左 梅，譚 軍，向必坤，施河麗，陳紅華，彭五星

湖北省煙草公司恩施州公司，湖北省恩施市市府路65 號 445000

恩施州地處鄂西南山區(qū)，是湖北省最大的煙葉產(chǎn)區(qū)，煙草種植歷史悠久，是當(dāng)?shù)刂饕慕?jīng)濟作物之一。由于耕地有限和經(jīng)濟利益的驅(qū)動，多數(shù)煙區(qū)存在連作種植習(xí)慣，連作已成為當(dāng)?shù)氐闹饕N植模式。自20 世紀(jì)90 年代以來，長期連作和大量使用化學(xué)肥料等原因?qū)е庐?dāng)?shù)刂矡熗寥乐饾u退化，生產(chǎn)力下降、病害加重、煙葉品質(zhì)降低等問題[1]。大量研究表明，長期連作會造成煙田土壤養(yǎng)分與土壤微生物區(qū)系非均衡性變化，土壤細(xì)菌多樣性與均勻度降低，導(dǎo)致土傳病原菌大量繁殖以及土壤酶活性下降，對作物的生長和優(yōu)質(zhì)生產(chǎn)極為不利[2-4]。有研究表明，土傳性病害發(fā)生與土壤細(xì)菌多樣性及種群結(jié)構(gòu)的變化有直接關(guān)系[5-7]，煙草科技工作者利用綠肥還田[8-9]、增施有機肥[10]、輪作[11]等措施來提高連作土壤微生物多樣性及土壤酶活性，改善土壤微生態(tài)條件，以降低土傳性病害。這些研究豐富了植煙土壤連作障礙消減技術(shù)措施，對推動植煙土壤可持續(xù)利用起到了重要作用。

輪作休耕是實現(xiàn)生態(tài)恢復(fù)的重要措施之一。同時，全國煙葉目前種植規(guī)模減小，煙田面積也大幅減少，使得對煙區(qū)不同煙田實行輪替休耕成為可能。而對連作障礙煙田實行有計劃輪作休耕，對提高煙區(qū)土壤地力，實現(xiàn)植煙土壤可持續(xù)利用和煙區(qū)健康發(fā)展十分必要[12-13]。Zeleke[14]研究發(fā)現(xiàn)，休耕能增加土壤中水分和礦物質(zhì)氮含量；吳蕓紫等[15]通過對稻-麥連作和稻-休耕農(nóng)田植物進行物種多樣性的比較，發(fā)現(xiàn)休耕能顯著提高物種豐富度，促進農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)植物物種生態(tài)多樣性；徐光輝等[16]提出休耕輪作有利于耕層中水分與溫度的保持，為微生物提供了適宜的生存條件，更有利于微生物的生長繁殖；王敬敬等[17]的研究發(fā)現(xiàn)免耕土壤中光合細(xì)菌的多樣性顯著高于傳統(tǒng)翻耕土壤。但有關(guān)休耕對連作障礙植煙土壤酶活性及細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響研究鮮見報道，為此選取恩施長期連作且青枯病歷年頻發(fā)煙田為研究對象，采取休耕方式來改善土壤微生態(tài)條件，旨在為連作障礙植煙土壤修復(fù)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗區(qū)概況

試驗點位于湖北省恩施州宣恩縣椒園鎮(zhèn)涼風(fēng)村，北緯29.97°N，東經(jīng)109.38°E。海拔820 m，屬于亞熱帶濕潤氣候，年降雨量為1 400～1 500 mm，年平均氣溫16.5 ℃。試驗田塊植煙土壤類型為黃棕壤土，連續(xù)種煙25 年。土壤基礎(chǔ)養(yǎng)分狀況：堿解氮186.49 mg·kg-1、速效鉀266.74 mg·kg-1、速效磷34.48 mg·kg-1、有機質(zhì)17.33 g·kg-1，pH 5.04。

1.2 試驗設(shè)計

試驗共設(shè)置3個處理，分別為：T1（連作對照）2015年至2017 年連續(xù)3 年種植烤煙；T2 休耕1 年（2015 年土地空閑，2016 至2017 年兩年種植烤煙）；T3 休耕兩年（2015、2016 年土地空閑，2017 年種植烤煙）。每個處理重復(fù)3次，每次重復(fù)1個小區(qū)，每小區(qū)種煙60株，隨機排列?？緹煿┰嚻贩N均為云煙87，試驗煙苗均采用漂浮育苗，各小區(qū)化肥施用量相同，施用比例N：P2O5：K2O 為1:1.98:3.08，田間管理按當(dāng)?shù)貎?yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)技術(shù)規(guī)范進行。

1.3 土樣的采集與制備

2014 年10 月取基礎(chǔ)土樣。2017 年煙株收獲后，各小區(qū)采用5點取樣法取壟體深度0～20 cm處土壤，混勻分為兩份分別裝入保鮮袋、透氣棉質(zhì)袋。保鮮袋中的樣品放入低溫冷藏箱(-20 ℃)中保存，以提取土壤微生物基因組DNA。棉質(zhì)袋中的樣品，除去粗根和小石塊，自然風(fēng)干，用于測定土壤理化性狀指標(biāo)和土壤酶活性。

1.4 測定項目與方法

1.4.1 發(fā)病率與病情指數(shù)調(diào)查

煙株移栽后60 d，按標(biāo)準(zhǔn)方法[18]調(diào)查煙田青枯病發(fā)病率和統(tǒng)計病情指數(shù)。

1.4.2 土壤化學(xué)指標(biāo)與酶活性測定

參照鮑士旦[19]的方法進行土壤理化性狀指標(biāo)的測定。參照文獻[20]進行脲酶、蔗糖酶、磷酸酶活性的測定；參照楊蘭芳等[21]的方法進行過氧化氫酶活性檢測，以每克土壤分解過氧化氫的毫克數(shù)表示。

1.4.3 DNA 提取及擴增測序

采用Fast DNA? SPIN Kit for Soil（Qbiogene，Inc.USA）試劑盒提取土壤微生物基因組總DNA。采用引物338F（5' -ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′），806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）擴 增16S rRNA的V3和V4 區(qū)。采用引0817F（5' -TTAG CATGGAATAATRRAATAGGA-3'），1196R（5' -TC TGGACCTGGTGAGTTTCC-3'）擴 增18S rRNA 的V5-V7 區(qū)。PCR 反應(yīng)體系：土壤微生物DNA 模板（10 ng/μL）2.5μL，F(xiàn)orward 引物和Reverse 引物（1 μmol/L）各5 μL，KAPA HiFi HotStart ReadyMix 12.5 μL。PCR 反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min ；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s；25 個循環(huán)；最后72°C 延伸5 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)純化、質(zhì)檢建立測序文庫，再對文庫進行文庫純化、質(zhì)檢后，送上海伯豪生物技術(shù)有限公司，采用MiSeq sequencer（Illumina）進行測序。

采用USEARCH 方法對各樣品的Effective Tags進行聚類，將序列相似性達到97%的序列聚類生成操作分類單元（Operational Taxonomic Units，OTU）[22]。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Mothur 軟件將測序序列去重復(fù)，與已知數(shù)據(jù)庫GreenGene、Silva 等比對，去除嵌合體序列和線粒體、葉綠體序列。計算其距離，并在97%的相似水平下進行OTU 聚類。

隨機選取相似度在97%條件下的OTU，利用Mothur 軟件做Rarefaction 分析。利用Mothur 軟件計算Chao 指數(shù)、Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)3 種常用的多樣性指數(shù)，測序深度用覆蓋率（Coverage）表示。利用Excel 2007 和DPS 7.65 軟件進行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析，采用Duncan 新復(fù)極差法進行差異顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 休耕措施對青枯病發(fā)病率的影響

從圖1 可以看出，T1（CK）處理的發(fā)病率與發(fā)病指數(shù)均最高，但處理間差異未達到顯著水平。發(fā)病率與病情指數(shù)隨著休耕年限增加而降低，T2（休耕1 年）、T3（休耕兩年）發(fā)病率比對照T1 分別降低22.62%、32.55%，病情指數(shù)分別降低3.10、4.21。這表明休耕措施能在一定程度上降低連作煙田的青枯病發(fā)病率和病情指數(shù)。

圖1 休耕措施對青枯病發(fā)病率和病情指數(shù)影響Fig.1 Effects of lying fallow on incidence and disease index of bacterial wilt

2.2 休耕措施對土壤化學(xué)性狀指標(biāo)的影響

從表1 可以看出，與對照T1（CK）相比，T2、T3處理的植煙土壤pH、堿解氮、有機質(zhì)含量均有不同程度增加，特別是T3 處理有機質(zhì)與CK 之間差異達到極顯著水平；土壤速效磷和速效鉀含量則有不同程度下降，但差異不顯著。這說明休耕可以提高土壤肥力水平，緩解酸化現(xiàn)象，以休耕2 年的處理效果較好。

表1 各處理休耕后煙田土壤化學(xué)性狀指標(biāo)的比較①Tab.1 Soil chemical indexes of different treatments after lying fallow

2.3 休耕措施對土壤酶活指標(biāo)的影響

過氧化氫酶能催化分解土壤中累積的過氧化物，與土壤有機質(zhì)含量密切相關(guān)，蔗糖酶活性強弱反映土壤肥力水平，對增加土壤中營養(yǎng)物質(zhì)有重要作用。脲酶與磷酸酶則分別參與土壤中氮、磷的轉(zhuǎn)化與吸收[23]。從表2 可以看出，隨著休耕年限的增加，蔗糖酶、過氧化氫酶表現(xiàn)出增加的趨勢，T2（休耕一年）、T3 處理（休耕兩年）比對照土壤蔗糖酶活性分別增加14.16%、147.85%，過氧化氫酶活性分別增加17.97%、64.13%，休耕兩年處理蔗糖酶和過氧化氫酶活性極顯著高于對照。但脲酶和磷酸酶活性在不同處理間差異不顯著。這說明休耕措施對土壤蔗糖酶和過氧化氫酶活性影響較大。

2.4 休耕措施對土壤細(xì)菌群落多樣性的影響

Chao 指數(shù)可以反映群落物種豐富度，其值越高表明群落物種的豐富度越高，Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)可以反映群落物種多樣性。其中Shannon 指數(shù)值越大，群落多樣性越高，而Simpson 指數(shù)值越小，群落多樣性越高[10]。從表3 可以看出，T2、T3 處理的Chao 指數(shù)、Shannon 指數(shù)均高于對照T1，Simpson指數(shù)則均低于對照，但差異未達到顯著水平。隨著休耕年限的增加Chao 指數(shù)呈增加趨勢，Simpson 指數(shù)呈降低趨勢，但僅休耕2 年處理的Shannon 指數(shù)與連作間差異達到極顯著水平。這說明休耕措施有利于增加土壤細(xì)菌群落的豐富度，但這種影響在休耕兩年才表現(xiàn)出明顯效果。

表2 休耕對土壤酶活性的影響Tab.2 Effects of lying fallow on soil enzyme activities

表3 休耕對土壤細(xì)菌多樣性的影響Tab.3 Effects of lying fallow on soil bacterial diversity

2.5 不同處理對土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響

土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)門水平上分析結(jié)果（圖2）顯示，綠彎菌門(Chloroflexi)，放線菌門(Actinobacteria)，變形菌門(Proteobacteria)，酸桿菌門(Acidobacteria)4個門類在3 個處理樣本中的豐度均超過80%。酸桿菌門(Acidobacteria)在休耕處理T2、T3 樣本中豐度高于連作處理T1，綠彎菌門(Chloroflexi)在T1、T2 樣本中的相對豐度較大，而T3 中具有最大相對豐度的為放線菌門(Actinobacteria)。從屬水平上的分析結(jié)果（圖3）發(fā)現(xiàn)，玫瑰彎菌屬(Roseiflexus)在T2 和T3 處理中相對豐度較大，以T3 處理表現(xiàn)尤為明顯，而在T1處理中相對豐度較低。玫瑰彎菌作為一種光合細(xì)菌具有較強的代謝能力和物質(zhì)轉(zhuǎn)化能力，可以在缺氧環(huán)境下利用光能進行光合作用；鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)在3個處理間均具有較高的相對豐度，尤其是在T1 處理中。硝化細(xì)菌(Nitrolancea)在3 個處理間均具有較低的相對豐度，但在T1處理中相對豐度最高；Gaiella 在3個處理中的相對豐度均較高，尤其是T2處理。青枯雷爾氏菌(Ralstonia)在T1處理中的相對豐度最高，分別是T2、T3 處理的2.0和3.7倍。

圖2 不同處理土壤高豐度細(xì)菌群落在門水平上的組成Fig.2 Phylum composition of bacterial community with high abundance in soils under different treatments

圖3 不同處理土壤高豐度細(xì)菌群落在屬水平上的組成Fig.3 Genus composition of bacterial community with high abundance in soils under different treatments

3 討論

連作煙田休耕能有效提高土壤中堿解氮與有機質(zhì)含量，起到提高土壤肥力的作用，這與Catherine M.Hepp 等[24]進行的短期休耕對土壤肥力的影響研究結(jié)果一致。休耕措施對植煙土壤酶活性影響較大，經(jīng)休耕兩年后的煙田土壤中蔗糖酶、過氧化氫酶極顯著高于連作煙田土壤。原因可能是休耕與保護性耕作相似，與連作相比對土壤耕作層擾動較輕，而大量雜草等植株根系分布于土壤表層，根系分泌物較多，從而導(dǎo)致土壤酶活性增加[16-17]。本研究中土壤有機質(zhì)與土壤主要酶活性的變化表現(xiàn)一致，這與楊曉娟[25]、楊媛媛[26]等的研究結(jié)果基本一致。

細(xì)菌作為土壤中重要的微生物，是土壤物質(zhì)轉(zhuǎn)化的重要參與者，土壤有機質(zhì)轉(zhuǎn)化所需能量的90%以上來自微生物的分解作用[27]。本研究中發(fā)現(xiàn)，休耕能增加土壤中細(xì)菌豐富度與多樣性指數(shù)，維持土壤微生物菌群結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，與徐光輝[16]、王敬敬[17]等的研究結(jié)果一致。原因可能是休耕避免了耕作對土壤耕作層的頻繁翻動而造成的土壤結(jié)構(gòu)破壞，也可能是休耕避免了化肥和農(nóng)藥的使用進而更有利于微生物的生長繁殖，從而增加細(xì)菌種群的多樣性[15]。從門、屬水平對連作、不同休耕年限土壤細(xì)菌群落分析表明，各處理土壤細(xì)菌門類與屬類組成基本相似，不同細(xì)菌屬在連作土壤與休耕處理土壤中存在顯著差異，玫瑰彎菌屬(Roseiflexus)在休耕處理土壤中所占比例較大，青枯雷爾氏菌(Ralstonia)在連作土壤中所占比例較大。玫瑰彎菌屬(Roseiflexus) 屬于綠彎菌門（Chloroflexi），為綠色非硫光合細(xì)菌，具有較強的代謝能力和物質(zhì)轉(zhuǎn)化能力，對作物生長發(fā)育非常有益，雷爾氏菌(Ralstonia) 是一種致病菌，與青枯病的發(fā)生關(guān)系密切[10]。休耕能有效降低連作煙田青枯病發(fā)病率，其原因：一方面是休耕增加了土壤微生物的豐富度和多樣性，促進有益微生物通過與病原菌競爭營養(yǎng)物質(zhì)來減緩病原菌的繁殖速度[28]；另一方面是休耕增加了土壤中有益微生物如玫瑰彎菌屬(Roseiflexus)的豐度，有益微生物通過產(chǎn)生多種活性物質(zhì)如抗體等，抑制了病原菌雷爾氏菌屬(Ralstonia)等的繁殖，從而達到降低病害發(fā)病率的效果。但本試驗中僅涉及休耕單一措施對連作障礙植煙土壤酶活性及細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響，而有關(guān)休耕結(jié)合綠肥種植、秸稈還田等措施提高土壤酶活性及優(yōu)化微生物群落結(jié)構(gòu)，以修復(fù)改良土壤環(huán)境方面仍有待進一步深入研究。

4 結(jié)論

湖北省恩施州宣恩縣常年連作煙田休耕能明顯增加土壤有機質(zhì)含量和提高土壤pH，起到培肥土壤和緩解土壤酸化的作用。同時能極顯著提高蔗糖酶和過氧化氫酶活性，且休耕兩年的效果優(yōu)于休耕一年。休耕還能改善連作煙田土壤的微生態(tài)環(huán)境，增加土壤Chao 指數(shù)、Shannon 指數(shù)，降低土壤Simpson指數(shù)，在增加細(xì)菌群落的豐富度和多樣性的同時可改善土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，提高有益菌屬如玫瑰彎菌屬(Roseiflexus)所占的比例，降低病原菌如雷爾氏菌屬(Ralstonia) 所占的比例，從而達到降低煙草青枯病發(fā)病率的效果。