姚 峻 張文舉 劉孟健 鄭新霞 盧奇成

（石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆石河子832000）

近年來由于使用抗生素等藥物性飼料添加劑的弊端日益凸顯，人們將目光投向了無毒、無殘留及無抗藥性的益生菌制劑的研究與利用。目前，益生菌作為綠色飼料添加劑已被廣泛使用，菌種主要有乳酸菌、芽孢桿菌和酵母菌[1]。其中，芽孢桿菌是一類能在逆境下形成休眠體芽孢以抵抗不良環(huán)境的革蘭氏陽性桿菌[2]。芽孢桿菌具有抗逆性強(qiáng)、營養(yǎng)要求簡單等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)在應(yīng)用的安全性、廣譜抗菌活性、穩(wěn)定性及分子加工易操作性等方面具有獨(dú)特的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)[3-5]。本試驗(yàn)主要根據(jù)益生菌的生物學(xué)特性，以7株芽孢桿菌為研究對(duì)象，通過抑制大腸桿菌能力為主要評(píng)價(jià)指標(biāo)，輔以產(chǎn)酶特性及對(duì)人工胃液、人工腸液的耐受性進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，篩選出效果最優(yōu)的芽孢桿菌，并進(jìn)一步通過紫外誘變的方法提高其抑制大腸桿菌的能力[6-8]，以期獲得生產(chǎn)性能更佳的菌株，為芽孢桿菌的新型飼料微生態(tài)制劑產(chǎn)品的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌種：大腸桿菌K99由石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院提供?？莶菅挎邨U菌、地衣芽孢桿菌、納豆芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、側(cè)孢芽孢桿菌由中糧（昌吉）糧油工業(yè)有限公司研發(fā)中心饋贈(zèng)。

1.2 主要儀器與設(shè)備

立式高壓蒸汽滅菌器、超凈工作臺(tái)、pH 計(jì)、菌落計(jì)數(shù)儀、高速離心機(jī)、恒溫水浴鍋、紫外分光光度計(jì)、磁力攪拌器、分析天平。

1.3 培養(yǎng)基

LB 培養(yǎng)基（g/l）：NaCl 10，酵母粉5，蛋白胨10，pH值7.0～7.2。

發(fā)酵培養(yǎng)基（g/l）：豆粕20、玉米粉30、葡萄糖5、蛋白胨2、NaCl 2、KH2PO41.5、K2HPO41.5、（NH4）2SO40.3、CaCl20.3、MnSO40.1、吐溫-80 0.3、MgSO40.6，pH值8.0。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 芽孢桿菌發(fā)酵液的制備

將7株芽孢桿菌的菌種分別接種到液體LB 培養(yǎng)基中進(jìn)化活化，調(diào)整搖床溫度至37 ℃，180 r/min搖床培養(yǎng)24 h，活化后的芽孢桿菌按3%（V/V）接種入發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)，在37 ℃，180 r/min 條件下?lián)u床培養(yǎng)24 h后，取培養(yǎng)液10 ml，4 000 r/min 離心15 min，將上清液用0.2 μm無菌濾膜過濾得到無菌體發(fā)酵液。

1.4.2 體外抑菌試驗(yàn)

芽孢桿菌對(duì)大腸桿菌K99體外抑菌定性實(shí)驗(yàn)（抑菌圈試驗(yàn)）：往已冷卻至50 ℃左右的300 ml 的LB 瓊脂培養(yǎng)基中加入活化后的5 ml大腸桿菌菌液，迅速混勻，然后傾注無菌平板，水平靜置待凝固后備用，每個(gè)處理分別重復(fù)3 次。將固體LB 平板分為均勻的8 塊區(qū)域，用1 ml 槍頭在試驗(yàn)平板上打8 個(gè)孔，孔直徑約10 mm。用鑷子小心挑去培養(yǎng)基小塊以做成圓孔，往孔中注入7株芽孢桿菌的200 μl無菌體發(fā)酵液（對(duì)照組加等量滅菌發(fā)酵培養(yǎng)基），放置37 ℃培養(yǎng)24 h。如果芽孢桿菌的無菌體發(fā)酵液對(duì)大腸桿菌有抑制作用，將在接種發(fā)酵液周圍出現(xiàn)無大腸桿菌生長的現(xiàn)象，出現(xiàn)明顯的抑菌圈，統(tǒng)計(jì)抑菌圈的直徑[9]。

芽孢桿菌對(duì)大腸桿菌K99體外抑菌定量實(shí)驗(yàn)：往已冷卻至50 ℃左右的300 ml 的LB 瓊脂培養(yǎng)基中加入活化后的5 ml大腸桿菌菌液及30 ml的無菌體發(fā)酵液（對(duì)照組加等量的滅菌發(fā)酵培養(yǎng)基），迅速混勻，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h，在菌落計(jì)數(shù)儀上計(jì)數(shù)，每個(gè)處理分別重復(fù)3次。

抑制率(%)=（芽孢組菌落數(shù)-對(duì)照組菌落數(shù)）/對(duì)照組菌落數(shù)×100

1.4.3 粗酶液的制備

7 株芽孢桿菌的菌種分別接種到液體LB 培養(yǎng)基中進(jìn)化活化，調(diào)整搖床溫度至37 ℃，180 r/min搖床培養(yǎng)24 h，活化后的芽孢桿菌按3%（v/v）接種入發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)，調(diào)整搖床溫度至37 ℃，180 r/min 搖床培養(yǎng)48 h 后，取培養(yǎng)液5 000 r/min，4 ℃離心20 min，離心取上清液，再用pH 值6.7 磷酸緩沖液稀釋適當(dāng)倍數(shù)，6 500 r/min，4 ℃離心5 min，吸取上清液待測(cè)酶活。

1.4.4 蛋白酶活力的測(cè)定

參照國標(biāo)GB/T 23527—2009《蛋白酶制劑》中附錄B《蛋白酶活力的測(cè)定福林法》[10]。

1.4.5 淀粉酶活力、脂肪酶的測(cè)定

按照淀粉酶、脂肪酶檢測(cè)試劑盒（購自南京建成生物工程研究所，中國）的使用說明檢測(cè)。

1.4.6 纖維素酶活力的測(cè)定

參照NY/T 912—2004《纖維素酶制劑》中CMCNa DNS法纖維素酶活的檢測(cè)方法[11]。

1.4.7 耐人工胃液能力測(cè)定

從7株芽孢桿菌的LB斜面，接種一環(huán)于裝有50 ml的LB培養(yǎng)液的250 ml三角瓶中，于pH=3的人工胃液中，搖勻后，放入37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中，于120 min后取出相應(yīng)試管，搖勻后10倍梯度稀釋，從適當(dāng)梯度的稀釋液中，吸20 μl 涂板于培養(yǎng)基，放置15 min，于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。用菌落計(jì)數(shù)儀進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.4.8 耐人工腸液能力測(cè)定

從7株芽孢桿菌的LB斜面，接種一環(huán)于裝有50 ml的LB培養(yǎng)液的250 ml三角瓶中，于37 ℃下180 r/min培養(yǎng)24 h。取各個(gè)菌株培養(yǎng)液各3 ml，加入到pH=6.8的人工腸液中，搖勻后，放入37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中，于120 min 后取出相應(yīng)試管，搖勻后10 倍梯度稀釋，從適當(dāng)梯度的稀釋液中，吸20 μl涂板于培養(yǎng)基，放置15 min，于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。用菌落計(jì)數(shù)儀進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.4.9 紫外誘變育種

取培養(yǎng)24 h的出發(fā)菌株斜面，用接種環(huán)調(diào)取1環(huán)置于含有100 ml無菌生理鹽水的三角瓶中，180 r/min振蕩30 min，將其稀釋至1×108個(gè)/ml，備用。先打開超凈工作臺(tái)中20 W紫外燈預(yù)照30 min，以穩(wěn)定光線；取0.1 ml 菌懸液均勻涂布于LB 營養(yǎng)瓊脂平板上；然后取各組平板依次放在紫外燈垂直下方20 cm 處進(jìn)行紫外線誘變，照射時(shí)間為0、20、40、60、80、100、120、140 s。取紫外誘變后的菌液用無菌生理鹽水以10倍稀釋法進(jìn)行梯度稀釋，并取三個(gè)連續(xù)梯度10-3、10-4、10-5的菌液各0.1 ml涂布于LB瓊脂培養(yǎng)基，將涂布好的培養(yǎng)基用滅菌后的牛皮紙包好并裝在黑色塑料袋中，避免光照，置37 ℃條件下培養(yǎng)24 h。以未經(jīng)照射的菌液涂布的平板為對(duì)照，測(cè)定細(xì)胞的致死率。選擇致死率在70%～80%左右的照射時(shí)間作為誘變處理時(shí)間。以最佳誘變處理時(shí)間對(duì)巨大芽孢桿菌進(jìn)行紫外誘變后，取稀釋后的菌液0.1 ml 涂布于LB 瓊脂培養(yǎng)基，將涂布好的LB 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基用滅菌后的牛皮紙包好并裝在黑色塑料袋中，避免光照，置37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。待菌落長出后，將所有平板上所有菌株轉(zhuǎn)接到LB 斜面培養(yǎng)基，置37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。從培養(yǎng)后的斜面上取菌苔一環(huán)接入LB液體培養(yǎng)基中，活化兩代。將活化后的菌株接種到發(fā)酵培養(yǎng)基管（20 ml/管），接種量為3%（V/V）。將發(fā)酵試管置于37 ℃搖床中180 r/min 培養(yǎng)24 h。發(fā)酵結(jié)束后，離心過濾后獲取無菌體體發(fā)酵液，再進(jìn)行大腸桿菌K99體外抑菌定量實(shí)驗(yàn)，獲得對(duì)大腸桿菌K99抑制率最高的誘變菌株。

由于經(jīng)過紫外線誘變的菌株會(huì)在自身的修復(fù)作用下產(chǎn)生回復(fù)突變，所以為保證篩選的突變菌株有很好的穩(wěn)定性，要進(jìn)行傳代實(shí)驗(yàn)以檢驗(yàn)其性能。將篩選出的突變菌株連續(xù)培養(yǎng)5代進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，測(cè)定對(duì)大腸桿菌K99的抑菌率，評(píng)價(jià)突變菌株的遺傳性狀穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 芽孢桿菌體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果

芽孢桿菌對(duì)大腸桿菌K99 抑菌試驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。7株芽孢桿菌的發(fā)酵液對(duì)大腸菌K99的抑菌圈直徑的大小依次排序?yàn)椋壕薮笱挎邨U菌＞側(cè)孢芽孢桿菌＞枯草芽孢桿菌＞地衣芽孢桿菌＞納豆芽孢桿菌＞凝結(jié)芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌，其中巨大芽孢桿菌抑菌圈直徑最大，達(dá)到17.68 mm，側(cè)孢芽孢桿菌次之，達(dá)到17.02 mm，而凝結(jié)芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌組并未出現(xiàn)明顯的抑菌圈，可能是由于這2株菌產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)過少或者產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)對(duì)大腸桿菌K99 無顯著抑制作用，導(dǎo)致未產(chǎn)生明顯的抑菌圈。

圖1 芽孢桿菌發(fā)酵液抑菌試驗(yàn)效果

表1結(jié)果顯示：芽孢桿菌對(duì)大腸桿菌K99的抑菌圈直徑與抑菌率成正比，說明抑菌圈法與抑菌率檢測(cè)法都能較準(zhǔn)確的反應(yīng)芽孢桿菌的抑菌性能，并且2種檢測(cè)方法相關(guān)性較強(qiáng)。

2.2 芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶試驗(yàn)結(jié)果

芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶的能力如表2所示。7株芽孢桿菌均能產(chǎn)生一定的蛋白酶，但產(chǎn)生的蛋白酶的種類和數(shù)量有所不同，總蛋白酶活力從大到小依次為：枯草芽孢桿菌＞巨大芽孢桿菌＞地衣芽孢桿菌＞凝結(jié)芽孢桿菌＞蠟樣芽孢桿菌＞側(cè)孢芽孢桿菌，總酶活力最高的為枯草芽孢桿菌，達(dá)到305.99 U/ml，其次為巨大芽孢桿菌，達(dá)到278.76 U/ml，總蛋白酶活力較低的是納豆芽孢桿菌、側(cè)孢芽孢桿菌。有趣的是，巨大芽孢桿菌并不產(chǎn)生堿性蛋白酶，但卻能產(chǎn)生大量的酸性蛋白酶、中性蛋白酶，使得其總酶活力較高。

表1 芽孢桿菌發(fā)酵液的抑菌圈直徑統(tǒng)計(jì)

表2 芽孢桿菌的產(chǎn)蛋白酶能力統(tǒng)計(jì)(U/ml)

2.3 芽孢桿菌產(chǎn)淀粉酶、產(chǎn)脂肪酶、產(chǎn)纖維素酶試驗(yàn)結(jié)果

芽孢桿菌產(chǎn)淀粉酶、產(chǎn)脂肪酶、纖維素酶的能力如表3 所示。7 株芽孢桿菌的淀粉酶活力從大到小依次為：巨大芽孢桿菌＞枯草芽孢桿菌＞蠟樣芽孢桿菌＞凝結(jié)芽孢桿菌＞側(cè)孢芽孢桿菌＞地衣芽孢桿菌＞納豆芽孢桿菌，淀粉酶活力最高的為巨大芽孢桿菌，達(dá)到45.28 U/ml，其次為枯草芽孢桿菌，達(dá)到42.96 U/ml，淀粉酶活力較低的是地衣芽孢桿菌、納豆芽孢桿菌。

表3 芽孢桿菌的產(chǎn)淀粉酶、產(chǎn)脂肪酶、產(chǎn)纖維素酶能力統(tǒng)計(jì)(U/ml)

芽孢桿菌的脂肪酶活力從大到小依次為：地衣芽孢桿菌＞枯草芽孢桿菌＞納豆芽孢桿菌＞凝結(jié)芽孢桿菌＞巨大芽孢桿菌＞側(cè)孢芽孢桿菌＞蠟樣芽孢桿菌，脂肪酶活力最高的為地衣芽孢桿菌，達(dá)到28.36 U/ml，其次為枯草芽孢桿菌，達(dá)到22.79 U/ml，脂肪酶活力較低的是蠟樣芽孢桿菌，其幾乎不產(chǎn)脂肪酶。

芽孢桿菌的纖維素酶活力從大到小依次為：枯草芽孢桿菌＞地衣芽孢桿菌＞巨大芽孢桿菌＞蠟樣芽孢桿菌＞側(cè)孢芽孢桿菌＞納豆芽孢桿菌＞凝結(jié)芽孢桿菌，纖維素酶活力最高的為枯草芽孢桿菌，達(dá)到22.72 U/ml，其次為地衣芽孢桿菌，達(dá)到18.41 U/ml，纖維素活力較低的是納豆芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌。

2.4 芽孢桿菌對(duì)人工胃液的耐受性

芽孢桿菌的人工胃液耐受能力如圖2 所示。地衣芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌在pH=3的人工胃液中不但不致死，還能夠繁殖，說明這幾株芽孢桿菌具有極強(qiáng)的耐酸能力；納豆芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌的耐酸性也比較強(qiáng)，達(dá)到了90%以上；耐酸性最弱的為側(cè)孢芽孢桿菌，存活率為85.26%。

圖2 芽孢桿菌對(duì)人工胃液的耐受能力統(tǒng)計(jì)

2.5 芽孢桿菌對(duì)人工腸液的耐受性

芽孢桿菌的人工腸液耐受能力如圖3 所示。巨大芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌在pH=6.9 的人工腸液中存活率達(dá)到90%以上。蠟樣芽孢桿菌、納豆芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌的人工腸液中存活率達(dá)到80%以上。人工腸液耐受性最差的是側(cè)孢芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌，兩者的存活率不足70%。

圖3 芽孢桿菌對(duì)人工腸液的耐受能力統(tǒng)計(jì)

根據(jù)檢測(cè)結(jié)果綜合分析，在本次研究的7 株菌中，巨大芽孢桿菌表現(xiàn)出最強(qiáng)的抑制大腸桿菌能力與較強(qiáng)的產(chǎn)酶特性及人工胃液、人工腸液的耐受性，其作為新型飼料微生態(tài)制劑的開發(fā)潛力較大，所以最終選擇巨大芽孢桿菌作為紫外誘變育種的研究對(duì)象，對(duì)其主要評(píng)價(jià)指標(biāo)抑制大腸桿菌的能力進(jìn)行優(yōu)化。

2.6 紫外誘變結(jié)果

2.6.1 紫外照射時(shí)間對(duì)巨大芽孢桿菌致死率的影響

圖4 紫外照射時(shí)間與巨大芽孢桿菌致死率曲線

由圖4 可知，當(dāng)紫外照射時(shí)間為80 s 時(shí)，巨大芽孢桿菌的致死率為78.15%，由于菌體致死率在70%至80%之間可能獲得較高的正向突變率。所以，選擇照射時(shí)間80 s為最佳誘變時(shí)間。

2.6.2 紫外誘變后菌株的篩選

由表4可知，巨大芽孢桿菌紫外誘變后獲得的28株菌中有2 株菌的抑菌率高于原始菌株，正突變率為7.14%。這兩株菌分別是UV-9和UV-26。菌株UV-9的抑菌率為88.39%，比原始菌株巨大芽孢桿菌的抑菌率提高了3.63個(gè)百分點(diǎn)，菌株UV-26的抑菌率為90.92%，比原始巨大芽孢桿菌的抑菌率提高了6.16個(gè)百分點(diǎn)。

表4 紫外誘變后各菌株的抑菌率

2.6.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

由表5 可知，傳代5 次后UV-26 菌株抑制大腸桿菌K99的能力基本保持穩(wěn)定，同時(shí)UV-26菌株除了產(chǎn)纖維素酶能力比出發(fā)菌株略有降低外，其產(chǎn)蛋白酶能力、產(chǎn)淀粉酶能力、產(chǎn)脂肪酶能力、耐人工胃液、耐人工腸液的能力相比出發(fā)菌株都略有提高，且基本保持穩(wěn)定。由此可見，紫外誘變后突變菌株UV-26獲得的優(yōu)良性狀基本可穩(wěn)定遺傳。

表5 菌株UV-26的傳代穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

本研究結(jié)果表明，7 種芽孢桿菌各自具有不同的生物學(xué)特性：巨大芽孢桿菌、側(cè)孢芽孢桿菌具有較強(qiáng)的抑制大腸桿菌的能力，蛋白酶總活力最高的是枯草芽孢桿菌，淀粉酶活力最高的是巨大芽孢桿菌，脂肪酶活力最高的是地衣芽孢桿菌，纖維素酶活力最高的是枯草芽孢桿菌，耐人工胃酸能力最強(qiáng)的是地衣芽孢桿菌，耐人工腸液能力最強(qiáng)的是凝結(jié)芽孢桿菌。因此要根據(jù)芽孢桿菌的不同特性，在生產(chǎn)應(yīng)用上各有側(cè)重。在應(yīng)用芽孢桿菌制劑時(shí)，可以根據(jù)實(shí)際生產(chǎn)中的不同要求，選育具有不同優(yōu)良特性的芽孢桿菌菌株，如強(qiáng)抑制病原菌芽孢桿菌株、高產(chǎn)蛋白酶菌株、高產(chǎn)淀粉酶菌株、高產(chǎn)脂肪酶菌株、高產(chǎn)纖維素酶菌株、耐人工胃酸菌株及耐人工腸液菌株等。通過本次研究綜合分析，巨大芽孢桿菌在7 株菌中，抑制大腸桿菌能力最強(qiáng)，產(chǎn)酶特性及耐人工胃液、腸液的能力也較強(qiáng)，具有作為新型飼料微生態(tài)制劑產(chǎn)品的開發(fā)潛力。今后，除了繼續(xù)在高產(chǎn)菌株篩選、誘變育種方面深入研究外，還應(yīng)利用基因工程技術(shù)，有針對(duì)性的對(duì)芽孢桿菌的抗菌基因進(jìn)行克隆，使巨大芽孢桿菌菌株抑制病原菌的能力得到最大幅度的突破和提高。

4 結(jié)論

①巨大芽孢桿菌在7株菌中，抑制大腸桿菌K99的能力最強(qiáng)，產(chǎn)酶特性及耐人工胃液、腸液的能力也較強(qiáng)，綜合評(píng)定生物學(xué)特性最優(yōu)。

②進(jìn)一步對(duì)此株巨大芽孢桿菌進(jìn)行紫外線誘變處理，在處理時(shí)間為80 s時(shí)篩選得到1株抑制大腸桿菌效果最好的菌株UV-26，其抑菌率可達(dá)90.92%，比出發(fā)菌的抑菌率提高了6.16 個(gè)百分點(diǎn)，經(jīng)傳代、發(fā)酵試驗(yàn)證明其遺傳性狀穩(wěn)定，適合用于新型微生態(tài)制劑產(chǎn)品的研發(fā)。