宋寧,劉語(yǔ),劉錚錚,楊廣德

(西安交通大學(xué)藥學(xué)院，西安 710061)

枇杷葉為薔薇科植物枇杷[Eriobotryajaponica(Thunb.) Lindl.]的干燥葉，又名巴葉，是臨床上常用的一味傳統(tǒng)中藥，具有清肺止咳，降逆止嘔的功效[1]。《本草綱目》記載：“枇杷葉，治肺胃之病，大都取其下氣之功耳。氣下則火降痰順，而逆者不逆，嘔者不嘔，渴者不渴，咳者不咳矣?！币延醒芯勘砻?，枇杷葉中主要含有揮發(fā)油、三萜類、倍半萜類、多酚、黃酮類等化學(xué)成分，具有抗炎止咳、降血糖、抗病毒、抗氧化、抗腫瘤等藥理活性[2]。目前有關(guān)枇杷葉化學(xué)成分的研究主要集中在對(duì)其多糖、黃酮類、多酚類物質(zhì)、三萜酸類等幾類化合物的提取分離工藝及抗氧化等生物活性方面[3-6]，而對(duì)于其揮發(fā)油化合物分析鑒定方面鮮有研究報(bào)道。同時(shí)，枇杷葉作為肺胃之藥，其揮發(fā)性成分可直接隨空氣吸入肺部，起效迅速，對(duì)治療咳嗽、嘔吐等疾病有重要作用，具有很高的藥用價(jià)值。因此，本實(shí)驗(yàn)采用揮發(fā)油提取器法，提取新鮮枇杷葉中揮發(fā)油，并通過(guò)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法進(jìn)行成分分析，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用枇杷葉揮發(fā)油的藥用價(jià)值提供科學(xué)依據(jù)。

β-葡萄糖苷酶是一種能催化水解芳基或烴基與糖基原子團(tuán)之間的糖苷鍵生成葡萄糖的酶[7]，能水解水果、茶葉中的香氣前體物——糖苷，釋放出揮發(fā)性糖苷配基，用以增強(qiáng)果酒、果汁、茶葉等的香氣[8-9]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)比加入β-葡萄糖苷酶前后新鮮枇杷葉化學(xué)成分變化，以驗(yàn)證β-葡萄糖苷酶對(duì)其是否有增香作用。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器與試劑

材料：新鮮枇杷葉于2019年3月采自西安交通大學(xué)藥學(xué)院的藥園，由西安交通大學(xué)藥學(xué)院牛曉峰教授鑒定為薔薇科植物枇杷[Eriobotryajaponica(Thunb.) Lindl.]的干燥葉。

儀器：GCMS-TQ8040型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(日本島津)；AY120電子天平(日本島津)。

試劑：β-葡萄糖苷酶(上海源葉生物科技有限公司，100 U/g)；正己烷(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，色譜純)；無(wú)水硫酸鈉(西安化學(xué)試劑廠，分析純)；磷酸氫二鈉(河南焦作市化工三廠，分析純)；檸檬酸(成都化學(xué)試劑廠，分析純)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 β-葡萄糖苷酶水解反應(yīng)。分別稱取兩份100 g新鮮枇杷葉于250 mL pH 5.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液中，其中一份加0.5 g β-葡萄糖苷酶，另一份為空白對(duì)照。同時(shí)置于搖床中50 ℃恒溫水浴5 h。

1.2.2 揮發(fā)油的提取。將β-葡萄糖苷酶水解前后的枇杷葉分別置于2000 mL圓底燒瓶中，加水800 mL，沸石數(shù)粒，搖勻，按2015版《中國(guó)藥典(四部)》揮發(fā)油測(cè)定法(通則2204甲法)提取揮發(fā)油，保持微沸5 h。讀取揮發(fā)油體積并收集所得揮發(fā)油，加入少量無(wú)水硫酸鈉，靜置。然后，稱取揮發(fā)油置于10 mL量瓶中，加正己烷溶解并稀釋至刻度，待測(cè)。每個(gè)處理平行操作3次。

1.2.3 氣相色譜-質(zhì)譜條件

1.2.3.1 色譜條件。采用SHIMADZU SH-Rxi-5sil MS毛細(xì)色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；進(jìn)樣量：1.0 μL；載氣：He(≥99.99%)；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；流速：0.8 mL/min；分流比：5∶1；升溫程序：色譜柱始溫50 ℃，保持3 min，2 ℃/min升溫至120 ℃，保持2 min，3 ℃/min升溫至200 ℃，保持1 min，15 ℃/min升溫至280 ℃，保持1 min。

1.2.3.2 質(zhì)譜條件。接口溫度：250 ℃；離子源：EI；離子源電壓：60 ev；離子源溫度：230 ℃；質(zhì)量掃描范圍：45～550 m/z；溶劑峰切除時(shí)間：2.5 min，質(zhì)譜檢測(cè)起測(cè)時(shí)間：3.0 min。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理。所得的色譜和質(zhì)譜信息經(jīng)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)與其內(nèi)存譜庫(kù)(NIST)自動(dòng)檢索和解析，并用峰面積歸一法測(cè)定了各化學(xué)成分在揮發(fā)油中的相對(duì)百分含量。

2 結(jié)果

經(jīng)GC-MS分析測(cè)得新鮮枇杷葉中揮發(fā)油提取物的總離子流圖如圖1所示。

圖1 新鮮枇杷葉揮發(fā)油的GC-MS總離子流圖

采用NIST標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行綜合對(duì)比分析，由色譜峰面積歸一化法計(jì)算各化學(xué)成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，共鑒定出56種主要的揮發(fā)性化學(xué)成分，分析結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 新鮮枇杷葉揮發(fā)油化學(xué)成分分析

續(xù)表1

保留時(shí)間/min化合物中文名分子式相對(duì)峰面積(%)鮮枇杷葉鮮枇杷葉?8.613庚醛C7H14O0.160.1211.554苯甲醛C7H6O0.310.2613.2762,2,4,6,6-五甲基庚烷C12H260.700.5513.643(E,E)-2,4-庚二烯醛C7H10O0.290.1914.085正辛醛C8H16O0.150.1414.5241-乙基環(huán)己烯C8H140.530.2215.7152-乙基-1-己醇C8H18O0.2316.486苯乙醛C8H8O0.990.5817.5213,3-二甲基已烷C8H180.210.2718.548正辛醇C8H18O0.520.5820.489芳樟醇C10H18O1.181.5620.822壬醛C9H18O1.611.5026.010萘C10H80.460.3026.585丁酸順式-3-己烯酯C10H18O20.440.4027.056α-松油醇C10H18O0.230.4327.261藏紅花醛C10H14O0.2029.256γ-萜品醇C10H18O0.260.2231.138香葉醇C10H18O1.422.3431.900反式-2-癸烯醛C10H18O0.450.5935.0404'-羥基-2'-甲基苯乙酮C9H10O22.083.9137.922丁香酚C10H12O20.833.2141.860十四烷C14H300.200.3341.995β-大馬酮C13H20O0.660.6544.720香葉基丙酮C13H22O0.140.1444.812反式角鯊烯C30H500.260.2845.130β-金合歡烯C15H240.300.5345.522角鯊烯C30H501.111.1548.1972,4-二叔丁基苯酚C14H22O2.311.0949.749正二十烷C20H420.130.1650.6474,7,9-巨豆三烯-3-酮C13H18O0.430.5451.090反式-橙花叔醇C15H26O45.8444.8351.477順式-3-己烯醇苯甲酸酯C13H16O20.140.5852.1913,5-二叔丁基-4-羥基苯甲醛C15H22O20.380.6052.5712,2,4-三甲基戊二醇異丁酯C16H30O40.410.2954.685石竹素C15H24O0.140.1455.895正十七烷C17H360.300.1157.283十九烷醇C19H40O0.120.1957.532α-紅沒(méi)藥醇C15H26O5.556.0257.923香葉醇基香葉醇C20H34O5.144.8358.995金合歡醇(法尼醇)C15H26O13.1511.9961.044苯甲酸芐酯C14H12O20.481.0861.417菲C14H100.350.2562.812正二十烷C20H420.360.4763.087正三十二烷C32H660.520.5364.380植酮C18H36O0.520.2964.920鄰苯二甲酸二異丁酯C16H22O41.810.9465.080十五烷酸C15H30O20.1065.276柳酸芐酯C14H12O30.82

注：*代表加β-葡萄糖苷酶組

由表1可知，新鮮枇杷葉在分析鑒定出56種揮發(fā)性化學(xué)成分中，質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于2.00%的揮發(fā)性化合物共有7種，分別為反式-橙花叔醇(45.84%)，金合歡醇(13.15%)，α-紅沒(méi)藥醇(5.55%)，香葉醇基香葉醇(5.14%)，反式-3-己烯-1-醇(4.82%)，2,4-二叔丁基苯酚(2.31%)和4'-羥基-2'-甲基苯乙酮(2.08%)。 分析鑒定出的56種揮發(fā)性化學(xué)成分按化合物類型分類，分屬于酯類(6種，占3.36%)，醇類(13種，占78.58%)，醛類(8種，占4.34%)，酮類(6種，占3.93%)，酚類(2種，占3.14%)，烷烴類(10種，占3.12%)，烯烴類(5種，占2.34%)和芳烴類(6種，占1.22%)8類化合物。其中，醇類化合物含量最高，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為78.58%，相對(duì)含量最高的為反式-橙花叔醇(45.84%)，其次為金合歡醇(13.15%)，α-紅沒(méi)藥醇(5.55%)，香葉醇基香葉醇(5.14%)，反式-3-己烯-1-醇(4.82%)。烯烴類和芳烴類化合物含量較低。這些化合物中酯類、醛類、酮類、醇類、酚類、烯烴類和烷烴類等化合物在新鮮枇杷葉揮發(fā)油中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異，形成了揮發(fā)油特殊的氣味。

通過(guò)表1的對(duì)比可知，在新鮮枇杷葉中β-葡萄糖苷酶存在作用。加入β-葡萄糖苷酶后增加了4種化合物，分別為2-乙基-1-己醇、藏紅花醛、十五烷酸和柳酸芐酯，同時(shí)丁香酚、4'-羥基-2'-甲基苯乙酮、香葉醇的相對(duì)含量分別增加2.38%、1.83%和0.92%，增長(zhǎng)率達(dá)到286.75%、87.98%和64.79%。此外，苯甲酸芐酯、α-紅沒(méi)藥醇、順式-3-己烯醇苯甲酸酯、芳樟醇、β-金合歡烯等化合物的相對(duì)含量也有所增加。同時(shí)可以看出，反式-3-己烯-1-醇、2,4-二叔丁基苯酚、金合歡醇(法尼醇)、反式-橙花叔醇、鄰苯二甲酸二異丁酯等化合物的相對(duì)含量有所降低。

3 討論

通過(guò)建立新鮮枇杷葉揮發(fā)油的氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的分析方法，共鑒定出56個(gè)化合物的結(jié)構(gòu)。從化合物結(jié)構(gòu)類型來(lái)看，新鮮枇杷葉揮發(fā)油中主要是以反式-橙花叔醇(45.84%)、金合歡醇(13.15%)、α-紅沒(méi)藥醇(5.55%)等為代表的醇類化學(xué)成分。有研究表明，金合歡醇、香葉醇規(guī)定為允許使用的食用香料[10]，α-紅沒(méi)藥醇具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗寄生蟲(chóng)等作用，對(duì)多種腫瘤細(xì)胞也具有抑制作用[11]，金合歡醇和香葉醇基香葉醇具有抗腫瘤、殺菌等生理活性[12]，這為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和利用枇杷葉的藥用、食品香料等方面價(jià)值提供理論依據(jù)。

從酶解前、后主要香氣成分比較中可看出，酶解后許多香氣成分的含量顯著增加，酶解產(chǎn)生的鍵合態(tài)揮發(fā)性物質(zhì)以醇類物質(zhì)含量最高，如香葉醇、芳樟醇、反式-3-己烯-1-醇等。同時(shí)還有酚類物質(zhì)(丁香酚)，酮類和萜烯類物質(zhì)(β-金合歡烯)，這些物質(zhì)都是植物中鍵合態(tài)香氣物質(zhì)的主要構(gòu)成成分[13]，對(duì)整體香氣有很大貢獻(xiàn)。有研究表明，β-葡萄糖苷酶是參與醇系香氣前驅(qū)體釋放的重要酶類之一[14]。由此可見(jiàn)，導(dǎo)致酶解前后揮發(fā)性物質(zhì)種類和數(shù)量上的差異是由于β-葡萄糖苷酶酶解新鮮枇杷葉中的“香味前驅(qū)體”釋放出潛在的香氣物質(zhì)，因此，β-葡萄糖苷酶對(duì)其有增香作用。