曾淑華，任 亞，劉少軍，郭仕平，劉 雷，信俊峰，劉雅潔*

1. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，成都市溫江區(qū)惠民路211 號(hào) 611130

2. 四川省煙草專賣(mài)局，成都市高新區(qū)世紀(jì)城路936 號(hào) 610041

煙葉的香氣品質(zhì)是決定煙葉可用性以及煙葉產(chǎn)區(qū)發(fā)展的基礎(chǔ)，相關(guān)研究備受重視。各種植區(qū)域的生態(tài)環(huán)境、煙葉感官質(zhì)量、化學(xué)成分及代謝物均存在差異，研究表明生態(tài)因素對(duì)烤煙品質(zhì)和風(fēng)格特色起決定性作用[1-5]。不同生態(tài)條件下烤煙主要化學(xué)成分和致香物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異明顯[6-8]。煙葉內(nèi)在化學(xué)成分是煙葉品質(zhì)和風(fēng)格特征的物質(zhì)基礎(chǔ)，煙葉的香型分布有明顯的地域性特點(diǎn)[9]。四川省是我國(guó)烤煙主產(chǎn)區(qū)之一，省內(nèi)煙區(qū)間生態(tài)條件差異明顯，煙葉香型風(fēng)格也有不同。

煙氣是煙葉燃燒并發(fā)生復(fù)雜熱化學(xué)反應(yīng)后的產(chǎn)物，而主流煙氣是直接進(jìn)入卷煙消費(fèi)者口腔的物質(zhì)，煙氣化學(xué)成分組成及其釋放量對(duì)卷煙感官質(zhì)量及香型風(fēng)格有直接影響。因此，分析主流煙氣成分對(duì)于認(rèn)識(shí)煙葉香型特點(diǎn)具有重要意義。已有較多的研究者從煙葉化學(xué)成分方面分析四川烤煙的特色[10-11]，而與特色相關(guān)的烤煙煙氣成分的分析工作尚顯不足。因此，本研究中對(duì)四川省不同煙區(qū)單料烤煙的主流煙氣成分進(jìn)行GC/MS、PCA 和OPLS-DA 分析，旨在明確各種植區(qū)煙葉產(chǎn)品的煙氣特征，為四川省煙葉特色彰顯與分類提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

35 個(gè)烤煙樣品取自四川省涼山州、攀枝花市、瀘州市、宜賓市、廣元市，等級(jí)為C3F，每個(gè)樣品5 kg。煙葉的詳細(xì)信息見(jiàn)表1。

二氯甲烷、無(wú)水硫酸鈉（AR，成都市科隆化學(xué)品公司）；乙酸苯乙酯（內(nèi)標(biāo)，AR，上海甄準(zhǔn)生物科技有限公司）。

表1 煙葉取樣信息Tab.1 Information on tobacco leaf samples

GC-MS2010 氣質(zhì)聯(lián)用儀（日本Simadzu 公司）；JJ124BC 電子天平（感量0.000 1 g，常熟雙杰測(cè)試儀器廠）；Milli-Q 超純水儀（美國(guó)Millipore 公司）；進(jìn)樣瓶（海門(mén)市敏磊玻璃儀器廠）；0.45 μm有機(jī)相濾膜（江蘇綠盟科學(xué)儀器有限公司）；移液槍（德國(guó)Eppendorf公司）；SB25-12DTDN 超聲波清洗儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 煙支樣品卷制

將表1中烤煙樣品分別切絲、卷制成直徑為8 mm、長(zhǎng)度為（60+24）mm、質(zhì)量為0.9 g 左右的煙支，每個(gè)樣品卷制50 支卷煙。

1.2.2 煙支樣品燃吸將煙支置于溫度（22±1）℃，相對(duì)濕度（60±2）%環(huán)境條件下平衡48 h。挑選5 支質(zhì)量范圍為平均值±0.15 g 的煙支進(jìn)行燃吸。利用卷煙主流煙氣捕集裝置進(jìn)行煙支抽吸和煙氣捕集：每次抽吸持續(xù)時(shí)間3 s，每次抽吸煙氣量為35 mL，頻率為1 次/60 s[12]。

1.2.3 煙氣捕集與GC/MS 定性和定量分析

利用盛裝CH2Cl2的溶劑捕集器進(jìn)行煙氣捕集并萃取。加入內(nèi)標(biāo)乙酸苯乙酯，即為GC/MS 分析樣品液。GC/MS 條件：

色譜柱：DB-5MS（30 m×0.25 mm i.d.×0.25 μm d.f.）毛細(xì)管柱；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；載氣：He，1 mL/min；進(jìn)樣量：3 μL，不分流；升溫程序：50 ℃（2 min）150 ℃（2 min）240 ℃（5 min）；接口溫度：250 ℃；電離方式：EI；離子源溫度：200 ℃；電離能量：70 eV；掃描范圍：30～400 amu。

煙氣成分總離子流圖（TIC）采用島津GC/MS 工作站GC/MS Postrun Analysis 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。檢索NIST05/NIST05s 譜庫(kù)進(jìn)行定性，選擇匹配度≥79%的成分，采用峰面積歸一化相對(duì)定量法進(jìn)行定量。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，采用SIMCA 13.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)主成分分析（PCA）及正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA），分析前對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行Log 轉(zhuǎn)換和UV縮放；采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 主流煙氣化學(xué)成分分析

35 個(gè)烤煙樣品單料煙支的主流煙氣經(jīng)GC/MS 分析后，共鑒定出68 種釋放量較大的化學(xué)成分，其累計(jì)峰面積約占總TIC 圖峰面積的65%～85%，包括酮類9 種、醇類6 種、醛類3 種、酯類8 種、酚類8 種、烷烴類19 種、含氧雜環(huán)化合物6 種、含氮雜環(huán)化合物6種、有機(jī)酸3 種，詳見(jiàn)表2。

表2 主流煙氣化學(xué)成分定性檢測(cè)結(jié)果Tab.2 Qualitative results of chemical components in mainstream cigarette smoke

表2（續(xù)）

對(duì)不同種植區(qū)烤煙主流煙氣化學(xué)成分的歸類分析結(jié)果見(jiàn)表3。川西南種植區(qū)的醇類和含氮化合物顯著高于其他2 個(gè)種植區(qū)，川北種植區(qū)烤煙主流煙氣中酮類化合物的釋放量最高，3 個(gè)種植區(qū)的含氧化合物無(wú)明顯差異。

2.2 煙氣成分PCA 分析

對(duì)35 個(gè)煙葉樣品主流煙氣成分進(jìn)行PCA 分析，結(jié)果見(jiàn)圖1?？芍?，川西南的涼山州和攀枝花市的煙葉樣品主要聚集在第1、第4 象限；而川南的瀘州市、宜賓市和川北廣元市的樣品，主要分布在第2、第3象限。說(shuō)明不同產(chǎn)地?zé)熑~主流煙氣成分存在明顯的差異。云煙87 和紅花大金元無(wú)分離趨勢(shì)，說(shuō)明產(chǎn)地對(duì)烤煙煙氣成分的影響大于品種。

2.3 烤煙煙氣成分OPLS-DA 分析

2.3.1 不同產(chǎn)地烤煙煙氣成分的OPLS-DA 分析為了進(jìn)一步認(rèn)識(shí)不同種植區(qū)煙葉的煙氣成分差異，采用有監(jiān)督模式的OPLS-DA 進(jìn)行分析，得分圖見(jiàn)圖2，統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表4～表6。由圖2 可知，涼山州和攀枝花市（川西南，SW）的樣品彼此聚攏，瀘州市和宜賓市（川南，SS）的樣品聚集在一起，而廣元市（川北，SN）的樣品聚集在一起。不同種植區(qū)的煙樣明顯分離，第一主成分將川北同川西南和川南樣品分開(kāi)，第二主成分將川南和川西南樣品分開(kāi)。樣品的識(shí)別正確率為100%（表5），采用交叉驗(yàn)證方差分析（Cross-validated variance analysis, CV-ANOVA）檢驗(yàn)了分析的可靠性，F(xiàn)=12.08，P值遠(yuǎn)小于0.05（表6），表明OPLS-DA 分析統(tǒng)計(jì)上顯著有效。

表3 不同種植區(qū)烤煙主流煙氣化學(xué)成分比較分析①Tab.3 Chemical components in mainstream smoke of tobacco from different planting areas (%)

圖1 PCA 第1、2 主成分得分圖Fig.1 Score plot of 1st versus 2nd components in PCA

圖2 不同種植區(qū)烤煙OPLS-DA 第1、第2 主成分得分圖Fig.2 Score plot of 1st versus 2nd components in OPLS-DA of flue-cured tobacco from different planting areas

表4 不同種植區(qū)烤煙OPLS-DA 統(tǒng)計(jì)結(jié)果Tab.4 OPLS-DA statistics results of flue-cured tobacco from different planting areas

表5 不同種植區(qū)烤煙OPLS-DA 數(shù)據(jù)識(shí)別率Tab.5 Identification rate of OPLS-DA data of flue-cured tobacco from different planting areas

表6 不同產(chǎn)地烤煙OPLS-DA 交叉驗(yàn)證方差分析結(jié)果Tab.6 Results of OPLS-DA cross-validated variance analysis of flue-cured tobacco from different planting areas

2.3.2 不同品種烤煙煙氣成分的OPLS-DA 分析

對(duì)品種間煙氣成分開(kāi)展了OPLS-DA 分析，結(jié)果表明云煙87和紅花大金元彼此分離（圖3），統(tǒng)計(jì)結(jié)果中Q2僅為0.229（表7），小于0.5，說(shuō)明其對(duì)變量的預(yù)測(cè)度太低。采用CV-ANOVA 檢驗(yàn)了分析的可靠性，P 值為0.25（表8），大于0.05，表明OPLS-DA 分析統(tǒng)計(jì)上無(wú)效。分析結(jié)果表明品種間的差異較小。

圖3 不同品種烤煙OPLS-DA 第1、第2 主成分得分圖Fig.3 Score plot of 1st versus 2nd components in OPLS-DA of flue-cured tobacco of different varieties

2.3.3 不同種植區(qū)烤煙特征煙氣成分篩選

OPLS-DA的載荷圖和VIP（Variable importance for the projection）值見(jiàn)圖4 和圖5。由圖5 可篩選出VIP值大于1.35 的9 種煙氣成分；結(jié)合圖4 和5 可知，3 號(hào)（2-戊酮）、12 號(hào)（1-氯代十一烷）、20 號(hào)（2-乙?；秽?、32號(hào)（2-甲基-1-苯基丙烯）、28號(hào)（5-甲基-3-己烯-2-酮）和15 號(hào)（苯乙烯）煙氣成分同川南種植區(qū)相關(guān)性高，47 號(hào)（乙酸松油酯）煙氣成分同川西南種植區(qū)相關(guān)性高，35 號(hào)（1-甲基環(huán)辛烯）和11 號(hào)（糠醛）煙氣成分同川北種植區(qū)相關(guān)性高。煙氣成分的方差分析（表9）結(jié)果表明，川南烤煙煙氣中3 號(hào)、12號(hào)、20 號(hào)、28 號(hào)和32 號(hào)煙氣成分的釋放量顯著高于川西南和川北，可作為川南種植區(qū)烤煙的特征煙氣成分；川西南烤煙煙氣中47 號(hào)煙氣成分的釋放量顯著高于川南和川北，可作為川西南種植區(qū)烤煙的特征煙氣成分；川北烤煙煙氣中35 號(hào)煙氣成分的釋放量顯著高于川西南和川南，可作為川北種植區(qū)烤煙的特征煙氣成分。

表7 不同品種烤煙OPLS-DA 統(tǒng)計(jì)結(jié)果Tab.7 OPLS-DA statistic results of flue-cured tobacco of different varieties

表8 不同品種烤煙OPLS-DA 交叉驗(yàn)證方差分析結(jié)果Tab.8 Results of OPLS-DA cross-validated variance analysis of flue-cured tobacco of different varieties

圖4 OPLS-DA 第1、第2 主成分載荷圖Fig.4 Lording scatter plot of 1st versus 2nd components in OPLS-DA

圖5 OPLS-DA 的VIP 值Fig.5 VIP values of OPLS-DA

表9 VIP 值大于1.35 的煙氣成分比較分析①Tab.9 Variance analysis of mainstream smoke components with VIP values over 1.35

3 討論

四川省單料烤煙主流煙氣經(jīng)GC/MS 法共檢測(cè)出68 種主要化學(xué)成分，包括酮類、醇類、醛類、酯類、酚類、烷烴類、含氧化合物、含氮化合物和有機(jī)酸共9類，與孫玉利等[13]鑒定出134 種、蔡君蘭等[14]鑒定出87種、韓冰等[15]鑒定出93種化合物有一定差異，可能與提取方法和GC/MS條件不同有關(guān)。在相同條件下，烤煙燃燒產(chǎn)生的煙氣成分主要是由遺傳因素、生態(tài)環(huán)境和栽培技術(shù)共同作用而決定的[16]。LIU Lei等[10]和王俊等[11]曾基于煙葉化學(xué)成分的差異研究了產(chǎn)地與煙葉特征的關(guān)系，并依此將四川省煙葉產(chǎn)區(qū)類型進(jìn)行了劃分。本研究中基于對(duì)烤煙主流煙氣化學(xué)成分的PCA 和OPLS-DA 分析，發(fā)現(xiàn)川西南（涼山州和攀枝花市）、川南（瀘州市和宜賓市）和川北（廣元市）種植區(qū)烤煙主流煙氣成分存在明顯差異，說(shuō)明不同煙區(qū)的生態(tài)條件會(huì)影響烤煙煙氣成分的構(gòu)成，從而影響煙葉的品質(zhì)和風(fēng)格特征；而對(duì)品種間進(jìn)行OPLS-DA分析發(fā)現(xiàn)，云煙87和紅花大金元間主流煙氣成分的差異較小，與生態(tài)決定特色[17]的研究結(jié)果一致。

研究還發(fā)現(xiàn)不同生態(tài)區(qū)域的特征煙氣成分差異明顯，川西南種植區(qū)烤煙的特征煙氣成分為乙酸松油酯，是香檸檬油的主要成分之一，具有愉快、涼爽和芳香的香氣[18]；川南種植區(qū)烤煙的特征煙氣成分為2-戊酮、1-氯代十一烷、2-乙?；秽?-甲基-1-苯基丙烯、5-甲基-3-己烯-2-酮和苯乙烯，2-戊酮帶有甜、果香，2-乙?；秽珵檫秽愊懔?，香勢(shì)強(qiáng)，特征性明顯，具有咖啡香、水果香和谷物香[17]；川北種植區(qū)烤煙的特征煙氣成分為1-甲基環(huán)辛烯。本研究中僅分析了各種植區(qū)的特征煙氣成分，而這些特征煙氣成分對(duì)烤煙香型的影響和作用還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

①利用自制煙氣捕集裝置與GC/MS 技術(shù)結(jié)合，在匹配度≥79%時(shí)，檢測(cè)出四川省烤煙單料煙支主流煙氣68 種主要化學(xué)成分；②經(jīng)主成分（PCA）和正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA），表明不同種植區(qū)烤煙主流煙氣成分存在明顯差異，而品種間主流煙氣成分的差異較??；③不同種植區(qū)烤煙的特征煙氣成分差異明顯。