李柯　趙昆昆　寧龍龍　馬倩　李忠峰　馬興立　張幸果　殷冬梅

摘要：ω-6脂肪酸脫氫酶控制花生中油酸向亞油酸的轉(zhuǎn)化，該酶由AhFAD2基因編碼。為了研究AhFAD2基因的功能，本研究根據(jù)前期已經(jīng)克隆得到的AhFAD2基因序列，設(shè)計(jì)了gRNA前導(dǎo)序列，并構(gòu)建了CRISPR/Cas9基因編輯載體，通過(guò)雙酶切和Sanger測(cè)序確定載體構(gòu)建成功。AhFAD2基因CRISPR/Cas9載體的構(gòu)建為接下來(lái)的遺傳轉(zhuǎn)化及研究該基因的功能奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：花生;FAD2;CRISPR/Cas9;基因敲除

中圖分類號(hào)：S565.2：Q782文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2019）09-0056-08

Construction of CRISPR/Cas9 Multi-Target

Knockout Vector of FAD2 Gene in Peanut

Li Ke， Zhao Kunkun， Ning Longlong， Ma Qian， Li Zhongfeng， Ma Xingli， Zhang Xingguo， Yin Dongmei

（College of Agronomy， Henan Agricultural University， Zhengzhou 450002， China）

Abstract The omega-6 fatty acid dehydrogenase controls the conversion of oleic acid into linoleic acid in peanut， which is encoded by the AhFAD2 gene. In order to research the function of AhFAD2 gene， the gRNA leader sequence was designed based on the sequence of AhFAD2 gene cloned in previous stage， and the CRISPR/Cas9 gene editing vector was constructed in this study. The vector was successfully constructed after determined by double enzyme digestion and Sanger sequencing. The construction of AhFAD2 gene CRISPR/Cas9 vector laid foundations for the subsequent genetic transformation and function study of the gene.

Keywords Peanut; FAD2; CRISPR/Cas9; Gene knockout

基因編輯技術(shù)是利用DNA斷裂及其修復(fù)機(jī)制[1]，使其產(chǎn)生堿基的突變、DNA片段的缺失和插入等現(xiàn)象，達(dá)到使基因不能正常行使功能或改變其功能的目的。DNA雙鏈斷裂（DNA double-strand breaks， DSBs）的現(xiàn)象在分裂活躍的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中每天都會(huì)發(fā)生[2-5]，但這種自發(fā)斷裂難以利用。因此，基因組定點(diǎn)編輯技術(shù)對(duì)基因功能的研究、分子育種和遺傳改良帶來(lái)了巨大的便利。鋅指核酸酶（zinc-finger nucleases，ZFNs）[6]和類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶（transcription activator-likeeffector nucleases，TALENs）[7]技術(shù)是前期應(yīng)用的兩種基因組編輯技術(shù)，ZFNs和TALENs都是由識(shí)別蛋白和核酸內(nèi)切酶兩部分組成，識(shí)別蛋白引領(lǐng)核酸內(nèi)切酶到識(shí)別靶位點(diǎn)，然后核酸內(nèi)切酶在該位點(diǎn)對(duì)DNA進(jìn)行切割產(chǎn)生DSBs，使其在隨后的修復(fù)過(guò)程中產(chǎn)生基因序列的變化[8，9]。但這兩種技術(shù)操作復(fù)雜，成本高昂，限制了其發(fā)展。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)是第三代基因組編輯技術(shù)，來(lái)源于古細(xì)菌和細(xì)菌，Makarova等[10]將該系統(tǒng)分為三種類型：TypeⅠ，TypeⅡ，TypeⅢ。Jinek等[11]發(fā)現(xiàn)TypeⅡ的CRISPR/Cas9效應(yīng)復(fù)合物結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，該系統(tǒng)中的Cas9蛋白是一種核酸酶，該酶與crRNA和tracrRNA結(jié)合就能對(duì)DNA進(jìn)行切割，并且闡明了靶向DNA特定位點(diǎn)的原則。2013年，Cong等[12]直接利用短的特異性RNA引導(dǎo)Cas9核酸酶到人和小鼠的基因特定位點(diǎn)對(duì)DNA進(jìn)行切割。當(dāng)今在各種研究中應(yīng)用最多的就是TypeⅡ類CRISPR/Cas9系統(tǒng)。該系統(tǒng)自2013年誕生以來(lái)，由于操作簡(jiǎn)便、價(jià)格低廉、準(zhǔn)確度高而被廣泛運(yùn)用，成為基因組定點(diǎn)編輯的首選方法[13]。目前，CRISPR/Cas9系統(tǒng)已在擬南芥[14]、煙草[15]、水稻[16]、小麥[17]等植物中應(yīng)用。

花生是重要的油料作物，種子的含油量在50%左右[18]?；ㄉ椭械闹舅嶂饕捎退岷蛠営退峤M成，二者都為不飽和脂肪酸，含量占總脂肪酸的80%左右，且二者呈負(fù)相關(guān)[19]。因?yàn)橛退岷幸粋€(gè)雙鍵，亞油酸含有兩個(gè)雙鍵，因此油酸的化學(xué)性質(zhì)更加穩(wěn)定。油酸含量高的花生及其制品能夠擁有更長(zhǎng)的貨架期[20]。AhFAD2基因編碼ω-6脂肪酸脫氫酶，該酶控制油酸向亞油酸的轉(zhuǎn)化。Abe等[21]通過(guò)CRISPR/Cas9介導(dǎo)的靶向突變破壞了OsFAD2-1基因，獲得的水稻后代油酸含量為野生型的二倍。Wang等[22]發(fā)現(xiàn)AhFAD2基因家族有六個(gè)成員，其中AhFAD2-2為前人研究報(bào)道最多的一個(gè)成員，AhFAD2-1為新發(fā)現(xiàn)在種子中高度表達(dá)的一個(gè)成員。到目前為止，CRISPR/Cas9技術(shù)在花生基因功能研究中的應(yīng)用鮮見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究利用可以同時(shí)連接六個(gè)靶位點(diǎn)引物的CRISPR/Cas9載體，構(gòu)建花生AhFAD2-1和AhFAD2-2基因多靶點(diǎn)CRISPR/Cas9載體，為接下來(lái)的遺傳轉(zhuǎn)化打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌種與質(zhì)粒 [HT]大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α和根癌農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞LBA4404購(gòu)自鄭州寶賽生物技術(shù)有限公司。sgRNA表達(dá)盒載體psgR-AtU6-26、psgR-AtU3b、psgR-At7SL和表達(dá)Cas9蛋白的植物遺傳轉(zhuǎn)化載體pEX-Cas9-At由中國(guó)科學(xué)院上海植物逆境生物學(xué)研究中心朱健康實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)。

1.1.2 主要試劑 [HT]BbsⅠ、HindⅢ、XhoⅠ、XbaⅠ、XmaⅠ限制性內(nèi)切酶購(gòu)自New England Biolabs公司，T4 Ligase、堿性磷酸酶（alkaline? phosphatase）、KpnⅠ和EcoRⅠ限制性內(nèi)切酶購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 靶位點(diǎn)序列的設(shè)計(jì)與引物合成 靶位點(diǎn)序列設(shè)計(jì)利用華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和生物信息學(xué)中心開發(fā)的CRISPR-P 2.0（http：//crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/）在線軟件設(shè)計(jì)。每個(gè)基因設(shè)計(jì)三個(gè)靶位點(diǎn)引物，根據(jù)對(duì)應(yīng)的sgRNA表達(dá)盒載體上的酶切位點(diǎn)，在引物上添加酶切識(shí)別序列。本試驗(yàn)所用引物由北京六合華大基因公司合成，引物序列見(jiàn)表1。

1.2.2 sgRNA表達(dá)盒的構(gòu)建

將質(zhì)粒psgR-AtU6-26、psgR-AtU3b、psgR-At7SL和pEX-Cas9-At轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，分別培養(yǎng)在含氨芐青霉素（50 μg/mL）和卡那青霉素（50 μg/mL）的固體LB培養(yǎng)基上，待長(zhǎng)出菌落后，挑選單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒。載體構(gòu)建流程見(jiàn)圖1。

將靶位點(diǎn)引物用ddH2O溶解為100 μmol/L的母液，取各個(gè)靶位點(diǎn)的正向和反向引物各1 μL，再加入1μL的10×T4 Ligation Buffer，用ddH2O將體系補(bǔ)充到10 μL。將配好的體系放置于PCR儀中，設(shè)置程序?yàn)?5℃ 5 min，然后以0.1℃/s的降溫速度將溫度降至25℃，完成靶位點(diǎn)引物的退火。

用BbsⅠ限制性內(nèi)切酶對(duì)sgRNA表達(dá)盒載體psgR-AtU6-26、psgR-AtU3b、psgR-At7SL分別進(jìn)行單酶切：各加入總量為1 μg的sgRNA表達(dá)盒載體psgR-AtU6-26、psgR-AtU3b、psgR-At7SL，1 μL BbsⅠ限制性內(nèi)切酶，

3 μL的10×Cutsmart Buffer，用ddH2O將體系補(bǔ)充到30 μL，置于37℃反應(yīng)2 h。用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，切下酶切完全的目的條帶，利用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進(jìn)行回收，回收產(chǎn)物置于-20℃下，用于后續(xù)試驗(yàn)。

退火后的靶位點(diǎn)引物與酶切后的sgRNA表達(dá)盒載體psgR-AtU6-26、psgR-AtU3b、psgR-At7SL進(jìn)行連接：將退火后的靶位點(diǎn)引物稀釋200倍到濃度為0.05 μmol/L，其中FAD2-1g1和FAD2-2g1分別與psgR-AtU6-26進(jìn)行連接，F(xiàn)AD2-1g2和FAD2-2g2分別與psgR-AtU3b進(jìn)行連接，F(xiàn)AD2-1g3和FAD2-2g3分別與psgR-At7SL進(jìn)行連接，各反應(yīng)體系加入1 μL稀釋后的靶位點(diǎn)引物，分別加入總量為10 ng的各自相對(duì)應(yīng)的sgRNA表達(dá)盒載體單酶切產(chǎn)物，1 μL的10×T4 Ligation Buffer，0.5 μL的T4 Ligase， 用ddH2O將體系補(bǔ)充到10 μL，置于16℃反應(yīng)2 h。反應(yīng)完后應(yīng)用熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5α，涂布于含100 mg/L Amp的LB固體培養(yǎng)基上，倒置狀態(tài)下37℃培養(yǎng)過(guò)夜。挑選單克隆，接種于含100 mg/L Amp的LB液體培養(yǎng)基中，在37℃、200 r/min的條件下振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。取菌液進(jìn)行PCR檢測(cè)，目標(biāo)片段長(zhǎng)度為360 bp，反應(yīng)體系為：1 μL菌液，1 μL M13F（10 μmol/L），1 μL各靶位點(diǎn)的反向引物（10 μmol/L），10 μL 2×Taq PCR MasterMix，補(bǔ)充ddH2O至20 μL。擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性5 min;95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán);最后72℃延伸5 min。每一個(gè)連接體系挑選一個(gè)陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒。

雙酶切上一步獲取的質(zhì)粒，得到sgRNA表達(dá)盒。雙酶切體系如下：各反應(yīng)體系加入總量為2 μg的質(zhì)粒，連接靶位點(diǎn)的psgR-AtU6-26質(zhì)粒雙酶切體系中加入1 μL HindⅢ和1 μL XhoⅠ，連接靶位點(diǎn)的psgR-AtU3b質(zhì)粒雙酶切體系中加入1 μL XhoⅠ和1 μL XbaⅠ，連接靶位點(diǎn)的psgR-At7SL質(zhì)粒雙酶切體系中加入1 μL XbaⅠ和1μL XmaⅠ，5 μL 10× Cutsmart Buffer，補(bǔ)充ddH2O至50 μL。體系置于37℃反應(yīng)2 h。用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，電泳后，psgR-AtU6-26質(zhì)粒雙酶切體系切下約470 bp的片段，psgR-AtU3b質(zhì)粒雙酶切體系切下約480 bp的片段，psgR-At7SL質(zhì)粒雙酶切體系切下約530 bp的片段，利用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進(jìn)行回收，回收產(chǎn)物即為sgRNA表達(dá)盒。

1.2.3 FAD2-1和FAD2-2的三個(gè)sgRNA表達(dá)盒片段與pEX-Cas9-At載體的連接 pEX-Cas9-At質(zhì)粒的雙酶切：加入總量為2 μg的質(zhì)粒，1 μL HindⅢ，1 μL XmaⅠ，5 μL 10× Cutsmart Buffer，補(bǔ)充ddH2O至50 μL。體系置于37℃反應(yīng)2 h，然后加入

1 μL堿性磷酸酶，37℃反應(yīng)1 h。利用苯酚-氯仿萃取法純化雙酶切后的產(chǎn)物，回收產(chǎn)物溶解在30 μL ddH2O中，-20℃保存。

由于每個(gè)基因的三個(gè)sgRNA表達(dá)盒酶切接頭前后相連，因此在pEX-Cas9-At質(zhì)粒的雙酶切位點(diǎn)處可依次連上這三個(gè)sgRNA表達(dá)盒，連接體系為：在每個(gè)基因的連接體系中加入各為35 ng的三個(gè)sgRNA表達(dá)盒，95 ng pEX-Cas9-At質(zhì)粒的雙酶切回收產(chǎn)物，2 μL的10× T4 Ligation Buffer，1 μL T4 Ligase， 用ddH2O將體系補(bǔ)充到20 μL。體系置于16℃反應(yīng)2 h。反應(yīng)完后應(yīng)用熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5α，涂布于含50 mg/L Kan的LB固體培養(yǎng)基上，倒置狀態(tài)下37℃培養(yǎng)過(guò)夜。挑選單克隆，接種于含50 mg/L Kan的LB液體培養(yǎng)基中，在37℃、200 r/min的條件下振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。取菌液進(jìn)行PCR檢測(cè)，目標(biāo)片段長(zhǎng)度為1 400 bp，反應(yīng)體系為：1 μL菌液，1 μL M13F（10 μmol/L），1 μL連接于psgR-At7SL上的靶位點(diǎn)反向引物（10 μmol/L），10 μL 2×Taq PCR MasterMix，補(bǔ)充ddH2O至20 μL。擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性5 min;95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1.5 min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán);最后72℃延伸5 min。每一個(gè)連接后轉(zhuǎn)化挑選一個(gè)陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒。

1.2.4 第二個(gè)sgRNA表達(dá)盒串聯(lián)片段與pEX-Cas9-At載體的連接 用AtU6-F-KpnⅠ和sgR-R-EcoRⅠ引物對(duì)分別擴(kuò)增上一步獲得的連接有FAD2-1和FAD2-2三個(gè)sgRNA表達(dá)盒串聯(lián)片段的pEX-Cas9-At載體，體系為：質(zhì)粒200 ng，2 μL AtU6-F-KpnⅠ（10 μmol/L），2 μL sgR-R-EcoRⅠ（10 μmol/L），2×Pfu PCR MasterMix 25 μL，補(bǔ)充ddH2O至50 μL。擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性5 min;95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1.5 min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán);最后72℃延伸5 min。擴(kuò)增完畢后，用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，電泳后，切下約1 400 bp處的片段凝膠，利用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進(jìn)行回收，回收產(chǎn)物即為第二個(gè)sgRNA表達(dá)盒串聯(lián)片段，置于-20℃下，用于后續(xù)試驗(yàn)。

用KpnⅠ和EcoRⅠ限制性內(nèi)切酶對(duì)上一步獲得的回收產(chǎn)物和連接有FAD2-1和FAD2-2三個(gè)sgRNA表達(dá)盒串聯(lián)片段的pEX-Cas9-At載體進(jìn)行雙酶切。反應(yīng)體系為：0.5 μg第二個(gè)sgRNA表達(dá)盒串聯(lián)片段/1 μg連接有FAD2-1或FAD2-2三個(gè)sgRNA表達(dá)盒串聯(lián)片段的pEX-Cas9-At載體，1 μL KpnⅠ限制性內(nèi)切酶，1 μL EcoRⅠ限制性內(nèi)切酶，5 μL 10×Cutsmart Buffer，補(bǔ)充ddH2O至

50 μL。體系置于37℃反應(yīng)2 h，然后加入1 μL堿性磷酸酶，37℃反應(yīng)1 h。第二個(gè)sgRNA表達(dá)盒串聯(lián)片段酶切后的純化回收利用DNA純化回收試劑盒進(jìn)行，連接有FAD2-1和FAD2-2三個(gè)sgRNA表達(dá)盒串聯(lián)片段的pEX-Cas9-At載體酶切后的純化回收利用苯酚-氯仿萃取法，回收產(chǎn)物溶解在30 μL ddH2O中，-20℃保存。

將上一步酶切后回收的FAD2-1的sgRNA表達(dá)盒串聯(lián)片段與上一步酶切后回收的連接有FAD2-2三個(gè)sgRNA表達(dá)盒串聯(lián)片段的pEX-Cas9-At載體進(jìn)行連接，連接體系為：95 ng FAD2-1的sgRNA表達(dá)盒串聯(lián)片段，95 ng連接有FAD2-2三個(gè)sgRNA表達(dá)盒串聯(lián)片段的pEX-Cas9-At載體，2 μL 10× T4 Ligation Buffer，1 μL T4 Ligase， 用ddH2O將體系補(bǔ)充到20 μL。體系置于16℃反應(yīng)2 h。反應(yīng)完后應(yīng)用熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5α，涂布于含50 mg/L Kan的LB固體培養(yǎng)基上，倒置狀態(tài)下37℃培養(yǎng)過(guò)夜。挑選單克隆，接種于含50 mg/L Kan的LB液體培養(yǎng)基中，在37℃、200 r/min的條件下振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。取菌液進(jìn)行PCR檢測(cè)，目標(biāo)片段長(zhǎng)度為1 200 bp，反應(yīng)體系為：1 μL菌液，1 μL M13R（10 μmol/L），1 μL連接于psgR-AtU6-26上的靶位點(diǎn)正向引物（10 μmol/L），10 μL 2×Taq PCR MasterMix，補(bǔ)充ddH2O至20 μL。擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性5 min;95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1.5 min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán);最后72℃延伸5 min。挑選一個(gè)陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒。

酶切后回收的FAD2-2的sgRNA表達(dá)盒串聯(lián)片段與上一步酶切后回收的連接有FAD2-1三個(gè)sgRNA表達(dá)盒串聯(lián)片段的pEX-Cas9-At載體的連接同上。

2 結(jié)果與分析

2.1 sgRNA表達(dá)盒的構(gòu)建

用BbsⅠ限制性內(nèi)切酶對(duì)sgRNA表達(dá)盒載體psgR-AtU6-26、psgR-AtU3b、psgR-At7SL分別進(jìn)行單酶切，酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，切下約為3 100 bp的片段，純化回收。退火后的靶位點(diǎn)引物與BbsⅠ限制性內(nèi)切酶單酶切后的sgRNA表達(dá)盒載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑選單克隆，利用PCR進(jìn)行鑒定，陽(yáng)性克隆條帶長(zhǎng)約360 bp（圖2）。各挑選一個(gè)陽(yáng)性克隆擴(kuò)大繁殖后提取質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切，連接靶位點(diǎn)的psgR-AtU6-26質(zhì)粒用HindⅢ和XhoⅠ雙酶切，連接靶位點(diǎn)的psgR-AtU3b質(zhì)粒用XhoⅠ和XbaⅠ雙酶切，連接靶位點(diǎn)的psgR-At7SL質(zhì)粒用XbaⅠ和XmaⅠ雙酶切，酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，切下約為500 bp的片段（圖3），符合預(yù)期為470、480、530 bp的片段大小，回收產(chǎn)物即為sgRNA表達(dá)盒。

2.2 sgRNA表達(dá)盒與pEX-Cas9-At載體的連接

用Hind Ⅲ和XmaⅠ雙酶切pEX-Cas9-At載體，酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，切下約為14 000 bp的片段（圖4A），純化回收。sgRNA表達(dá)盒與pEX-Cas9-At載體連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑選單克隆，利用PCR進(jìn)行鑒定，陽(yáng)性克隆條帶長(zhǎng)約為1 400 bp（圖4B）。各挑選一個(gè)陽(yáng)性克隆擴(kuò)大繁殖后提取質(zhì)粒。

2.3 第二個(gè)sgRNA表達(dá)盒串聯(lián)片段與pEX-Cas9-At載體的連接

用AtU6-F-Kpn Ⅰ和sgR-R-EcoR Ⅰ引物對(duì)擴(kuò)增已經(jīng)連接上sgRNA表達(dá)盒的pEX-Cas9-At載體，獲得第二個(gè)sgRNA表達(dá)盒串聯(lián)片段，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)約1 400 bp（圖5A），電泳后切下目標(biāo)片段，純化回收。

pEX-Cas9-At載體的第二個(gè)連接位點(diǎn)需用KpnⅠ和EcoRⅠ限制酶進(jìn)行切割，且上一步獲得純化產(chǎn)物帶有KpnⅠ和EcoRⅠ限制酶切位點(diǎn)，因此對(duì)載體和純化回收產(chǎn)物雙酶切后進(jìn)行連接反應(yīng)。連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑選單克隆，利用PCR進(jìn)行鑒定，陽(yáng)性克隆條帶長(zhǎng)約為1 200 bp（圖5B）。對(duì)獲得的陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序鑒定，驗(yàn)證目的序列是否正確插入，結(jié)果證明序列正確插入（圖6），載體構(gòu)建成功。

3 討論與結(jié)論

CRISPR/Cas9是一種簡(jiǎn)單、高效的基因編輯系統(tǒng)，針對(duì)不同的基因，每次只需要設(shè)計(jì)一個(gè)或多個(gè)該基因的特異sgRNA即可，相比鋅指核酸酶（ZFNs）和類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶（TALENs）技術(shù)，CRISPR/Cas9節(jié)約了大量的時(shí)間、人力和物力，大大推動(dòng)了基因基礎(chǔ)研究的發(fā)展。

本研究構(gòu)建的CRISPR/Cas9載體同時(shí)包含F(xiàn)AD2-1基因的三個(gè)靶位點(diǎn)和FAD2-2基因的三個(gè)靶位點(diǎn)，且兩個(gè)sgRNA表達(dá)盒串聯(lián)片段所處位置不同。在單個(gè)載體中攜帶多個(gè)基因和多個(gè)靶位點(diǎn)，不僅能夠大大減少載體構(gòu)建的時(shí)間，還能夠增加CRISPR/Cas9系統(tǒng)的編輯效率，可以同時(shí)敲除多個(gè)基因。Ma[23]同時(shí)靶向一個(gè)基因家族的多個(gè)（多達(dá)8個(gè)）成員，并且自T0代水稻和T1代擬南芥中得到了多個(gè)位點(diǎn)突變的個(gè)體。趙恒等[24]構(gòu)建了靶向BnSVP的 CRISPR /Cas9 基因組編輯載體，應(yīng)用雙靶點(diǎn)策略，對(duì)4個(gè)或2個(gè)同源基因進(jìn)行同時(shí)敲除。這與本試驗(yàn)的載體構(gòu)建思路類似，在接下來(lái)的遺傳轉(zhuǎn)化試驗(yàn)中，我們期望可以得到多個(gè)基因位點(diǎn)同時(shí)突變的個(gè)體。

啟動(dòng)子對(duì)CRISPR/Cas9系統(tǒng)行使功能十分重要，應(yīng)用合適的啟動(dòng)子，CRISPR/Cas9系統(tǒng)才能在轉(zhuǎn)化受體內(nèi)發(fā)揮作用。本試驗(yàn)構(gòu)建的載體使用的是pAtU6-26、pAtU3b、pAt7SL和pAtUBQ，主要用于擬南芥CRISPR/Cas9系統(tǒng)。目前，還沒(méi)有針對(duì)花生CRISPR/Cas9系統(tǒng)專門設(shè)計(jì)啟動(dòng)子，因此，我們首先會(huì)嘗試使用這些啟動(dòng)子，在接下來(lái)的遺傳轉(zhuǎn)化試驗(yàn)中驗(yàn)證其在花生中是否具有啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄功能，也可以利用花生自身的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)sgRNA和Cas9蛋白的表達(dá)。石磊等[25]獲得的AhSAD基因的啟動(dòng)子為組成型表達(dá)，在以后的試驗(yàn)中可以將其應(yīng)用于花生的CRISPR/Cas9系統(tǒng)。此外，還可以對(duì)CRISPR/Cas9系統(tǒng)中Cas9蛋白的編碼基因進(jìn)行優(yōu)化，使其在花生中能夠更好地翻譯表達(dá)，建立適合花生的CRISPR/Cas9基因組編輯體系，推動(dòng)花生的基因功能研究、分子育種等工作的快速發(fā)展。

本研究通過(guò)將花生FAD2-1和FAD2-2基因的gRNA與sgRNA骨架連接，雙酶切獲得sgRNA表達(dá)盒，然后分別將兩個(gè)基因的sgRNA表達(dá)盒串聯(lián)連接到pEX-Cas9-At載體，獲得含有單個(gè)基因sgRNA表達(dá)盒串聯(lián)片段的重組載體，而后通過(guò)利用含有酶切位點(diǎn)的引物進(jìn)行PCR，獲得sgRNA表達(dá)盒串聯(lián)片段，分別與已含有另一個(gè)sgRNA表達(dá)盒串聯(lián)片段的重組載體再次連接，獲得同時(shí)針對(duì)兩個(gè)基因且sgRNA表達(dá)盒串聯(lián)片段所處位置不同的重組載體。成功構(gòu)建了針對(duì)花生FAD2-1和FAD2-2的多靶點(diǎn)CRISPR/Cas9基因編輯載體。

參 考 文 獻(xiàn)：

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收稿日期：2019-07-24

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（U1704232）;河南省產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目（S2012-05-G03）

作者簡(jiǎn)介：李柯（1995—），男，河南南陽(yáng)人，碩士研究生。

通訊作者：殷冬梅（1972—），女，河南南陽(yáng)人，博士，教授，主要從事花生遺傳育種工作。E-mail：yindm@126.com