楊曉娟， 朱博蘭， 張 裕， 盧利霞， 惠 玲， 于曉輝， 任小龍

1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000；2.中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九四〇醫(yī)院消化科；3.甘肅省干細(xì)胞與基因藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是常見惡性腫瘤之一，近26年HCC的全球發(fā)病率增加了114%，其中乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)、丙型肝炎病毒和酒精是HCC的主要誘因。其中，HBV所致的HCC年估計(jì)百分比變化為0.22(95%CI：0.08～0.36)，提示HBV感染是HCC發(fā)生、發(fā)展的主要誘因[1]。HBV主要由核酸和衣殼組成，當(dāng)其進(jìn)入宿主細(xì)胞后在胞質(zhì)內(nèi)脫下衣殼蛋白，核酸則繼續(xù)進(jìn)入宿主細(xì)胞核并發(fā)生整合。HBV基因組的核心是4個(gè)開放的閱讀框S區(qū)、C區(qū)、P區(qū)和 X區(qū)。其中，C區(qū)是HBV發(fā)生基因突變的主要區(qū)域；P區(qū)可編碼多種功能性蛋白參與HBV 的復(fù)制；S區(qū)是表達(dá)HBV抗原進(jìn)而被宿主識(shí)別的主要部位；X區(qū)編碼乙肝病毒X蛋白(HBX)激活病毒或通過調(diào)控其他蛋白質(zhì)促進(jìn)HBV感染相關(guān)性HCC的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，HBV直接感染宿主肝細(xì)胞與其基因序列發(fā)生整合[2]，進(jìn)而迅速募集免疫細(xì)胞及具有免疫能力的細(xì)胞并產(chǎn)生各種細(xì)胞因子，共同參與HCC的形成[3]。在此過程中，信號(hào)通路的異常活化起到了重要作用?，F(xiàn)有大量研究提示，MAPK信號(hào)通路在HBV感染相關(guān)性HCC的發(fā)生中扮演了重要角色[4]，現(xiàn)對(duì)MAPK信號(hào)通路與HBV感染相關(guān)性HCC的研究進(jìn)展作一概述。

1 絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號(hào)通路的概述

MAPK家族，是一類由絲/蘇氨酸蛋白激酶組成的蛋白激酶系統(tǒng)。它包括細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2(extracellular regulated protein kinase 1/2，ERK1/2)、c-Jun氨基末端激酶(cJun-N-terminal kinase，JNKs)、p38MAPK和ERK5[5]。當(dāng)MAPK被級(jí)聯(lián)激活，可以調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化和凋亡等過程，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞生長狀態(tài)。許多實(shí)驗(yàn)研究表明，ERK1/2[6]、JNKs[7]和p38MAPK[8]在HBV感染相關(guān)性HCC發(fā)生中均發(fā)揮重要作用。ZAMANI等[9]通過比較高致瘤性Huh-7.4細(xì)胞與非致瘤性Huh-7.5細(xì)胞的蛋白質(zhì)組譜時(shí)，發(fā)現(xiàn)ERK5與 HCC的發(fā)生密切相關(guān)。但關(guān)于ERK5是如何影響HBV感染相關(guān)性HCC發(fā)生、發(fā)展的目前尚無研究報(bào)道。由此可以得出，MAPK信號(hào)通路的異常激活在HBV感染相關(guān)性HCC的進(jìn)程中發(fā)揮著舉足輕重的作用。

2 ERK1/2信號(hào)通路與HBV感染相關(guān)性HCC

目前，已知的ERK共有7種，其中與HBV感染相關(guān)性HCC關(guān)系最密切的是ERK1和ERK2。ERK1和ERK2是由相同基因編碼的蛋白質(zhì)，具有共同的底物，協(xié)同發(fā)揮作用。生長因子、生長因子受體結(jié)合蛋白和細(xì)胞外基質(zhì)等是ERK1/2信號(hào)通路常見的始動(dòng)因素，通過啟動(dòng)ERK1/2信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)而影響細(xì)胞的侵襲與遷移。多梳蛋白SUZ12是一種與HCC轉(zhuǎn)錄密切相關(guān)的蛋白質(zhì)，XUE等[10]發(fā)現(xiàn)，它可以通過ERK1/2信號(hào)通路影響HBV感染相關(guān)性HCC的形成。利用siRNA沉默HBV陽性的Hep3B肝癌細(xì)胞中 SUZ12，發(fā)現(xiàn)P-ERK1/2、基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)和MMP-2的表達(dá)均上調(diào)，促進(jìn)HCC細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移。提示SUZ12可能是通過ERK1/2信號(hào)通路影響HCC侵襲和遷移的。為了進(jìn)一步驗(yàn)證ERK1/2信號(hào)通路在HBV感染相關(guān)性HCC中的作用，向上述細(xì)胞中加入ERK1/2特異性抑制劑SCH772984，發(fā)現(xiàn)MMP-9和MMP-2的水平較前下調(diào)，這提示ERK1/2信號(hào)通路可能是通過調(diào)節(jié)MMP-9和MMP-2的表達(dá)進(jìn)而影響HBV感染相關(guān)性HCC的侵襲和遷移，說明ERK1/2信號(hào)通路與HBV感染相關(guān)性HCC的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。但HBV作為一個(gè)病毒，是如何通過ERK1/2信號(hào)通路促進(jìn)HBV感染相關(guān)性HCC的發(fā)展，仍需進(jìn)一步說明。

前面提到，HBV表達(dá)的HBX蛋白可以調(diào)控其他蛋白質(zhì)的磷酸化水平，進(jìn)而活化某些信號(hào)通路。由此推測(cè)，HBV可能是通過上調(diào)HBX蛋白的表達(dá)從而激活ERK1/2信號(hào)通路，促進(jìn)HBV感染相關(guān)性HCC的進(jìn)展。有研究報(bào)道[11],在過表達(dá)HBX的HepG2肝癌細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)HBX可以上調(diào)長鏈非編碼RNA lncIHS的水平、p-MEK1/2、p-ERK1/2、c-Myc和Cyclin D1的表達(dá)，提示HBX蛋白可能是通過ERK1/2信號(hào)通路促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移。隨后，利用MEK1/2抑制劑U0126處理上述肝癌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)隨著ERK1/2信號(hào)通路被抑制，c-Myc、Cyclin D1和HBX蛋白[6]等的磷酸化水平降低，肝癌細(xì)胞發(fā)生的增殖、侵襲和遷移在一定程度上被逆轉(zhuǎn)，HBV的復(fù)制也明顯減慢。由此可知，ERK1/2信號(hào)通路可以上調(diào)調(diào)控c-Myc、Cyclin D1和HBX蛋白等的磷酸化水平，促進(jìn)HBV感染相關(guān)性HCC的發(fā)展。前面提到HBV感染相關(guān)性HCC的發(fā)生與HBV感染、宿主免疫系統(tǒng)異常均密切相關(guān)。因此，我們推測(cè)ERK1/2信號(hào)通路也可以通過影響宿主免疫微環(huán)境進(jìn)而影響HBV感染相關(guān)性HCC的進(jìn)程。Toll樣受體4 (toll-like receptor 4，TLR4)可以將非特異性免疫和特異性免疫連接起來，發(fā)揮機(jī)體免疫功能。有研究表明，TLR4與HBV感染相關(guān)性HCC預(yù)后相關(guān)[12]。利用siRNA技術(shù)沉默HBV陽性的Hep3B肝癌細(xì)胞中的TLR4，發(fā)現(xiàn)ERK1/2和c-Fos蛋白的磷酸化下調(diào)并誘導(dǎo)G2/M細(xì)胞周期停滯和凋亡[13]從而抑制肝癌細(xì)胞增殖。這提示TLR4識(shí)別HBV，進(jìn)而通過活化ERK1/2信號(hào)通路，促進(jìn)了HCC的發(fā)生與發(fā)展。由此可知，ERK1/2信號(hào)通路通過調(diào)控HBX的蛋白、HBV的復(fù)制和宿主免疫微環(huán)境等方面，進(jìn)而影響肝癌細(xì)胞。

3 JNKs信號(hào)通路與HBV感染相關(guān)性HCC

JNKs是由JNK1、JNK2和JNK3基因編碼成的c-Jun氨基末端激酶，也被稱為應(yīng)激活化蛋白激酶(stress-activated protein kinase，SAPK)。促炎因子和應(yīng)激反應(yīng)等均可活化JNKs，進(jìn)而上調(diào)c-Jun、Jund及p53等的表達(dá)，發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。HU等[8]將JNKs抑制劑SP600125與攜帶有HBV病毒的肝癌細(xì)胞共培養(yǎng)后，發(fā)現(xiàn)JNKs、c-Jun和自噬相關(guān)蛋白等的表達(dá)均有下調(diào)，可見JNKs級(jí)聯(lián)途徑能通過促進(jìn)肝癌細(xì)胞自噬，進(jìn)而參與HBV感染相關(guān)性HCC的癌變進(jìn)程。SP600125是非特異性JNKs抑制劑，可使3種基因型JNKs的表達(dá)均下調(diào)，那么不同基因型的JNKs對(duì)HBV感染相關(guān)性HCC的影響是否也有不同。LIU等[14]發(fā)現(xiàn)，下調(diào)HBV陽性的PLC /PRF肝癌細(xì)胞中JNK1/2和p-JNK1/2表達(dá)，通過免疫熒光法檢測(cè)到肝癌細(xì)胞內(nèi)MMP2的分泌和運(yùn)輸受阻，進(jìn)而抑制肝癌細(xì)胞的增殖和侵襲。因此，JNK1/2信號(hào)通路可能是通過調(diào)控HBV感染相關(guān)性肝癌細(xì)胞中MMP2的分泌及功能從而抑制肝癌細(xì)胞增殖和侵襲。雖然目前關(guān)于JNK3直接影響HBV感染相關(guān)性HCC發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制尚無研究報(bào)道，但關(guān)于JNKs信號(hào)通路在HBV感染相關(guān)性肝癌病程中的重要性毋庸置疑。

LI等[15]在HBV陽性的Hep AD38細(xì)胞中通過Western boltting發(fā)現(xiàn)，HBV的復(fù)制水平與JNKs、p-JNK的表達(dá)呈正相關(guān)。抑制HBV轉(zhuǎn)基因型小鼠體內(nèi)JNKs信號(hào)通路活化，可在一定程度減緩HBV復(fù)制[16]。這些結(jié)果均提示，JNKs信號(hào)通路參與并促進(jìn)HBV復(fù)制這一過程。HBV感染是HBV感染相關(guān)性HCC的基礎(chǔ)環(huán)節(jié)，有效抑制病毒復(fù)制、控制病毒數(shù)量是延緩HBV感染相關(guān)性HCC進(jìn)展的主要措施，JNKs信號(hào)途徑在其中有重要意義。HAGIWARA等[17]在HBV感染相關(guān)性HCC患者肝癌組織中發(fā)現(xiàn)HBX高表達(dá)，且部分HBX基因型發(fā)生了突變，利用HBX基因突變型小鼠進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)HBX基因突變型小鼠體內(nèi)JNKs信號(hào)途徑的轉(zhuǎn)錄活性明顯升高，被誘導(dǎo)發(fā)生HCC的幾率更大。為了進(jìn)一步明確HBX基因與JNKs信號(hào)通路的關(guān)系，以C-末端截短的HBX轉(zhuǎn)基因型小鼠為模型，發(fā)現(xiàn)高表達(dá)的HBX蛋白上調(diào)IL-1和TNF-α表達(dá)，并進(jìn)一步活化JNKs和ERK1/2信號(hào)通路，誘導(dǎo)HBV感染相關(guān)性HCC的形成[18]?？梢娡蛔冃虷BX參與HBV感染相關(guān)性HCC的過程，可能是通過上調(diào)某些炎癥因子表達(dá)進(jìn)而激活JNKs信號(hào)通路來實(shí)現(xiàn)。但WU等[19]通過培養(yǎng)穩(wěn)定表達(dá)HBX的Hep3B-HBX肝癌細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)HBX可以激活JNKs/pSMAD3L信號(hào)傳導(dǎo)，可能是通過抑制TGF-β的生物學(xué)活性并上調(diào)c-Myc表達(dá)水平，進(jìn)而達(dá)到促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖的目的。隨后，利用JNKs抑制劑SP600125處理Hep3B-HBX肝癌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)TGF-β功能恢復(fù)且TGF-β/SMAD信號(hào)傳導(dǎo)途徑被激活，從而抑制c-Myc表達(dá)以此實(shí)現(xiàn)抑制肝癌細(xì)胞增殖的目的。在此過程中，HBX是通過激活JNKs級(jí)聯(lián)反應(yīng)并抑制細(xì)胞因子功能,進(jìn)而影響HBV感染相關(guān)性HCC的發(fā)生。

4 p38MAPK信號(hào)通路與HBV感染相關(guān)性HCC

目前已知的p38MAPK異構(gòu)體有5個(gè)，包括p38α、p38β1、p38β2、p38γ和p38δ，其中研究最清楚異構(gòu)體的是p38α也稱為p38，活化的p38MAPK信號(hào)通路可以參與應(yīng)激反應(yīng)和免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)過程[20]。HU等[8]研究發(fā)現(xiàn)，三聯(lián)基序蛋白7(TRIM7)在肝癌組織中高表達(dá)且HBX能上調(diào)肝癌細(xì)胞中TRIM7表達(dá)，隨后利用siRNA沉默HBV陽性的肝癌細(xì)胞中TRIM7，發(fā)現(xiàn)p38α、p-p38α的表達(dá)下調(diào)，p53和p21表達(dá)則明顯增強(qiáng)。由此可見，在HBV感染相關(guān)性肝癌細(xì)胞中，HBX可以激活p38α、p38MAPK信號(hào)通路促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖。

大量研究結(jié)果表明，p38MAPK信號(hào)通路與HBV感染相關(guān)性HCC密切相關(guān)。YANG等[21]通過免疫熒光法觀察HBV感染早期的HepG2-NTCP肝癌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)p38MAPK、p-p38MAPK和信號(hào)傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)表達(dá)明顯增強(qiáng)，HBV復(fù)制和肝癌細(xì)胞增殖均明顯增加。HBV感染晚期，p38MAPK與細(xì)胞分化調(diào)節(jié)因子HoxA10結(jié)合迅速募集酪氨酸磷酸酶SHP-1，促進(jìn)p38MAPK/ STAT3的去磷酸化，減緩HBV復(fù)制和肝癌細(xì)胞增殖?？梢妏38MAPK在HBV感染相關(guān)性HCC中有何種作用，與感染HBV的時(shí)間長短密切相關(guān)。TIAN等[6]干擾穩(wěn)定表達(dá)HBX蛋白的Huh7-X和HepG2-X肝癌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)酪氨酸激酶受體EphA2水平升高且特異性激活p38MAPK 和ERK1/2信號(hào)通路，p-p38MAPK/p38MAPK、(p-ERK 1/2)/ERK1/2水平均明顯升高。該結(jié)果進(jìn)一步印證了p38MAPK在HBV感染相關(guān)性HCC進(jìn)程中的作用，提示HBX可以通過上調(diào)EphA2表達(dá)激活p38MAPK信號(hào)通路，促進(jìn)HBV感染相關(guān)性HCC的進(jìn)展。HBX還可以通過將p38MAPK通路與其他信號(hào)通路串?dāng)_從而調(diào)控HBV感染相關(guān)性HCC的進(jìn)程。AHODANTIN等[22]構(gòu)建HBx轉(zhuǎn)基因小鼠并誘導(dǎo)其發(fā)生肝癌，在誘發(fā)肝癌后的第15～17天內(nèi)發(fā)現(xiàn)p38MAPK和ERK1/2表達(dá)水平同時(shí)升高，考慮可能是通過p38/ERK1/2信號(hào)通路促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖。為了驗(yàn)證這一結(jié)論，利用p38MAPK抑制劑SB203508治療小鼠后，發(fā)現(xiàn)p38MAPK和ERK1/2表達(dá)均明顯降低，肝癌細(xì)胞增殖明顯被抑制。這一研究結(jié)果揭示了p38/ERK1/2信號(hào)通路串?dāng)_在HBV感染相關(guān)性HCC的重要性。GAO等[23]將HBX的cDNA片段插入HepG2肝癌細(xì)胞中構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HepG2X細(xì)胞，用RT-PCR檢測(cè)HepG2X細(xì)胞中某些受體的轉(zhuǎn)錄水平，與HepG2組比較發(fā)現(xiàn)Notch1水平明顯上調(diào)。利用p38抑制劑SB203580與HepG2X共培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，Notch1表達(dá)顯著下調(diào)。由此推斷，HBX通過激活p38MAPK信號(hào)通路上調(diào)Notch1的表達(dá)，進(jìn)一步激活Notch信號(hào)通路促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖和抑制其凋亡。綜上可知，HBX可以激活p38MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)，促進(jìn)HBV感染相關(guān)性HCC的發(fā)生、發(fā)展。

5 其他因素與HBV感染相關(guān)性HCC

除MAPK信號(hào)通路外還有其他信號(hào)通路也參與了HBV感染相關(guān)性HCC的形成。如ZHENG等[24]在HBV感染相關(guān)性HCC患者組織中檢測(cè)到SH2D5蛋白的表達(dá)明顯升高，隨后在HBV 陽性的HepG2.2.15 肝癌細(xì)胞發(fā)現(xiàn)HBX通過NF-κB信號(hào)促進(jìn)SH2D5表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖。ZHENG等[25]在穩(wěn)定表達(dá)HBX的肝癌細(xì)胞HL-7702-HBX中發(fā)現(xiàn)HBX通過激活COX-2 / Wnt β信號(hào)通路上調(diào)原癌基因cyclin-D1和c-Myc的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖。LI等[26]在穩(wěn)定表達(dá)HBX的肝癌細(xì)胞HepG2-HBX中發(fā)現(xiàn)當(dāng)，HBX的表達(dá)下調(diào)，SHH信號(hào)通路中的hedgehog基因(SHH)、跨膜受體 (pch -1)和癌基因同源轉(zhuǎn)錄因子(gli)等表達(dá)均受到抑制，進(jìn)而抑制肝癌細(xì)胞增。由此可知，HBX可以通過HBX/SHH級(jí)聯(lián)反應(yīng)抑制肝癌細(xì)胞增殖。HBX不僅可以激活MAPK信號(hào)通路誘導(dǎo)HBV感染相關(guān)性HCC的發(fā)生、發(fā)展，也可以活化其他信號(hào)通路來實(shí)現(xiàn)這一過程。HBX在HBV感染相關(guān)性HCC的發(fā)生中占有舉足輕重的地位，但HBV的其他基因片段也可以影響HBV感染相關(guān)性HCC的進(jìn)程。楊春霞等[27]收集臨床HBV感染相關(guān)性HCC患者肝組織和血清用核酸擴(kuò)增熒光定量及測(cè)序法檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)HBV基因型、變異位點(diǎn)1762/1764和1896、HBX之間存在相互關(guān)系，且與HCC的發(fā)生與發(fā)展有關(guān)。SONG等[28]利用siRNA技術(shù)沉默HBV相關(guān)性HCC細(xì)胞系中的S基因，發(fā)現(xiàn)白細(xì)胞介素-6的表達(dá)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(Stat3)磷酸化水平均下調(diào)，進(jìn)而抑制肝癌細(xì)胞的增殖，揭示了HbsAg可能是通過IL-6/Stat3信號(hào)通路誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞增殖。由此可知，HBV基因組中的不同基因片段可以通過活化不同的信號(hào)通路影響HBV感染相關(guān)性HCC的發(fā)生、發(fā)展。

綜上所述，MAPK信號(hào)通路的活化在HBV感染相關(guān)性HCC的發(fā)生過程中發(fā)揮著重要作用。其中，ERK1/2信號(hào)通路主要促進(jìn)肝癌細(xì)胞的侵襲和遷移、JNKs和p38MAPK信號(hào)通路則主要影響肝癌細(xì)胞的自噬和凋亡。雖然MAPK家族中各亞通路均可從不同的方面調(diào)控HBV感染相關(guān)性HCC的發(fā)生、發(fā)展，但每條亞通路的功能并不是完全獨(dú)立的，它們之間相互調(diào)節(jié)形成復(fù)雜的信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)并影響HBV感染相關(guān)性HCC的進(jìn)程。如前文提到的p38/ERK1/2信號(hào)通路信號(hào)通路可顯著促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖。由此可以推測(cè)，通過信號(hào)通路之間相互串聯(lián)、互相作用，可以進(jìn)一步放大某些細(xì)胞因子并促進(jìn)HBV感染相關(guān)性HCC的進(jìn)展。因此，尋找信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵信號(hào)通路并加以阻斷，從而影響某些關(guān)鍵細(xì)胞因子的合成和分泌，這將為攻克HBV感染相關(guān)性HCC提供新思路。