗(yàn)證了該傳感器具有較好的應(yīng)用前景。