涂 強(qiáng)，吳瑞霞，楊 勇，謝 華， 謝華強(qiáng)，陳平英， 曹 政，2

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是嚴(yán)重危害國民健康的重大疾病。脂質(zhì)代謝紊亂和炎癥反應(yīng)是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的重要因素，調(diào)脂和抗炎治療是防治動(dòng)脈粥樣硬化的有效措施[1]。Exendin-4是胰高血糖素樣肽1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)受體激動(dòng)劑，為首個(gè)在美國獲準(zhǔn)的腸促胰島素?cái)M似物。近年來研究發(fā)現(xiàn)，Exendin-4除調(diào)節(jié)血糖外，對(duì)保護(hù)血管內(nèi)皮、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝等均有積極作用，表明其在動(dòng)脈粥樣硬化等心腦血管疾病的防治方面具有潛在價(jià)值[2]。因此，本研究觀察Exendin-4對(duì)高脂飲食載脂蛋白E基因敲除(apolipoprotein E gene knockout，ApoE-/-)小鼠脂代謝、白細(xì)胞介素-6(interlenkin-6，IL-6)、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)及血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecular-1，VCAM-1)表達(dá)的影響，初步探討其抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和試劑 ApoE-/-小鼠購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司(許可證號(hào)：SCXK-京-2012-0001)；Exendin-4購自MedChem Express公司；普通飼料購自武漢萬千佳興生物科技有限公司，高脂飼料購自北京華阜康生物科技股份有限公司(H1014，含21%乳脂、0.15%膽固醇)。逆轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription-PCR，RT-PCR)試劑盒購自TIANGEN公司；IL-6抗體、MCP-1抗體和VCAM-1抗體及β-actin抗體均購自美國Santa Cruz公司；酶聯(lián)免疫反應(yīng)試劑盒購自上海聯(lián)碩生物科技公司；其他試劑均為進(jìn)口分裝或國產(chǎn)分析純。

1.2 分組及給藥 選用清潔級(jí)7～8周的雄性ApoE-/-小鼠40只，體重22～25 g，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為普通飲食組(10只)和高脂飲食組(30只)，喂養(yǎng)8周后再將高脂飲食組隨機(jī)分為非藥物干預(yù)組、Exendin-4低劑量組、Exendin-4高劑量組，每組10只。Exendin-4低劑量組、Exendin-4高劑量組ApoE-/-小鼠分別給予20 μg/(kg·d)、 100 μg/(kg·d)Exendin-4腹腔內(nèi)注射；普通飲食組、非藥物干預(yù)組ApoE-/-小鼠給予0.1 mL生理鹽水腹腔內(nèi)注射。小鼠定期測(cè)量體重，調(diào)整用藥量。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)湖北醫(yī)藥學(xué)院動(dòng)物管理委員會(huì)依據(jù)湖北醫(yī)藥學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物準(zhǔn)則批準(zhǔn)。

1.3 標(biāo)本的采集及處理 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物連續(xù)喂養(yǎng)12周。取材前禁食12 h，腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉后，摘除眼球采血，室溫靜置1 h，4 000 r/min常溫離心10 min，收集上清并置于-80 ℃冰箱保存。取血完畢后，迅速開胸，取胸腹主動(dòng)脈全長，用0.9%氯化鈉沖洗干凈，置于-80 ℃冰箱保存。

1.4 血液生化檢測(cè) 采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)總膽固醇(cholesterol，TC)、三酰甘油(triglyceride，TG)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)及高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)水平。

1.5 RT-PCR分析小鼠主動(dòng)脈IL-6、MCP-1和VCAM-1 mRNA水平 取凍存于-80 ℃冰箱的小鼠主動(dòng)脈組織，按試劑盒提取總RNA，利用260 nm及280 nm吸光度計(jì)算RNA的純度及濃度，取總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，按RT-PCR試劑盒進(jìn)行PCR反應(yīng)，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。引物序列為：β-actin 上游5′-TCAGGTCATCACTATCGGCAAT-3′，下游5′-AAAGAAAGGGTGTAAAACGCA-3′；IL-6上游5′-CTGCAAGAGACTTCCATCCAG-3，下游5′-AGTGGTATAGACAGGTCTGTTGG-3′；MCP-1上游5′-TTCTTCGATTTGGGTCTCCTTG-3′，下游5-GTGCAGCTCTTGTCGGTGAA-3′；VCAM-1上游5′-AGTTGGGGATTCGGTTGTTCT-3′，下游5′-CCCCTCATTCCTTACCACCC-3′。反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，進(jìn)行32個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，取各組PCR產(chǎn)物8 μL，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，120 V電壓電泳20 min，凝膠成像儀攝像，計(jì)算目標(biāo)條帶灰度，并以β-actin的灰度作為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)比。

1.6 Western Blot檢測(cè)小鼠主動(dòng)脈IL-6、MCP-1和VCAM-1蛋白表達(dá) 取凍存于-80 ℃冰箱的小鼠主動(dòng)脈置入含蛋白酶抑制劑及RIPA裂解液中勻漿，勻漿液于4 ℃ 14 000 r/min離心15 min，取上清收集蛋白并測(cè)定蛋白濃度，將上樣總蛋白調(diào)至一致。蛋白經(jīng)10% SDS-PAGE電泳，并轉(zhuǎn)印IL-6、MCP-1及VCAM-1至硝酸纖維素膜上，用5%脫脂奶粉封閉1 h，用相應(yīng)的特異性一抗4 ℃孵育過夜，再經(jīng)洗膜，然后孵育相應(yīng)二抗室溫2 h后，采用堿性磷酸酶顯色試劑盒顯影，Image-Pro Plus 6.0軟件分析目標(biāo)條帶的累積光密度值，并與內(nèi)參β-actin比較。

1.7 小鼠血清IL-6、MCP-1及VCAM-1水平檢測(cè) 采用雙抗體夾心法ELISA試劑盒進(jìn)行操作，顯色終止后于450 nm及630 nm波長測(cè)量吸光度，通過建立標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品濃度。

2 結(jié) 果

2.1 Exendin-4對(duì)小鼠血脂水平的影響 與普通飲食組比較，非藥物干預(yù)組小鼠TC、LDL-C水平明顯增高(P<0.01)，提示高脂飲食可明顯加劇ApoE-/-小鼠脂質(zhì)代謝紊亂。與非藥物干預(yù)組相比，Exendin-4高劑量組小鼠TC及LDL-C水平明顯降低(P<0.05或P<0.01)。各組小鼠TG及HDL-C水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表1。

表1 Exendin-4對(duì)小鼠血清脂質(zhì)水平的影響(±s) mmol/L

與普通飲食組比較，1)P<0.01；與非藥物干預(yù)組比較，2)P<0.05，3)P<0.01；與Exendin-4低劑量組比較，4)P<0.05，5)P<0.01

2.2 Exendin-4對(duì)小鼠主動(dòng)脈IL-6、MCP-1和VCAM-1 mRNA表達(dá)的影響 以β-actin作為對(duì)照，與普通飲食組相比，非藥物干預(yù)組IL-6、MCP-1和VCAM-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯增高(P<0.01)，給予Exendin-4處理后，Exendin-4低劑量組、Exendin-4高劑量組IL-6、MCP-1和VCAM-1 mRNA表達(dá)較非藥物干預(yù)組明顯降低(P<0.05或P<0.01)，且Exendin-4高劑量組IL-6、MCP-1和VCAM-1 mRNA表達(dá)低于Exendin-4低劑量組(P<0.01)。詳見圖1、表2。

A為普通飲食組；B為非藥物干預(yù)組；C為Exendin-4低劑量組；D為Exendin-4高劑量組

組別 只數(shù) IL-6 mRNA MCP-1 mRNAVCAM-1 mRNA普通飲食組10 1.00±0.01 1.01±0.08 1.00±0.02 非藥物干預(yù)組 10 1.99±0.121) 2.08±0.211) 1.68±0.291)Exendin-4低劑量組 10 1.69±0.072) 1.91±0.682) 1.51±0.412)Exendin-4高劑量組 10 1.39±0.053)4) 1.23±0.843)4) 1.29±0.673)4)

與普通飲食組比較，1)P<0.01；與非藥物干預(yù)組比較，2)P<0.05，3)P<0.01；與Exendin-4低劑量組比較，4)P<0.01

2.3 Exendi-4對(duì)小鼠主動(dòng)脈IL-6、MCP-1和VCAM-1蛋白表達(dá)的影響 與普通飲食組相比，非藥物干預(yù)組IL-6、MCP-1和VCAM-1蛋白的表達(dá)量明顯增加(P<0.01)。Exendin-4低劑量組、Exendin-4高劑量組IL-6、MCP-1和VCAM-1蛋白表達(dá)較非藥物干預(yù)組明顯降低(P<0.05或P<0.01)，且Exendin-4高劑量組IL-6、MCP-1和VCAM-1蛋白表達(dá)低于Exendin-4低劑量組(P<0.05或P<0.01)。詳見圖2、表3。

A為普通飲食組；B為非藥物干預(yù)組；C為Exendin-4低劑量組；D為Exendin-4高劑量組

表3 各組小鼠主動(dòng)脈IL-6、MCP-1及VCAM-1 蛋白表達(dá)情況(±s)

與普通飲食組比較，1)P<0.01；與非藥物干預(yù)組比較，2)P<0.05，3)P<0.01；與Exendin-4低劑量組比較，4)P<0.05，5)P<0.01

2.4 Exendi-4對(duì)小鼠血清IL-6、MCP-1和VCAM-1水平的影響 普通飲食組小鼠血清中IL-6、MCP-1和VCAM-1水平均較低，非藥物干預(yù)組小鼠血清中IL-6、MCP-1和VCAM-1水平較普通飲食組明顯升高(P<0.01)，提示高脂飲食可明顯加劇ApoE-/-小鼠炎癥反應(yīng)。給予Exendin-4處理后，Exendin-4低劑量組、Exendin-4高劑量組血清中IL-6、MCP-1和VCAM-1水平較非藥物干預(yù)組明顯降低(P<0.05或P<0.01)，且Exendin-4高劑量組血清中VCAM-1水平低于Exendin-4低劑量組(P<0.01)。詳見表4。

表4 Exendin-4對(duì)小鼠血漿IL-6、MCP-1和VCAM-1含量的影響(±s)

與普通飲食組比較，1)P<0.01；與非藥物干預(yù)組比較，2)P<0.05，3)P<0.01；與Exendin-4低劑量組比較，4)P<0.01

3 討 論

既往研究表明，在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展過程中，脂質(zhì)代謝紊亂和炎癥反應(yīng)是相伴而生的，炎癥可導(dǎo)致脂質(zhì)代謝紊亂，脂質(zhì)代謝紊亂又可加重炎癥反應(yīng)[3]。因此，對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的有效防治，需要對(duì)脂質(zhì)代謝進(jìn)行調(diào)節(jié)，同時(shí)抑制促炎因子的表達(dá)或促進(jìn)抗炎因子的表達(dá)。

載脂蛋白是血漿脂蛋白的重要組成部分，在機(jī)體脂質(zhì)尤其是總膽固醇的代謝中發(fā)揮著極其重要的作用[4]。ApoE-/-小鼠能自發(fā)形成與人類相似病理特征的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊，是研究動(dòng)脈粥樣硬化病理過程的良好動(dòng)物模型，高脂飲食可以明顯促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)程[5]。

本研究選擇IL-6、MCP-1和VCAM-1作為動(dòng)脈粥樣硬化炎癥反應(yīng)的指標(biāo)。IL-6是一種多功能炎癥細(xì)胞因子，具有廣泛生物學(xué)特性。當(dāng)血管內(nèi)皮功能受損時(shí)，IL-6可不同程度升高，并通過刺激巨噬細(xì)胞分泌MCP-1，從而上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)表達(dá)，加重血管壁炎癥反應(yīng)[6]。同時(shí)，IL-6可以誘導(dǎo)血小板源性生長因子的生成從而促進(jìn)平滑肌細(xì)胞增殖，進(jìn)而促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展[7]。MCP-1作為趨化性細(xì)胞因子超家族CC亞家族中的一員，是炎癥反應(yīng)發(fā)生的主要趨化因子之一，在炎癥反應(yīng)發(fā)生時(shí)，促進(jìn)單核細(xì)胞穿過內(nèi)皮，進(jìn)入內(nèi)皮下，逐步分化成為巨噬細(xì)胞進(jìn)而演變成為泡沫細(xì)胞，形成動(dòng)脈粥樣硬化早期脂肪條紋病變[8]。VCAM-1又名CD106，屬于免疫球蛋白超家族，主要表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞表面[9]。在病理因素刺激下，內(nèi)皮細(xì)胞高表達(dá)VCAM-1，VCAM-1不僅促使白細(xì)胞向炎癥部位募集，同時(shí)又可以被白細(xì)胞介素-1(interlenkin-1，IL-1)、IL-6、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)等炎癥因子激活，形成級(jí)聯(lián)反應(yīng)，因此VCAM-1被認(rèn)為是炎癥反應(yīng)的早期事件，同時(shí)是動(dòng)脈粥樣硬化的病理基礎(chǔ)[10]。Exendin-4是GLP-1受體激動(dòng)劑，最初從美國毒蜥唾液中分離得到的含有39個(gè)氨基酸的多肽，與哺乳動(dòng)物GLP-1有53%同源性，和胰高血糖素樣肽受體1(glucagon-like peptide-1 receptor，GLP-1R)結(jié)合產(chǎn)生相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)[11]。研究表明，Exendin-4可通過控制血糖、改善體脂分布，減少心血管并發(fā)癥的發(fā)生[12]。Arakawa等[13]研究表明，Exendin-4可明顯減少單核/巨噬細(xì)胞在血管壁上的聚集，并最終抑制動(dòng)脈粥樣斑塊的形成。

本研究主要探討Exendin-4對(duì)高脂飲食ApoE-/-小鼠脂質(zhì)代謝及炎癥因子表達(dá)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高脂飲食可明顯加劇ApoE-/-小鼠血脂代謝紊亂，應(yīng)用Exendin-4處理后，可改善TC及LDL-C水平，但對(duì)TG及HDL-C水平無明顯影響，可能與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的不同生理狀態(tài)及給藥時(shí)間長短有關(guān)。同時(shí)，通過檢測(cè)小鼠主動(dòng)脈及血漿中IL-6、MCP-1及VCAM-1 表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)Exendin-4干預(yù)能明顯抑制炎癥因子的基因及蛋白表達(dá)。

本研究結(jié)果表明，Exendin-4處理可明顯改善高脂飲食ApoE-/-小鼠TC及LDL-C水平，并下調(diào)IL-6、MCP-1及VCAM-1基因及蛋白表達(dá)水平。這可能是Exendin-4穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣硬化斑塊、抗動(dòng)脈粥樣硬化作用機(jī)制之一。