馬小敏 蔡芮桐 高銘陽

【摘 要】 目的：觀察苦蕎麥總黃酮對2型糖尿病大鼠胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中GSK-3β與AKt基因與蛋白表達情況的影響。方法：雄性wistar大鼠鏈脲佐菌素誘導(dǎo)建立T2DM 模型，將T2DM模型大鼠隨機分為5組：模型組、苦蕎麥總黃酮低劑量組（50 mg/kg）、苦蕎麥總黃酮中劑量組（100 mg/kg）、苦蕎麥總黃酮高劑量組（200 mg/kg）、西藥組（二甲雙胍100 mg/kg），另外設(shè)置對照組。灌胃給藥后，采用ELISA法測胰島素水平、血糖水平，計算胰島素敏感指數(shù);采用RT-PCR法檢測大鼠肝組織中GSK-3β、Akt的mRNA表達情況;采用Western-blot法測定大鼠肝組織中GSK-3β、AKT的蛋白表達情況。結(jié)果：與模型組相比，苦蕎麥總黃酮可降低大鼠肝組織中GSK-3βmRNA和蛋白表達（P<0.05）、增加Akt mRNA和蛋白表達（P<0.05）。結(jié)論：苦蕎麥總黃酮能降低模型大鼠肝組織中GSK-3βmRNA和蛋白表達、增加Akt mRNA和蛋白表達進而起到積極的影響作用。

【關(guān)鍵詞】 苦蕎麥總黃酮;2型糖尿病;胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路;糖原合成激酶-3β;蛋白激酶B

【中圖分類號】R285.5 ??【文獻標志碼】 A ???【文章編號】1007-8517（2019）18-0015-07

糖尿病（Diabetes Mellitus，DM）是一種發(fā)病率極高的代謝性疾病，已嚴重影響人類生活。據(jù)國際糖尿病聯(lián)盟（the International Diabetes Federation，IDF）發(fā)布的第八版全球糖尿病地圖數(shù)據(jù)顯示，2017年全球共有4.25億糖尿病患者，其中中國患病人數(shù)最多[1]，90%～95%為2型糖尿病（Type 2 diabetes mellitus，T2DM）[2]。T2DM的病理機制與胰島β細胞功能失常和胰島素抵抗關(guān)系十分密切，其在環(huán)境、遺傳等因素的影響下通常表現(xiàn)為胰島素抵抗（Insulin Resistance，IR）[3]。糖原合成激酶-3β（Glycogen synthase kinase 3β，GSK-3β）是胰島素受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中一個關(guān)鍵節(jié)點，它在細胞中過度表達會引起胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受阻，引起IR[4-7]，有實驗表明抑制GSK-3β活性可改善小鼠的糖耐量水平，使肝糖原代謝增加進而增加肝糖原含量[8]。在胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中，激活的蛋白激酶B（Protein kinase B，AKT）可使GSK-3β磷酸化從而失活達到降血糖的目的。因此，促進Akt表達從而抑制GSK-3β可以減輕胰島素抵抗，改善糖耐量水平，產(chǎn)生潛在的抗糖尿病效果[9]。

苦蕎麥作為一種藥食兩用的植物，在國內(nèi)外被廣泛種植[10]。其黃酮類化合物在醫(yī)藥保健方面具有降血糖、降血脂、降血壓、抗氧化、抗腫瘤、增強免疫力及保護心腦血管等多種功效[11-12]。研究通過觀察苦蕎麥總黃酮對Ⅱ型糖尿病胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中GSK-3β和Akt基因與蛋白的表達情況的影響，測定各組大鼠肝組織中mRNA與蛋白含量，探討苦蕎麥總黃酮對Ⅱ型糖尿病影響的作用與機制。

1 實驗材料

1.1 動物與飼料 SPF級wistar大鼠78只，雄性，許可證號SCXK（遼）2015-0001 遼寧長生生物技術(shù)有限公司。高脂飼料和普通飼料（沈陽市于洪區(qū)前民動物實驗飼料廠）;豬油和蔗糖（沈陽市和平區(qū)金味源食品批發(fā)部）。

1.2 藥品與試劑 苦蕎麥總黃酮（日本三益制藥株式會社，含量為991.65 mg/g）;二甲雙胍（批號：20150617，沈陽維康醫(yī)藥連鎖有限公司）;鏈脲佐菌素（批號：1122F032，solarbio）;胰島素ELISA試劑盒;氯仿、異丙醇、無水乙醇（20150607）國藥集團化學試劑有限公司;RT-PCR試劑盒（AK5701），核酸Marker（A801A），上、下游引物（CHPA194）; SDS-PAGE凝膠制備試劑盒（批號：20151222，Solarbio）;NC膜（批號：T426062，Pall）;TBS緩沖劑（批號：60900120）、蛋白ladder（批號：69J00157）購自北京鼎國公司; SDS-PAGE電泳粉（批號：20161111）、BCA蛋白含量檢測試劑盒（批號：20160629）購自凱基生物;蛋白提取試劑盒（批號：20160622）， GSK-3β（批號：0003）、Akt（批號：0020）、GAPDH（批號：0010）均為CST公司;HRP標記抗兔二抗（批號：0026，CST公司）。

1.3 儀器 ACCU-CHEK血糖儀（羅氏診斷產(chǎn)品有限公司）;ACCU-CHEK血糖試紙（羅氏診斷產(chǎn)品有限公司）;iMark酶標儀（美國BD）;JD500-3電子天平（沈陽龍騰電子有限公司）;DW-HL388超低溫冰箱（中科美菱低溫科技有限責任公司）;HR/T20M臺式高速冷凍離心機（湖南赫西儀器裝備有限公司）;HE-90水平電泳槽、VE-180垂直電泳槽均為上海天能科技有限公司;S1000 Thermal Cycler梯度PCR儀（BIO-RAD）;Chemi XR5凝膠成像分析儀;化學發(fā)光儀。

2 方法

2.1 試劑配制

2.1.1 鏈脲佐菌素（STZ）注射液 將檸檬酸（2.585 g）、檸檬酸三鈉（2.265 g）用150 mL三蒸水溶解，用HCL調(diào)pH至4.2后用三蒸水定容至200 mL，4℃儲存。使用時加STZ配成濃度為2%STZ溶液，注意用濾膜除菌。

2.1.2 Western blot緩沖液的配制

2.1.2.1 TBS存儲液 粉劑常溫存放，使用時直接用純水稀釋成1 L的存儲液。

2.1.2.2 TBST洗液 由1L TBS存儲液加入0.5 mL吐溫混勻制成。

2.1.2.3 轉(zhuǎn)膜液 配轉(zhuǎn)膜液由粉劑在配液時加熱，并用純水定容至800 mL，再加200 mL甲醇混勻而成。

2.1.2.4 封閉液 封閉液濃度為5%，即用5 g奶粉加100 mL純水制成。

2.2 動物模型建立 雄性wistar大鼠于動物實驗中心適應(yīng)性喂養(yǎng)（豬油及蔗糖）3 d后，隨機分為兩組：對照組（普通飼料）7只，高脂飼料組（高脂飼料）71只（分籠飼養(yǎng)，每籠7只），喂養(yǎng)8周。喂養(yǎng)8周后，高脂飼料組按體質(zhì)量篩選出成為食源性肥胖的大鼠（標準：高脂飼料組個體質(zhì)量≥對照組個體質(zhì)量均值+2倍標準差）后，繼續(xù)喂養(yǎng)4周?？崭範顟B(tài)下用氧化酶法測定各組大鼠血糖;同時眶靜脈取血，用ELISA法檢測胰島素水平。計算胰島素敏感指數(shù)（ISI）=1/（FINSxFBG）（FINS為空腹胰島素，F(xiàn)PG為空腹血糖）。將對照組與高脂飼料組進行對照，篩選建立高脂飼料組大鼠胰島素抵抗模型。建模后對高脂飼料組大鼠進行連續(xù)2周腹腔注射鏈脲佐菌素，劑量為25 mg/kg·周。再次測量空腹血糖，以空腹血糖>11.1 mmol/L視為造糖尿病模型造模成功[13-14]。

2.3 動物分組 除對照組外，將糖尿病造模成功大鼠隨機分5組，分別為模型組7只;4個用藥組分別為苦蕎麥總黃酮低劑量組7只（用藥量50 mg/kg）;苦蕎麥總黃酮中劑量組7只（用藥量100 mg/kg）;苦蕎麥總黃酮高劑量組7只（用藥量200 mg/kg）;西藥組7只（二甲雙胍100 mg/kg）。灌胃給藥4周后，再次眶靜脈取血后處死各組大鼠，提取肝組織。

2.4 指標測定及方法 給予高脂飼料8周后測量大鼠體重;給予大鼠注射STZ前，用ELISA法和氧化酶法分別測量大鼠的胰島素和血糖水平，并計算胰島素抵抗指數(shù)。具體方法：準備96孔加樣板，試劑盒室溫平衡30 min后，將樣品和標準品、生物素標記二抗和酶標試劑，置于37℃水浴中反應(yīng)60 min;洗板5次，加入試劑盒中顯色液A 50μL和B 50 μL，37℃水浴中反應(yīng)10 min;加入終止液50 μL后于10 min內(nèi)放入酶標儀450 nm波長下讀取OD值并計算;給予注射STZ 2周后用ELISA法測胰島素水平和血糖水平，并計算胰島素抵抗指數(shù)。方法同前。

2.4.1 RT-PCR法檢測大鼠肝組織中GSK-3β、Akt的mRNA表達情況

2.4.1.1 分離RNA 于冰盤上取100 mg大鼠肝組織，用預(yù)冷生理鹽水沖洗后剪碎，放入勻漿器內(nèi)，加入1 mL Trizol試劑勻漿裂解細胞。靜止5 min后，轉(zhuǎn)移裂解液到EP管中，加入0.2 mL氯仿，劇烈搖動混勻。4℃靜置5 min后、12 000 rpm離心15 min。用移液器將水相轉(zhuǎn)移到新管中，加入等體積異丙醇混勻，靜置10 min。再次4℃、12 000 rpm離心10 min。去上清，加入1 mL 75%乙醇混勻，靜置5 min。第3次4℃、 1 2000 rpm離心5 min。分離出RNA，倒掉乙醇，靜置5 min后加入30μL DEPC水溶解，得到RNA溶液。取12μL RNA溶液，加入 DEPC 水稀釋，用酶標儀測定260 nm 和280 nm的吸光度，并計算RNA的濃度和純度。

2.4.1.2 反轉(zhuǎn)錄出mRNA 按TAKARA試劑盒說明書要求配制10μL反轉(zhuǎn)錄體系，于PCR儀中42～60℃條件下放置15～30 min，95℃條件下5 min，5℃條件下5 min;再配制PCR反應(yīng)液40μL，把此反應(yīng)液加入到反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)結(jié)束的PCR反應(yīng)管中，輕輕混勻，離心約10s，進行PCR反應(yīng)：94℃進行30sec，55～65℃進行30sec，上述兩步驟重復(fù)30Cycles，然后72℃進行50sec。準備上樣。在上述RT-PCR過程中用到的上、下游引物及合成序列長度如下：GSK-3β的上游引物序列為5′-TCGTCCATCGATGTGTGGTC-3′，下游引物序列為5′-TTGTCCAGGGGTGAGCTTTG-3′，合成長度為202bp，退火溫度為60℃;Akt的上游引物序列為5′- AGAGAGCCGAGTCCTACAGAATA-3′，下游引物序列為5′-CCGAGAGAGGTGGAAAAACA-3′，合成長度為133bp，退火溫度為61℃;GAPDH的上游引物序列為5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′，下游引物序列為5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′，合成長度為500bp，退火溫度為60℃。

2.4.1.3 凝膠成像 制備1.5%瓊脂糖凝膠，放入電泳槽中。取5 μL樣本和1 μL上樣緩沖液，混合成6 μL上樣液。瓊脂糖凝膠上樣后接通電源，110V，約1 h。放入凝膠成像系統(tǒng)拍照并分析條帶。

2.4.2 Western-blot法測定大鼠肝組織中GSK-3β、AKT的蛋白表達情況

2.4.2.1 蛋白樣品制備 取100 mg肝組織，于冰上在EP管內(nèi)剪碎，加入裂解液，用超聲破碎儀充分勻漿裂解。將勻漿裂解液在離心機中4℃、14 000 rpm離心10 min;將上清液轉(zhuǎn)移至新的冰上預(yù)冷的1.5 mL EP管中，得到全蛋白提取物，可以進行蛋白定量。

2.4.2.2 BCA法測定蛋白含量 按說明書將蛋白樣本稀釋。試劑A：試劑B（50∶ 1）配制，計算樣本濃度。使每孔上樣蛋白量達40 μg，混勻后置沸水浴5 min。10 000 rpm轉(zhuǎn)1 min后直接取上清液上蛋白樣本。

2.4.2.3 電泳 配10%分離膠。配5%濃縮膠，膠液加入TEMED后立即搖勻即可灌膠，然后將梳子水平插入，4℃靜置2h。將其放入電泳槽中，分別加入樣本和ladder。電泳時樣本在濃縮膠時恒壓80V，在分離膠時恒壓120V。取膠，將膠放置在含有轉(zhuǎn)膜液的托盤內(nèi)。

2.4.2.4 轉(zhuǎn)膜 在冰盆中濕轉(zhuǎn)，1L濕轉(zhuǎn)液。將夾子放入轉(zhuǎn)膜槽中。恒壓100V，78 min定時。

2.4.2.5 封閉 根據(jù)目的蛋白分子量將膜剪成細條放入封閉盒內(nèi)，加5%的封閉液，放入水浴箱內(nèi)，37℃，緩慢振蕩1.5h。倒掉封閉液，TBST于搖床上洗3次，每次3 min。

2.4.2.6 抗體孵育與免疫反應(yīng) 一抗滴加于膜上，室溫下輕搖孵育1h后4℃靜置過夜;膜用TBST洗3次，每次10 min于搖床上;加入稀釋二抗后放于37℃水浴中1 h;TBST洗3次，每次10 min。

2.4.2.7 化學發(fā)光 將發(fā)光液試劑盒按比例于EP管中混勻，滴加于膜上，放入發(fā)光儀進行曝光并拍照。

2.5 統(tǒng)計學方法 應(yīng)用 SPSS 16.0 軟件，所得數(shù)據(jù)以均數(shù)加減標準差（x±s）表示，組間差異顯著性檢驗用t檢驗，單因素方差分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 飼養(yǎng)8周后各組大鼠體重的變化 各高脂飼料組與對照組相比較，大鼠體重明顯增加（P<0.05），成功篩選出食源性肥胖大鼠。見表1。

3.2 飼養(yǎng)12周后各組大鼠胰島素敏感指數(shù)的變化 各高脂飼料組與對照組相比較，大鼠胰島素敏感指數(shù)明顯下降（P<0.05）。見表2。

3.3 飼養(yǎng)12周后各組大鼠血液中胰島素水平的變化 各組間經(jīng)兩兩比較，血液中胰島素水平差異無統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表3。

3.4 給予藥物干預(yù)后各組大鼠血糖水平的變化 模型組與對照組相比較，大鼠血糖水平明顯提高（P<0.05）;苦蕎麥總黃酮低、中、高劑量組、西藥組與模型組相比較，大鼠血糖水平明顯下降（P<0.05），其中苦蕎麥中劑量組與西藥組降血糖效果較好。見表4。

3.5 給予藥物干預(yù)后各組大鼠血液中胰島素水平的變化 模型組與對照組相比較，大鼠胰島素水平明顯下降（P<0.05）;苦蕎麥總黃酮低、中劑量組、西藥組與模型組相比較，大鼠胰島素水平明顯提高（P<0.05），其中苦蕎麥中劑量組、西藥組與對照組胰島素水平相近。見表5。

3.6 給予藥物干預(yù)后各組大鼠胰島素敏感指數(shù)的變化 模型組與對照組相比較，大鼠胰島素敏感指數(shù)明顯下降（P<0.05）;苦蕎麥總黃酮中、高劑量組、西藥組與模型組相比較，大鼠胰島素敏感指數(shù)明顯提高（P<0.05），其中苦蕎麥中劑量組與西藥組大鼠胰島素敏感指數(shù)與對照組相近。見表6。

3.7 各組大鼠肝組織中GSK-3β mRNA的相對表達情況 與對照組相比較，模型組組織中GSK-3β mRNA的表達明顯提高（P<0.05）;苦蕎麥總黃酮中劑量組、西藥組和模型組相比較，GSK-3βmRNA的表達明顯下降（P<0.05）。如圖1所示，見表7。

3.8 各組大鼠肝組織中Akt mRNA的相對表達情況 與對照組相比較，模型組組織中Akt mRNA 的表達明顯減少（P<0.05）;苦蕎麥總黃酮中劑量組、西藥組和模型組相比較，Akt mRNA 的表達明顯增加（P<0.05）。如圖2所示，見表8。

3.9 各組大鼠肝組織中GSK-3β蛋白的相對表達情況 模型組與對照組相比較，組織中GSK-3β蛋白的表達明顯增加（P<0.05）;苦蕎麥總黃酮中劑量組、西藥組與模型組相比較，GSK-3β蛋白的表達明顯減少（P<0.05）。如圖3所示，見表9。

3.10 各組大鼠肝組織中AKT蛋白的相對表達情況 模型組與對照組相比較，組織中AKT蛋白的表達減少有統(tǒng)計學差異（P<0.05）;苦蕎麥總黃酮中劑量組、西藥組與模型組相比較，AKT蛋白的表達增加有統(tǒng)計學差異（P<0.05）。如圖4所示，見表10。

4 討論

本實驗結(jié)果表明，苦蕎麥總黃酮低、中、高3個劑量組中，中劑量組效果最好。和模型組相比較，苦蕎麥總黃酮中劑量組與西藥組在控制T2DM大鼠血糖方面效果顯著，可明顯提高T2DM大鼠胰島素水平，提高其胰島素敏感指數(shù)。證明苦蕎麥總黃酮對T2DM大鼠的病情有積極影響，其機制與苦蕎麥總黃酮能使胰島素轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中GSK-3βmRNA和蛋白表達減少、Akt mRNA和蛋白表達增加有關(guān)。

研究表明，多數(shù)T2DM患者存在IR[15]，降低IR是治療T2DM的關(guān)鍵[16]，IR與胰島素作用調(diào)節(jié)通路有關(guān)[17]。胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中激活的Akt使 GSK-3β磷酸化而失活[18]，阻止GSK-3β對其底物糖原合成酶的磷酸化作用，糖原合成酶去磷酸化后恢復(fù)活性，發(fā)揮糖原合成作用，減少細胞中葡萄糖濃度。并且GSK-3β影響糖原合成酶活性不受胰島素濃度影響[19]。同時有實驗表明使用高選擇性抑制劑抑制GSK-3β 活性可增加葡萄糖的轉(zhuǎn)運從而提高胰島素的活性[20]，減少IR，進而達到降血糖作用。

因此，可以肯定激活A(yù)kt基因與蛋白表達、抑制GSK-3β基因與蛋白表達對降低T2DM大鼠血糖水平，升高胰島素敏感指數(shù)及改善胰島素抵抗有一定效果。苦蕎麥總黃酮通過影響胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中GSK-3β與Akt兩個基因與蛋白的表達影響T2DM大鼠。

本實驗通過選擇使用鏈脲佐菌素（STZ）選擇性破壞動物胰島β細胞從而導(dǎo)致糖尿病[21-22]，目前國內(nèi)廣泛采用高脂高糖飲食聯(lián)合注射小劑量STZ建立T2DM模型，該模型具有高血糖、胰島素抵抗等特點，與人類糖尿病發(fā)病過程和發(fā)病機理相似[23]?？嗍w麥作為一種藥食同源的植物，在改善T2DM的血糖水平，胰島素抵抗方面，有一定的開發(fā)潛力。

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（收稿日期：2019-07-05 編輯：陶希睿）