龍歡 趙輝 王緒朋 賈瑞宗 賀萍萍 孔華 郭運玲 郭安平

1. 海南大學熱帶農林學院，海南海口??570228;2. 中國熱帶農業(yè)科學院熱帶生物技術研究所，海南海口 ?571101;3. 海南省南繁生物安全與分子育種重點實驗室，海南海口 ?571101

摘 ?要??雙生科病毒具有毀滅性強、寄主多樣、分布地域廣等特點，一直是困擾世界農作物生產的一大難題。用物理和化學方法防治該類病毒不僅花費成本高，見效低，而且還可能對環(huán)境造成負面影響，因此用分子手段培育抗病品種才是有效途徑之一。本研究結合最新的CRISPR/Cas9基因編輯技術和Golden Gate克隆技術，設計并構建了抗番木瓜曲葉病毒基因編輯串聯多切點表達載體。表達載體轉入農桿菌AGL1后經注射本氏煙草葉片進行瞬時表達，48 h后通過激光共聚焦顯微鏡能觀察到有綠色熒光的出現，定位的位置為細胞核與細胞質膜。本研究為番木瓜抗曲葉病毒研究提供理論基礎。

關鍵詞 ?基因編輯;曲葉病毒;番木瓜;瞬時表達中圖分類號??Q949.759.6??????文獻標識碼??A

Construction of CRISPR Plant Expression Vectors Resistant to Papaya Leaf Curl Virus

LONG huan^1，2， ZHAO Hui^1，2*， WANG Xupeng²， JIA Ruizong^1，2， HE Pingping^1，2， KONG Hua^1，2，GUO Yunling^1，2， GUO Anping^1，2**

1. Institute of Tropical Agricultural and Forestry， Hainan University， Haikou， Hainan?570228， China; 2. Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Haikou， Hainan?571101， China; 3. Hainan Key Laboratory for Biosafety Monitoring and Molecular Breeding in Off-Season Reproduction Regions， Haikou， Hainan 571101， China

Abstract ?The Geminivirus are characterized by strong destructiveness， diverse hosts， and wide geographical distribution. They have always been a major problem in the crop production of the world . The use of physical and chemical methods to control them is not only costly， but also has low efficacy， and may also have a negative impact on the environment. Therefore， it is one of the effective ways to cultivate disease-resistant varieties by?molecular breeding technology. The CRISPR/Cas9 gene editing technology and Golden Gate cloning technology were used to design and construct a gene editing multi-cut expression vector resistant to papaya leaf curl virus. The vector was transferred into Agrobacterium tumefaciens AGL1 and injected into the tobacco leaves for transient expression. After 48 h， the presence of green fluorescence was observed by a laser confocal microscopy. It was located in the nucleus and cytoplasmic membrane. The work would provide a theoretical basis for the study of papaya leaf curl virus.

Keywords ?genome editing; leaf curl virus; papaya; transient expression

DOI10.3969/j.issn.1000-2561.2019.10.015

番木瓜（Carica papayaL.）是熱帶地區(qū)最重要的消費和出口熱帶水果之一。目前從番木瓜上發(fā)現的病毒大多以番木瓜環(huán)斑病毒（Papaya ring spot virus， PRSV）和番木瓜畸形花葉病毒（Papaya leaf-distortion mosaic virus， PLDMV）為主，均為RNA病毒^[1]，近期，項目組從海南地區(qū)番木瓜葉片上分離出番木瓜曲葉病毒（Papaya leaf curl virus， PaLCV），得病植株表現出植株矮小，葉柄卷曲，葉片皺縮失綠等現象，嚴重時植株絕產死亡。本研究利用最新的基因編輯手段，從病毒本身基因入手，力圖通過給番木瓜建立CRISPR免疫系統，來提高番木瓜對該類病毒的抗病性。

CRISPR基因編輯技術作為第3代基因編輯工具，是新型的分子育種技術，由于剪切位點的效率與剪切位點的堿基結合效率直接相關，與目標基因功能無直接關系，該技術簡單易懂，適用性強，無論在植物基因編輯或是外抗外源病毒方面，都獲得廣泛關注和取得可喜的突破，在對抗雙生科曲葉病毒方面，前期可通過基因序列分析系統以及靶點評估系統篩選出在理論上能高效剪切DNA序列的sgRNA剪切位點，后期利用農桿菌轉化植物愈傷組織的方法可以培育出抗曲葉病毒的陽性轉基因植物苗，在植物細胞內可得到Cas9和sgRNA的穩(wěn)定表達，并形成sgRNA-Cas9的復合體。當雙生科病毒感染植物時，病毒ssDNA會被釋放到植物細胞內，隨后ssDNA會通過自身滾環(huán)復制形成無數個dsDNA拷貝。此時，sgRNA-Cas9復合體會自動識別病毒dsDNA的特定序列并對雙鏈DNA進行剪切，造成病毒DNA的雙鍵斷裂，斷裂后的序列會通過非同源性末端連接進行修復或造成病毒基因的降解^[2]。在目前所發(fā)表的研究成果中，中科院遺傳與發(fā)育研究所Ji等^[3]利用CRISPR/Cas9系統證明該系統可成功編輯甜菜嚴重曲頂病毒（Beet severe curly top virus， BSCTV），所選用的植株為本氏煙和擬南芥，首先利用瞬時表達體系篩選出高效的sgRNA切點，隨后在轉化水平上實現最終對甜菜嚴重曲頂病毒的抗性，從基因靶點的突變證據可說明該系統可以特異性切割目標病毒DNA。明尼蘇達大學Baltes等^[4]用能表達熒光蛋白GFP的基因對菜豆黃矮病毒序列進行改造，運用高通量測序、熒光強度分析等進行效率分析，無論是從瞬時表達水平還是從遺傳轉化層面，都能證明該系統能有效編輯病毒DNA，顯著降低病毒積累量。與此同時，阿卜杜拉國外科技大學Ali等^[5]也成功運用該系統實現對番茄黃化曲葉病毒進行高效編輯。以上研究都能有效阻止目標病毒的積累復制，說明CRISPR系統在對抗雙生科DNA病毒方面具有可行性。

Golden Gate克隆技術是基于ⅡS酶識別序列位置和切割序列位置不一樣的特點，首先ⅡS型核酸內切酶在識別DNA序列后會在識別位點之外切割DNA，然后產生黏性末端DNA片段，最后通過DNA連接酶可以將DNA片段按照特定的順序相連，連接好的片段不含使用過的ⅡS型核酸內切酶識別位點^[6-9]，該方法簡單易懂，操作方便，通過該方法構建載體只需一步法就可以完成構建。為了達到廣譜高效的抗病效果，本研究結合CRISPR多切點載體技術、Golden Gate載體構建技術、借鑒前人對抗雙生科曲葉病毒的研究^[2]，以及對該病毒海南株系的測序和生物信息學分析等，選擇了病毒DNA-A基因組基因間區(qū)IR、編碼外殼蛋白基因和移動蛋白基因共同區(qū)AV1/AV2，編碼復制相關蛋白基因和AC4蛋白基因AC1/AC4，共3個病毒關鍵位點進行串聯的剪切設計，同時在植物表達載體的引導序列后引入一段熒光蛋白基因，通過熒光蛋白的瞬時表達，以驗證載體在煙草細胞的定位情況。

1??材料與方法

1.1材料

1.1.1 ?菌株與載體??大腸桿菌DH5α化學感受態(tài)細胞購自北京全式金生物技術有限公司。農桿菌AGL1化學感受態(tài)細胞購自北京天恩澤基因科技有限公司。載體pMOD_A0101、pMOD_B2301、pMOD_C3001、pTRANS_220d由美國明尼蘇達大學Dan Voytas實驗室合作提供。瞬時表達注射所用植株為室溫22?℃條件下生長1個月左右具有6～8片葉的健康野生型本氏煙草苗。

1.1.2??酶類及主要生化試劑??限制性核酸內切酶LguⅠ（SapⅠ）、Esp3Ⅰ（BsmBⅠ）、AarⅠ購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司;T4 DNA ligase購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司;TaKaRa PrimerSTAR Max?DNA Polymerase 購自寶日醫(yī)生物技術（北京）有限公司;質粒提取試劑盒Plasmid DNA Mini KitⅠ和膠回收試劑盒Gel Extraction Kit購自Omega Bio-Tek公司。其他試劑為國產分析純。

1.1.3??引物??如表1所示，根據海南番木瓜曲葉病毒DNA-A基因組IR區(qū)、AV1/AV2區(qū)和AC1/AC4區(qū)序列設計的sgRNA（小寫字母）和載體序列（大寫斜體字母），設計引物并加入LguⅠ（SapⅠ）、Esp3Ⅰ（BsmBⅠ）、AarⅠ酶切位點（下劃線部分）。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司廣州合成部合成。

1.2方法

1.2.1??sgRNA的設計??根據本實驗室從番木瓜葉片上所分離的曲葉病毒DNA全長，將其序列導入網站Tefor（http：//crispor.tefor.net/），分析可行的sgRNA和其脫靶效益，然后將理想的sgRNA序列信息導入網站Phytozome（https：//phytozome.?jgi.doe.gov/pz/portal.html）與番木瓜基因組進行Blast分析，最后將理想的sgRNA序列信息導入網站Webtools for the Voytas Lab Plant Genome Engineering Toolkit（http：//cfans-pmorrell.oit.umn.?edu/CRISPR_Multiplex/assembly.php），最終確定3個sgRNA序列信息如表1所示。

1.2.2 ?pCRISPR-PaLCV-3sgRNA-Cas9-mgfp6表達載體的構建與農桿菌轉化??參考王緒朋等^[10]的載體構建方法，對終載體進行構建。第1步，通過PCR克隆出目的片段，PCR反應可分為4個Reaction反應，電泳后對目的片段進行膠回收。第2步，中間載體的構建。將第1步的膠回收產物與模板pMOD_B2301質粒進行第1個Golden Gate克隆反應，完成后產物轉化大腸桿菌DH5α，涂板培養(yǎng)，挑選正確的陽性單克隆送去測序，選擇與理論序列一致的陽性單克隆進行培養(yǎng)，提取中間載體質粒。第3步，pCRISPR-PaLCV-3sgRNA-?Cas9-mgfp6終載體的構建。將第2步所提取的中間載體質粒與模板pMOD_A0101、pMOD_C3001和pTRANS_220d進行第3個Golden Gate克隆反應，完成后產物轉化大腸桿菌DH5α，涂板培養(yǎng)，挑選正確的陽性單克隆送去測序，選擇與理論結果一致的陽性單克隆進行培養(yǎng)，提取終載體質粒。終載體質粒經EcoRⅠ與Hind?Ⅲ酶切驗證無誤后轉化至農桿菌AGL1，菌液經PCR檢測后，挑選出正確的陽性單克隆菌液備用。

1.2.3 ?瞬時表達與熒光觀察??參考王緒朋等^[10]的載體瞬時表達重懸液配方，將含有pCRISPR-PaLCV-3sgRNA-Cas9-mgfp6終載體的農桿菌AGL1菌液進行培養(yǎng)至對數生長期后離心并重懸，重懸液重懸后控制OD₆₀₀在1.0～1.2之間，放置室溫3 h左右，用1 mL去針頭的注射管吸取活化好的菌液并注射生長時間為1個月左右的本氏煙草葉片背部，挑選中上部的葉片為最佳，每株重復注射葉片3片，共注射3株。將注射好的煙草苗放至培養(yǎng)室繼續(xù)培養(yǎng)，保持室溫22?℃，同時為了排除野生型煙草葉片本身的熒光干擾，設置了不做任何處理注射的對照組，對照組與處理組其余條件均一致。熒光觀察參考Li等^[11]的亞細胞定位方法，在注射含pCRISPR-PaLCV-3sgRNA-?Cas9-mgfp6終載體的AGL1菌液48 h后，將注射后的煙草葉片接種部位全部剪下，裁剪成約2 cm²的圓形，將其制成簡易切片，操作OLYMPUS FLUOVIEW激光共聚焦熒光顯微鏡FV1000進行觀察，設置激發(fā)波長為488 nm。

2??結果與分析

2.1PCR擴增目的片段與中間載體驗證

PCR Reaction 1所需引物對為O35S和OtRNAB_IR，理論大小654 bp;PCR Reaction 2所需引物對為OrepC_IR和OtRNAB_R/C，PCR Reaction 3所需引物對為OrepC_R/C和OtRNAB_C/M，理論大小均為193 bp;PCR Reaction 4所需引物對為OrepC_C/M和OtRNAE，理論大小為181 bp。共有4管PCR反應產物，實際擴增情況如圖1所示，對紅色箭頭所示的目的條帶進行膠回收。在第一個Golden Gate反應結束后，含中間載體質粒的轉化產物將會轉化至大腸桿菌DH5α，挑菌并培養(yǎng)，菌液PCR用引物對TC089R/ZY010F檢測，挑選與目的條帶相符的3～5個陽性單克隆送至公司測序，測序信息返回后比對，選擇與理論序列相符合的菌液進行培養(yǎng)。

2.2表達載體酶切、PCR及測序驗證

在第二個Golden Gate克隆反應結束后，含終載體質粒的反應產物會轉化至大腸桿菌DH5α，挑菌并培養(yǎng)，菌液PCR用引物對TC430/M13F檢測，挑選與目的條帶相符的3～5個陽性單克隆送至公司測序，測序信息返回后選擇與理論序列相符合的菌液進行培養(yǎng)，隨后提取質粒，將構建好的終載體pCRISPR-PaLCV-3sgRNA-Cas9-mgfp6質粒進行酶切驗證，挑選在終載體上分別只有一個切點位置的限制性核酸內切酶EcoRⅠ和限制性核酸內切酶Hind?Ⅲ。終載體總長度為17345?bp，當EcoRⅠ與Hind?Ⅲ同時酶切時，可以同時切出兩條目的條帶，大小為5088 bp和12257 bp，如圖2和圖3所示。

2.3瞬時表達熒光結果

煙草葉片注射48 h后，在488 nm藍光的激發(fā)下，觀察到由綠色熒光蛋白產生的509 nm的綠色熒光，如圖4所示。處理組葉肉細胞發(fā)出熒光的部位為葉肉細胞核與細胞質膜部分，而在對照組Control中并未觀察到綠色熒光的發(fā)生。由于CRISPR/Cas9基因編輯載體AtCas9、sgRNA和mgfp6基因的表達由植物35S啟動子所啟動，瞬時表達的結果說明該載體能在植物體內進行表達，可進行下一步轉化工作。

M：DNA Marker?Ⅲ;1～4分別是PCR Reaction 1–4的擴增產物。

M： DNA Marker?Ⅲ; 1–4： Amplification productsof PCR Reaction 1–4.

終載體Cas9酶源自于pMOD_A0101，sgRNA部分源自于中間載體pMOD_B2301-PaLCV-3sgRNA，mgfp6部分源自于pMOD_C3001。

The Cas9 construct from pMOD_A0101，?the sgRNA construct from pMOD_B2301-PaLCV-3sgRNA，?the mgfp6 construct from pMOD_C3001.

本氏煙草葉片GFP熒光觀察（標尺為20 ?m）。

3??討論

在CRISPR技術未應用到雙生科病毒防治之前，在對抗雙生科病毒方面應用最廣泛的是利用病毒基因片段誘導的抗性育種，向植物細胞轉入病毒外殼蛋白、復制酶、運動蛋白等克隆基因來實現抗性。Kunik等^[12]用番茄黃化曲葉病毒外殼蛋白基因轉入番茄，接種病毒后能表現出病毒抗性，但由于CP蛋白對于單組分的雙生科病毒是必須的^[13]，對于雙組分的雙生科病毒卻不是必須的^[14]。所以用利用病毒外殼蛋白介導的抗性具有很大的局限性，后續(xù)研究用轉病毒Rep、突變體REn等策略來獲得病毒抗性^[15-16]，但都存在一定的局限性。隨著TALE與RNAi技術的發(fā)展，陳方圓^[17]成功運用TALE技術對抗番茄黃化曲葉病毒和甘藍曲葉病毒，通過凝膠阻滯實驗與South雜交印記分析發(fā)現人工TALE蛋白可以特異性結合病毒并且降低病毒DNA積累量。Zrachya等^[18]根據病毒CP蛋白構建了siRNAs，實現了對番茄黃化曲葉病毒的抗性。Chellappan等^[19]用siRNA成功對抗非洲木薯花葉病毒。與其他基因育種技術相比，CRISPR系統操作更為簡單，不需要很繁瑣的載體構建過程，同時利用CRISPR系統來進行剪切DNA病毒目的直接明確，剪切效率取決于sgRNA與模板的結合效率，剪切效率與基因功能無直接關系，故減少脫靶效率才是運用該技術的重中之重。在目前關于基因編輯轉基因植物抗雙生科病毒的抗性研究中，2019年4月瑞士蘇黎世聯邦理工大學植物研究所于Genome Biology上發(fā)表文章，在本研究中，研究小組證明轉化基因編輯單切點載體的轉基因植物和對照組植物在對抗非洲木薯花葉病毒的抗性水平上差異不顯著，并預測了基因編輯多切點載體在對抗植物病毒方面的有效性，同時發(fā)現運用CRISPR/Cas9系統對抗病毒可導致一種新的保守突變病毒的出現，基因突變導致進化出了一種新的病毒，該病毒不能被原始sgRNA-Cas9復合體所識別，從而避免了被宿主植物中CRISPR/Cas9系統切割^[20]，不過該研究并未通過轉化基因編輯多切點載體來獲得抗性植株并進行后續(xù)抗病試驗。

本研究的試驗策略基于基因編輯多切點對抗病毒的可行性，運用了Golden Gate一步克隆法構建了可以同時串聯3個切點序列的抗曲葉病毒基因編輯多切點表達載體pCRISPR-PaLCV-3sgRNA?-Cas9-mgfp6，此方法構建載體簡單，耗時短，包括前期靶點設計，基本上15 d左右便能完成載體構建工作。在前期設計靶點時，既要考慮脫靶效率，sgRNA-Cas9復合體在對病毒DNA雙鏈發(fā)生剪切時，是否理論上也會對植物基因組發(fā)生剪切的情況，又要考慮靶點的高效性與廣譜性。同時，在設計多切點時，應保證各切點中間4個bp堿基序列至少有一個不同，否則會在構建Mould B板塊時出現各切點PCR產物無法連接或者連接錯誤的情況發(fā)生。根據剪切核酸類型的不同，可以挑選不同種類的Cas核酸酶。本研究中所構建的終載體在sgRNA后插入一段由35S啟動子引導的mgfp6報告基因，由于該報告基因本身不會發(fā)光，只有在轉入植物細胞后通過35S啟動子所啟動后，才能轉錄并翻譯成熒光蛋白，該蛋白可以被488 nm藍光激發(fā)，后期通過激光共聚焦顯微鏡可以觀察到熒光部位，該報告基因的插入可以通過瞬時表達觀測熒光情況來判斷載體是否構建成功以及在植物細胞內的表達情況，由于轉基因植物體內會表達GFP蛋白，故選用GFP作為報告基因的缺點在于轉基因植物只能局限于實驗研究。本研究還需繼續(xù)探討的方面包括后期轉基因作物能否穩(wěn)定表達Cas9蛋白、后期轉基因作物的抗病性以及脫靶效率，最終確定有抗病能力的番木瓜轉化株需繼續(xù)進行田間抗病試驗，從而達到真正的抗病效果。

參考文獻

[1]?趙??輝， 賀萍萍， 郭靜遠， 等. 應用現代生物技術防治番木瓜RNA病毒研究進展[J]. 分子植物種， 2017， 15（11）： 4590-4599.

[2]?Zaidi S E A， Mansoor S， Ali Z，et al. Engineering plants for geminivirus resistance with CRISPR/Cas9 system[J]. Trends in Plant Science， 2016， 21（4）： 279-281.

[3]?Ji X， Zhang H， Zhang Y，et al. Establishing a CRISPR–Cas-like immune system conferring DNA virus resistance in plants[J]. Nature Plants， 2015， 1： 15144.

[4]?Baltes N， Hummel A， Konecna E，et al. Conferring resistance to geminiviruses with the CRISPR-Cas prokaryotic immune system[J]. Nature Plants， 2015， 1： 15145.

[5]?Ali Z， Abulfaraj A， Idris A，et al.?CRISPR/Cas9-mediated viral interference in plants[J]. Genome Biology， 2015， 16： 238.

[6]?Engler C， Kandzia R， Marillonnet S，et al. A one pot， one step， precision cloning method with high throughput capability[J]. PLoS One， 2008， 3（11）： e3647.

[7]?Engler C， Gruetzner R， Kandzia R，et al. Golden gate shuffling： A one-pot DNA shuffling method based on type IIs restriction enzymes[J]. PLoS One， 2009， 4（5）： e5553.

[8]?Morbitzer R， Elsaesser J， Hausner J，et al. Assembly of custom TALE-type DNA binding domains by modular cloning[J]. Nucleic Acids Research， 2011， 39（13）： 5790-5799.

[9]?Bickle T A， D H Krüger. Biology of DNA restriction[J]. Microbiological Reviews， 1993， 57（2）： 434-450.

[10]?王緒朋， 趙??輝， 賈瑞宗， 等. 用Golden Gate法構建廣譜抗番木瓜環(huán)斑病毒海南株系的CRISPR/FnCas9植物表達載體[J]. 熱帶作物學報， 2018， 39（5）： 955-962.

[11]?Li B， Yang Y， Luo Z，et al. Expression of secretory protein genes in candidatus liber ibacter asiaticus[J]. American Journal of Plant Sciences， 2018， 9： 2408-2419.

[12]?Kunik T， Salomon R， Zamir D，et al. Transgenic tomato plants expressing the tomato yellow leaf curl virus capsid protein are resistant to the virus[J]. Biotechnology， 1994， 12（5）： 500-504.

[13]?Briddon R W， Watts J， Markham P G，et al. The coat protein of beet curly top virus is essential for infectivity[J]. Virology， 1989， 172（2）： 628-633.

[14]?Ingham D J， Pascal E， Lazarowitz S G. Both bipartite geminivirus movement proteins define viral host range， but only BL1 determines viral pathogenicity[J]. Virology， 1995， 207（1）： 191-204.

[15]?Noris E， Accotto G P， Tavazza R，et al. Resistance to tomato yellow leaf curl geminivirus inNicotiana benthamianaplants transformed with a truncated viral C1 gene[J]. Virology， 1996， 224（1）： 130-138.

[16]?Selth L?A. A NAC domain protein interacts with tomato leaf curl virus replication accessory protein and enhances viral replication[J]. The?Plant?Cell， 2005， 17（1）： 311-325.

[17]?陳方圓. 基于人工TALE技術的抗雙生病毒研究[D]. 杭州： 浙江大學， 2015.

[18]?Zrachya A， Kumar P P， Ramakrishnan U，et al. Production of siRNA targeted against TYLCV coat protein transcripts leads to silencing of its expression and resistance to the virus[J]. Transgenic Research， 2007， 16（3）： 385-398.

[19]?Chellappan P， Vanitharani R， Fauquet C M. Short interfering RNA accumulation correlates with host recovery in DNA virus-infected hosts， and gene silencing targets specific viral sequences[J]. Journal of Virology， 2004， 78（14）： 7465-7477.

[20]?Mehta D， Stürchler A， Anjanappa R B，et al. Linking CRISPR-Cas9 interference in cassava to the evolution of editing-resistant geminiviruses[J]. Genome Biology， 2019， 20（1）： 80.