張曉玲,袁蒲,張征波,王小云

胃癌(gastric cancer)是常見的消化道癌，在全球范圍內(nèi)，其發(fā)病率和病死率在惡性腫瘤中排名第2，全世界每年新增胃癌發(fā)病者近100萬人，其中相關(guān)病死率約10%[1-2]。目前，對(duì)胃癌的治療情況以及預(yù)后、生存期等有所改善，但晚期胃癌的臨床治療結(jié)果并不滿意，術(shù)后5年生存率仍然較低，并且多數(shù)患者發(fā)生腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移，因而提高對(duì)胃癌的早期診斷可有效降低患者的病死率，改善臨床治療效果[3-4]。傳統(tǒng)的腫瘤標(biāo)志物，如癌胚抗原(CEA)，對(duì)胃癌診斷的靈敏度、特異性較低，因此，探索新的腫瘤診斷標(biāo)志物，對(duì)胃癌的臨床診斷至關(guān)重要[5-7]。微小RNA(microRNAs，miRNA)是一種小分子的非編碼RNA，由20至25個(gè)核苷酸組成，它調(diào)節(jié)腫瘤的出現(xiàn)和進(jìn)化，是許多生物過程中的重要因素，如增殖、分化、侵襲、凋亡、血管生成與腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化上皮間充質(zhì)等[8]。 循環(huán)血液系統(tǒng)中微小RNA被認(rèn)為是癌癥檢測(cè)和監(jiān)測(cè)中的潛在分子標(biāo)記，因?yàn)樗鼈儾槐籖NA酶消化并且在血清和血漿中很穩(wěn)定[9]。本研究中，我們應(yīng)用熒光定量PCR法檢測(cè)了92例胃癌患者及83例慢性胃炎患者血清中miR-20a與miR-124的應(yīng)答水平，運(yùn)用其研究胃癌可行性診斷，并血清癌胚測(cè)定的抗原結(jié)果比較，評(píng)價(jià)兩種miRNAs用于胃癌診斷的臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 研究對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2018年5月至2019 年5月無錫市中醫(yī)醫(yī)院及無錫市第二人民醫(yī)院住院的胃癌患者92例，均經(jīng)病理組織學(xué)或細(xì)胞學(xué)檢查確診為胃癌，并且未接受過分子靶向目標(biāo)的治療、免疫學(xué)治療、放化療等的初診新發(fā)病例，排除胃部轉(zhuǎn)移性腫瘤患者。其中，男性58例，女性32例，年齡34～82 歲，平均(59±12.8)歲；Ⅰ期+ Ⅱ期47 例、Ⅲ期+ Ⅳ期45 例。另選取同期患有慢性胃炎的患者83例作為對(duì)照。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有研究隊(duì)形均簽署知情同意書。

1.2 樣本采集與RNA提取

采集所有患者的全血5 mL，加入促凝劑使全血完全凝固，小心吸取上層血清用1.5 mL 無RNA 酶的EP管進(jìn)行分裝，存于-80 ℃待用。一部分采集的血液標(biāo)本送檢驗(yàn)科，采用羅氏公司的Roche Elecsys 全自動(dòng)電化學(xué)免疫分析儀對(duì)血清CEA進(jìn)行檢測(cè)；另一部分血清樣本，按照mirvana Paris試劑盒(ambion公司、型號(hào)am1556)操作說明，從血清中提取總RNA。 通過u-2800紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA的純度與濃度，并儲(chǔ)存在超低溫冰箱(-80 ℃儲(chǔ)存)中。

1.3 定量PCR檢測(cè)

根據(jù)TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit試劑盒(ABI公司)的使用說明，在體外回收提取的RNA并獲得產(chǎn)物cDNA。 反應(yīng)時(shí)的條件為：16 ℃、42 ℃時(shí)各溫育30 min，在85 ℃ 加熱5 min，并在4 ℃保存。以產(chǎn)物cDNA為模版，PCR進(jìn)行熒光定量，使用Roche LightCycler 480儀器、內(nèi)部參考以U6為應(yīng)答檢測(cè)、運(yùn)用TaqMan Universal PCR Master Mix 20_l反應(yīng)系統(tǒng)來進(jìn)行，通過2-CT計(jì)算血清中microRNA-124和microRNA-20a的相對(duì)表達(dá)，反應(yīng)條件為60 ℃ 30 s，70 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s，95 ℃預(yù)變性10 min，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 胃癌患者與慢性胃炎患者血清miR-124和miR-20a 的表達(dá)水平

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，胃癌患者血清中miR-124顯著低于慢性胃炎患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而胃癌患者血清中miR-20a的應(yīng)答水平則明顯高于慢性胃炎患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1胃癌患者與慢性胃炎患者血清miR-124和miR-20a 表達(dá)水平比較

2.2 胃癌患者血清miR-124和miR-20a表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

胃癌患者血清miR-124表達(dá)與腫瘤臨床分期相關(guān)(P<0.05)，下降程度隨分期加重而增大，與患者性別、年齡、飲酒史和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無明顯相關(guān)性(P>0.05)。血清miR-20a表達(dá)與腫瘤臨床分期相關(guān)(P<0.05)，上升程度隨分期加重而增大，與患者性別、年齡、飲酒史和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移沒有明顯關(guān)聯(lián)性(P>0.05),見表2。

表2血清miR-124、miR-20a表達(dá)與胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系

2.3 聯(lián)合血清中miR-124、miR-20a建立風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估模型

以是否患有胃癌為因變量(胃癌組患者賦值為1，慢性胃炎患者賦值為0)，將175例研究對(duì)象納入統(tǒng)計(jì)分析，以患者的年齡、性別(男性賦值為0，女性賦值為1)、有無飲酒史(無飲酒史賦值0，有飲酒史賦值為1)、以及血清中miR-124、miR-20a檢測(cè)水平為自變量，進(jìn)行Logistic回歸分析。分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)胃癌發(fā)生與性別、年齡和飲酒史無顯著相關(guān)，血清miR-20a(OR=1.387，95%CI1.144～5.102)表達(dá)水平高是發(fā)生胃癌的危險(xiǎn)因素、miR-124(OR=0.655，95%CI0.283～0.821)表達(dá)水平高是發(fā)生胃癌的保護(hù)因素。建立胃癌風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估模型Ln((P/(1-P)=1.779+0.327*miR20a-0.423*miR124)。

2.4 血清miR-124、miR-20a對(duì)胃癌的診斷價(jià)值

通過ROC曲線下面積來評(píng)價(jià)診斷效率，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合miR-124和miR-20a診斷胃癌的AUC(95% CI)為[0.907(0.867～0.948)]，明顯優(yōu)于癌胚抗原[0.739(0.667～0.810)]、miR-124[0.859(0.807～0.911)]和miR-20a[0.761(0.691～0.830)](P均<0.05)。miR-124和miR-20a聯(lián)合診斷胃癌的敏感度和特異度較好，分別為83.7%和74.7%。見圖1和表4。

表3胃癌發(fā)生相關(guān)因素的Logistic回歸分析結(jié)果

圖1各檢測(cè)指標(biāo)診斷胃癌的ROC曲線

3 討論

1993年在真核生物中最初發(fā)現(xiàn)了miRNAs，后續(xù)研究表明microRNA可以通過將堿基配對(duì)互補(bǔ)與靶基因的3′或5′末端連合，調(diào)節(jié)靶基因的mRNA控制或分解它們來和轉(zhuǎn)錄基因的連合從而減少靶基因的翻譯。運(yùn)用基因調(diào)節(jié)的功能，mRNA可以大范圍參與許多真核生物細(xì)胞內(nèi)的生物反應(yīng)過程，如參與細(xì)胞的分化和增殖，細(xì)胞的信號(hào)傳遞，細(xì)胞周期調(diào)節(jié)等[10-11]，與多類腫瘤的出現(xiàn)和進(jìn)展也有緊密關(guān)聯(lián)。所以，目前在生命科學(xué)領(lǐng)域內(nèi)對(duì)于microRNAs有關(guān)生物的發(fā)育成長及其癌癥方面關(guān)注已經(jīng)成為研究的重點(diǎn)[12]?？挡┬鄣热送ㄟ^研究發(fā)現(xiàn)，miR-106a-5p在胃癌細(xì)胞系及胃癌組織中高表達(dá)并與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及浸潤深度有關(guān)，其有可能成為潛在研究價(jià)值的癌基因之一[13]。俞鵬飛[14]等人發(fā)現(xiàn)miR-210的表達(dá)與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤大小密切相關(guān),miR-210低表達(dá)患者5年生存率為48.2%,miR-210高表達(dá)患者5年生存率為30.4%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明:miR-210在胃癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁正常組織,可能與胃癌的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后有關(guān)。

表4各指標(biāo)對(duì)胃癌的診斷價(jià)值

注：*與miR-20a + miR-124聯(lián)合檢測(cè)AUC比較，P<0.05

Lin M對(duì)45例胃癌患者的研究發(fā)現(xiàn)，患者血清miR-20 a的表達(dá)與胃癌的分化程度，淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移以及臨床分期相關(guān)，或可作為胃癌的早期診斷指標(biāo)[15]；尹曉慶等對(duì)176胃癌患者手術(shù)標(biāo)本以及癌旁正常組織進(jìn)行miR-124的表達(dá)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中miR-124的表達(dá)下調(diào)，與胃黏膜非良性轉(zhuǎn)變以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和分化密切相關(guān)；謝等對(duì)胃癌細(xì)胞系的研究也發(fā)現(xiàn)，miR-124或可通過靶向調(diào)控鞘氨醇激酶1基因的表達(dá)，從而抑制胃癌細(xì)胞的侵襲和增殖能力[16]。

miRNA在腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲和凋亡過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。 當(dāng)靶miRNA編碼癌基因或抑癌基因時(shí)，miRNA的表達(dá)失調(diào)就會(huì)引起腫瘤的發(fā)生[17]。miR-124可以通過直接靶作用于絲裂原活化蛋白激酶1，抑制胃癌細(xì)胞株的增殖、遷移和侵襲，抑制其正常細(xì)胞周期，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[18]。本文通過檢測(cè)胃癌患者與慢性胃炎組患者血清中miR-124、miR-20a的表達(dá)進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，在胃癌患者血清中miR-124表達(dá)水平顯著下降，相比于慢性胃炎組患者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其低表達(dá)很可能因其啟動(dòng)子區(qū)域CpG島高度甲基化造成，并通過負(fù)調(diào)控血管內(nèi)皮生長因子和絲裂原活化蛋白激酶1的表達(dá)起到抑癌基因的作用。miR-20a在絕大多數(shù)胃癌組織中均高表達(dá)，被認(rèn)為是與胃癌相關(guān)的最重要的一種miRNA[19]。研究發(fā)現(xiàn)胃癌患者血清中miR-20a表達(dá)水平則明顯升高，相比于慢性胃炎組患者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，程序性細(xì)胞死亡基因 4能促使細(xì)胞凋亡，是調(diào)控細(xì)胞凋亡的重要基因，miR-20a通過下調(diào)程序性細(xì)胞死亡基因 4的表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡，間接促進(jìn)胃黏膜上皮細(xì)胞的增殖速度[15]。進(jìn)一步分析胃癌患者血清中miR-124、miR-20a的表達(dá)與病患臨床上的病理相關(guān)聯(lián)系表明，胃癌患者的miR-20a及miR-124在血清應(yīng)答水平與患者的年齡，性別，飲酒史均無相關(guān)性(P均>0.05)，但與胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期明顯相關(guān)(P均<0.05)，與前人報(bào)道結(jié)果一致；利用SPSS軟件的ROC分析，評(píng)價(jià)患者血清中miR-124、miR-20a表達(dá)對(duì)胃癌診斷的價(jià)值，與癌胚抗原的差異進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合miR-124和miR-20a診斷胃癌的AUC(95%CI)為[0.907(0.867～0.948)]明顯優(yōu)于癌胚抗原[0.739(0.667～0.810)]、miR-124[0.859(0.807～0.911)]和miR-20a[0.761(0.691～0.830)]。miR-124和miR-20a聯(lián)合診斷胃癌的敏感度和特異度較好，分別為83.7%和74.7%。這說明血清miR-20a 和miR-124聯(lián)合檢測(cè)胃癌效果明顯優(yōu)于其他三種檢測(cè)方式。

綜上所述，在胃癌患者血清中miR-124、miR-20a表達(dá)變化顯著，與胃癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，由于血清標(biāo)本較易獲取，而且血液中miRNA分子相對(duì)穩(wěn)定，是作為分子診斷的理想標(biāo)志物，故而對(duì)二者在血清中的表達(dá)進(jìn)行聯(lián)合檢測(cè)，對(duì)于胃癌的診斷有著一定的臨床應(yīng)用價(jià)值，但至于其進(jìn)一步的臨床應(yīng)用，還需要擴(kuò)大樣本進(jìn)行驗(yàn)證。