劉芳 廖先清 周榮華 饒犇 陳偉 黃大野 游景茂

摘要：對枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）BZJN1發(fā)酵培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件進行優(yōu)化。結(jié)果表明，BZJN1菌株最適發(fā)酵培養(yǎng)基為玉米粉25.0 g/L、魚粉25.0 g/L、工業(yè)蛋白胨15.0 g/L、玉米漿5.0 g/L、碳酸鈣1.0 g/L、硫酸鎂0.3 g/L、磷酸二氫鉀0.1 g/L。最適發(fā)酵培養(yǎng)條件為初始pH 7.0、培養(yǎng)溫度30 ℃、接種量4%、轉(zhuǎn)速220 r/min，在此條件下，發(fā)酵液芽孢數(shù)可達9.68×109 CFU/mL，相比初始基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件下的發(fā)酵水平提高了約2倍。

關(guān)鍵詞：枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）; 發(fā)酵培養(yǎng)基;條件;優(yōu)化

中圖分類號：TS201.3? ? ? ? ?文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2019）20-0093-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.20.021? ? ? ? ? ?開放科學(xué)（資源服務(wù)）標識碼（OSID）：

Optimization of fermentation mediaum and conditions for Bacillus subtilis BZJN1

LIU Fang1，LIAO Xian-qing1，ZHOU Rong-hua1，RAO Ben1，CHEN Wei1，HUANG Da-ye1，YOU Jing-mao2

（1.Hubei Biopesticide Engineering Research Centre，Wuhan 430064，China;

2.Institute of Chinese Herbal Medicines，Hubei Academy of Agricultural Sciences，Enshi 445000，Hubei，China）

Abstract： The fermentation media and conditions for the strain of Bacillus subtilis BZJN1 had been optimized. It showed that the composition of the optimized medium was as followings： Corn starch 25.0 g/L， fish meal 25.0 g/L， peptone 15.0 g/L， corn steep liquor 5.0 g/L， CaCO3 1.0 g/L， MgSO4 0.3 g/L and KH2PO4 0.1 g/L. The optimized fermentation condition was as following：Starting pH 7.0， temperature 30 ℃， inoculum ratio 4%， and stirring speed 220 r/min. The spore counts of the fermentation culture might reach 9.68×109 CFU/mL under the optimized condition with tthe optimized medium， which was about 2 times higher than that in the primary medium and fermentation condition.

Key words： Bacillus subtilis; fermentation medium; condition; optimization

芽孢桿菌在植物病蟲害生物防治中應(yīng)用較為廣泛[1，2]。它們通過產(chǎn)生殺蟲或抗菌活性、促進植物生長的物質(zhì)，達到殺蟲、防病及促生的作用。芽孢桿菌易于工業(yè)化生產(chǎn)，對人畜及環(huán)境安全，是一類重要的微生物農(nóng)藥資源。

前期研究中從白術(shù)體內(nèi)分離到一株枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）BZJN1菌株，該菌株對多種中藥材致病真菌有較好的室內(nèi)拮抗效果，田間試驗表明，該菌株對白術(shù)根腐病具有較好的防治效果，并對白術(shù)有一定的促生增產(chǎn)效果，具有良好的應(yīng)用開發(fā)前景[3]。本研究以發(fā)酵液中的芽孢數(shù)為指標，對該菌株發(fā)酵培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)條件進行優(yōu)化[4-8]，以提高其發(fā)酵水平，為該菌株的工業(yè)化生產(chǎn)提供技術(shù)支撐。

1? 材料與方法

1.1? 材料

供試菌株枯草芽孢桿菌BZJN1由湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院中藥材研究所從白術(shù)體內(nèi)分離得到并保存。

供試培養(yǎng)基：①LB 培養(yǎng)基，胰蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，酵母提取物5 g，去離子水1 L，pH 7.0，500 mL三角瓶裝液量為100 mL;②基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，葡萄糖10 g，酵母膏5 g，蛋白胨10 g，去離子水 1 L，pH 7.0，500 mL三角瓶裝液量為50 mL;③發(fā)酵培養(yǎng)基，根據(jù)需要具體配制，500 mL三角瓶裝液量為50 mL。

1.2? 方法

1.2.1? 種子液制備? 將斜面菌種接種1環(huán)至LB液體種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至對數(shù)期。

1.2.2? 芽孢數(shù)的測定? 采用稀釋涂布平板計數(shù)法測定，稀釋液涂布LB平板前置于80 ℃水浴20 min。

1.2.3? 發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

1）單因素篩選。①碳源。分別用10 g/L葡萄糖、甘油、蔗糖、玉米粉和玉米淀粉5種碳源作為惟一碳源，基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的其他組分酵母膏、蛋白胨含量不變，pH 7.0，接種量為3%，于30 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)到芽孢脫落分離20%時下?lián)u床，測定發(fā)酵液的芽孢數(shù)，確定最佳碳源。②氮源。固定碳源玉米粉10 g/L，分別以20 g/L尿素、魚粉、豆粕、工業(yè)蛋白胨、酵母膏、蠶蛹粉、花生粕、芝麻粕和玉米漿9種氮源作為惟一氮源進行發(fā)酵培養(yǎng)，玉米漿用量按干物質(zhì)含量折算。pH 7.0，接種量為3%，于30 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)到芽孢脫落分離20%時下?lián)u床，測定發(fā)酵液的芽孢數(shù)，確定最佳氮源。

2）正交試驗設(shè)計。在單因素試驗基礎(chǔ)上，以發(fā)酵液的芽孢數(shù)為考察指標，以玉米粉為碳源，魚粉、工業(yè)蛋白胨、玉米漿為氮源，無機鹽固定為碳酸鈣1.0 g/L、硫酸鎂0.3 g/L、磷酸二氫鉀0.1 g/L，設(shè)計4因素3水平正交試驗（表1），pH 7.0，接種量為3%，于30 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)到芽孢脫落分離20%時下?lián)u床。

1.2.4? 發(fā)酵培養(yǎng)條件的優(yōu)化

①初始pH對BZJN1菌株生長的影響。調(diào)節(jié)最適發(fā)酵培養(yǎng)基的pH分別為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，按3%的接種量接種，于30 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)到芽孢脫落分離20%時下?lián)u床，測定發(fā)酵液的芽孢數(shù)。

②培養(yǎng)溫度對BZJN1菌株生長的影響。根據(jù)pH影響結(jié)果，按3%接種量將種子液轉(zhuǎn)接到pH 7.0的最適發(fā)酵培養(yǎng)基中，分別置于25、30、35、40和45 ℃搖床，于180 r/min條件下培養(yǎng)到芽孢脫落分離20%時下?lián)u床，測定發(fā)酵液的芽孢數(shù)。

③接種量對BZJN1菌株生長的影響。根據(jù)pH、培養(yǎng)溫度影響結(jié)果，分別按1%、3%、5%、7%、9%的接種量接種到pH 7.0的最適發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)到芽孢脫落分離20%時下?lián)u床，測定發(fā)酵液的芽孢數(shù)。

④搖床轉(zhuǎn)速對BZJN1菌株生長的影響。根據(jù)pH、培養(yǎng)溫度、接種量影響結(jié)果，按3%接種量將種子液轉(zhuǎn)接到pH 7.0的最適發(fā)酵培養(yǎng)基中，分別以120、150、180、210、240 r/min的轉(zhuǎn)速于30 ℃條件下培養(yǎng)到芽孢脫落分離20%時下?lián)u床，測定發(fā)酵液的芽孢數(shù)。

⑤最適發(fā)酵培養(yǎng)條件的確定。在pH、溫度、接種量以及轉(zhuǎn)速單因素試驗基礎(chǔ)上，以發(fā)酵液的芽孢數(shù)為考察指標，設(shè)計4因素3水平正交試驗（表2）確定最適培養(yǎng)條件，接種最適發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)到芽孢脫落分離20%時下?lián)u床。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

2.1.1? 碳源? 從圖1可以看出，不同碳源對枯草芽孢桿菌BZJN1發(fā)酵的芽孢數(shù)影響不一，其中玉米粉作為碳源的效果最好，芽孢數(shù)可達到3.52×109 CFU/mL，因此選擇玉米粉為枯草芽孢桿菌BZJN1的碳源。

2.1.2? 氮源? 由圖2可知，枯草芽孢桿菌BZJN1在含有魚粉、工業(yè)蛋白胨、玉米漿的培養(yǎng)基中芽孢數(shù)較高，其中在魚粉作為單一氮源的培養(yǎng)基中芽孢數(shù)可達4.64×109 CFU/mL，因此選擇魚粉、工業(yè)蛋白胨、玉米漿作為枯草芽孢桿菌BZJN1培養(yǎng)基的氮源。

2.1.3? 正交試驗結(jié)果? 由表3和表4的結(jié)果分析可知，影響枯草芽孢桿菌BZJN1發(fā)酵水平主次因素關(guān)系表現(xiàn)為玉米粉>工業(yè)蛋白胨>魚粉>玉米漿，玉米粉的F為2.394，對發(fā)酵的影響最大，而魚粉、玉米漿對發(fā)酵的影響相對較小?？莶菅挎邨U菌BZJN1的最適發(fā)酵培養(yǎng)基為：玉米粉25.0 g/L，魚粉25.0 g/L，工業(yè)蛋白胨15.0 g/L，玉米漿5.0 g/L，碳酸鈣1.0 g/L，硫酸鎂0.3 g/L，磷酸二氫鉀0.1 g/L。搖瓶發(fā)酵液芽孢數(shù)可達7.68×109 CFU/mL。

2.2? 發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.2.1? 初始pH? 由圖3可知，當初始pH為7.0時，枯草芽孢桿菌BZJN1芽孢數(shù)最高，可達7.54×109 CFU/mL，在后續(xù)正交試驗中選擇pH為6.5、7.0、7.5。

2.2.2? 培養(yǎng)溫度? 由圖4可知，當培養(yǎng)溫度為30 ℃時枯草芽孢桿菌BZJN1的芽孢數(shù)最高，可達7.70×109 CFU/mL，在后續(xù)正交試驗中選擇培養(yǎng)溫度為28、30、32 ℃。

2.2.3? 接種量? 由圖5可知，在一定范圍內(nèi)，枯草芽孢桿菌BZJN1發(fā)酵液芽孢數(shù)隨接種量的增加而增加，但當接種量>5%時，發(fā)酵液芽孢數(shù)呈下降趨勢。因為3%接種量和5%接種量芽孢數(shù)差別不大，在后續(xù)正交試驗中選擇3%、4%、5%的接種量。

2.2.4? 轉(zhuǎn)速? 如圖6所示，隨著搖床轉(zhuǎn)速的增加，枯草芽孢桿菌BZJN1芽孢數(shù)也隨之增加，轉(zhuǎn)速為210 r/min時芽孢數(shù)最高，可達8.20×109 CFU/mL，在后續(xù)正交試驗中選擇轉(zhuǎn)速為200、210、220 r/min。

2.2.5? 正交試驗結(jié)果? 由表5和表6的結(jié)果分析可知，影響枯草芽孢桿菌BZJN1發(fā)酵水平培養(yǎng)條件的主次因素關(guān)系表現(xiàn)為pH>溫度>轉(zhuǎn)速>接種量，pH的F為1.799，對發(fā)酵的影響最大，而接種量對發(fā)酵的影響最小?？莶菅挎邨U菌BZJN1的最適培養(yǎng)條件為：pH 7.0，溫度30 ℃，接種量4%，轉(zhuǎn)速220 r/min，在此培養(yǎng)條件下最適發(fā)酵培養(yǎng)基搖瓶發(fā)酵液芽孢數(shù)可達9.68×109 CFU/mL。

3? 討論

農(nóng)業(yè)微生物制劑的生產(chǎn)必須考慮到其生產(chǎn)成本。一般來說，芽孢桿菌制劑的生產(chǎn)中培養(yǎng)基的成本占總成本的20%～35%。因此，在培養(yǎng)基成分的選擇上，考慮其是否適宜于工業(yè)化發(fā)酵、來源是否容易、價格是否低廉。玉米粉作為碳源成分，易于獲得;在氮源的選取上，選取遲效氮源魚粉及速效氮源工業(yè)蛋白胨和玉米漿，以保證整個發(fā)酵過程中氮素的供應(yīng)。通過對其發(fā)酵培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件的優(yōu)化，最終獲得了最適發(fā)酵培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件，枯草芽孢桿菌BZJN1的發(fā)酵液芽孢數(shù)從初始的基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的3.06×109 CFU/mL經(jīng)過優(yōu)化后增加到9.68×109 CFU/mL，發(fā)酵水平提高了約2倍，基本達到了工業(yè)化生產(chǎn)的要求。

在本研究中，以芽孢數(shù)為指標進行枯草芽孢桿菌BZJN1發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的優(yōu)化。但芽孢數(shù)只是芽孢桿菌活性的一部分，在該菌株的工業(yè)化生產(chǎn)前還需要結(jié)合其所產(chǎn)生的活性物質(zhì)對發(fā)酵生產(chǎn)工藝條件進一步優(yōu)化，以實現(xiàn)芽孢數(shù)及活性物質(zhì)的高發(fā)酵水平。

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