房皓，閆永全，居子逸，廉昇陽，裴曉芳，馬橋，曲媛媛

研究報告

曲媛媛 大連理工大學，教授，主要從事典型環(huán)境污染物的生物轉(zhuǎn)化及微生物生態(tài)效應機制研究。2013年入選教育部“新世紀優(yōu)秀人才支持計劃”，2009年入選遼寧省“百千萬人才工程”千人層次，2008年榮獲第13屆國際生物技術(shù)大會青年科學家獎。主持國家自然科學基金3項、城市水資源與水環(huán)境國家重點實驗室開放基金3項，參與國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃 (863計劃) 1項、國家自然科學基金1項等。2016年獲得遼寧省自然科學學術(shù)成果論文獎二等獎。2013年獲得國家級開放課題優(yōu)秀成果獎。近五年以第一作者或通訊作者發(fā)表SCI論文30余篇，ESI高被引論文2篇。第一發(fā)明人授權(quán)專利5項。已指導博士畢業(yè)6人，在讀6人。2017年獲得優(yōu)秀博士學位論文單項獎學金優(yōu)秀指導教師稱號。

sp. HJ合成納米金銀合金的特性考察

房皓1，閆永全1，居子逸1，廉昇陽1，裴曉芳1，馬橋2，曲媛媛1

1 大連理工大學 環(huán)境學院 工業(yè)生態(tài)與環(huán)境工程教育部重點實驗室，遼寧 大連 116024 2 大連海事大學 環(huán)境科學與工程學院 環(huán)境系統(tǒng)生物學研究所，遼寧 大連 116026

利用微生物合成納米金銀合金 (Au-AgNPs) 具有操作簡便、生態(tài)友好等特點，但目前利用真菌合成的相關(guān)研究較少。本研究利用真菌sp. HJ胞內(nèi)提取物合成納米金銀合金，考察了不同的金銀離子濃度比例對生物合成納米金銀合金特性的影響。實驗表明，金銀離子濃度比例對生物納米金銀合金的組成影響較大，隨著銀離子濃度比例的增加，反應體系顏色會由淺紫色逐漸變?yōu)樽厣?，紫?可見特征吸收峰發(fā)生了明顯的藍移，合成的納米金銀合金中銀的比例也會逐漸增加。透射電子顯微鏡表明納米金銀合金的形貌主要為球形和偽球形，在0.5∶0.5、0.5∶1.5以及0.5∶3.0三種金銀離子濃度比例下，納米顆粒的平均粒徑分別為19.24 nm、15.99 nm和19.33 nm。X射線衍射光譜結(jié)果顯示納米金銀合金的晶胞為面心立方結(jié)構(gòu)。利用傅里葉轉(zhuǎn)換紅外線光譜表征推測參與納米金銀合金還原穩(wěn)定的官能團可能為-OH、-NH3、-COOH。此外，本研究以4-硝基苯酚為底物探究生物納米金銀合金的催化特性，結(jié)果表明納米金銀合金對4-硝基苯酚具有良好的催化活性，其催化反應速率常數(shù)為7.85×10–3s–1。上述結(jié)果表明，真菌sp. HJ能夠合成分散性較好的納米金銀合金，在催化還原硝基芳烴污染物方面具有潛在的應用價值。

納米金銀合金，生物合成，sp.，催化活性，4-硝基苯酚

近年來，納米材料憑借其獨特的物理化學性質(zhì)備受關(guān)注，廣泛應用于催化、能源、生物醫(yī)學、光學和傳感器等諸多領(lǐng)域。傳統(tǒng)的納米材料合成方法主要為能耗較高的物理合成法和使用大量試劑的化學合成法[1]，而生物合成法憑借操作簡便、反應條件溫和及生態(tài)友好等特點，成為當前納米材料合成領(lǐng)域的研究熱點[2]。目前已報道的生物合成資源包括細菌、真菌、藻類等，但真菌的相關(guān)報道相對較少[3-4]。在眾多納米材料中，納米貴金屬復合材料如納米金銀合金呈現(xiàn)出高催化活性和抗菌活性[5]，得到研究者的廣泛青睞。2004年Shanker等首次利用印度楝樹葉子提取物作為天然的還原劑和穩(wěn)定劑成功合成納米金銀合金[6]，開啟了生物合成納米復合貴金屬材料的新篇章。然而迄今為止，對于生物合成納米金銀合金的研究報道仍較少，因此尚有很大的探索空間。

眾所周知，污水中諸如硝基苯酚和偶氮染料等污染物難以生物降解且具有較強的生物毒性[7]。對于此類污染物傳統(tǒng)的治理方法包括化學沉淀、離子交換、吸附和過濾等，但是這些方法很難將污染物完全降解且易造成二次污染[8]。許多研究表明，金屬納米顆粒在污水處理方面，能夠作為有效的催化劑，催化硝基苯酚和徹底降解偶氮染料[9-10]，其催化活性依賴于納米金屬的尺寸、形狀和用量[11]。生物納米貴金屬復合材料不僅整合了單金屬納米材料的功能，而且大大增加了其獨特的結(jié)構(gòu)特性和表面活性，在環(huán)境領(lǐng)域具有潛在的應用價值。探究利用生物合成納米金銀合金的可行性，并對其催化還原特性進行考察，將有助于為污染物降解提供綠色無毒、高效可行的新方法。

本實驗室前期從活性污泥中分離得到一株真菌sp. HJ[12]，通過相關(guān)實驗已驗證其同時具有合成納米金及納米銀的能力。本研究首先考察菌株HJ合成納米金銀合金的能力，隨后考察不同金銀離子濃度比例對合成納米金銀合金過程的影響，通過紫外-可見光譜掃描、透射電子顯微鏡、X射線衍射和傅里葉紅外光譜等手段對納米金銀合金進行表征和分析，并選取4-硝基苯酚為底物探究納米金銀合金的催化活性。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株

本實驗所用菌株sp. HJ為本實驗室前期從活性污泥中篩選分離得到[12]，現(xiàn)保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No. 10030。菌株HJ的26S rRNA基因序列 (521 bp) 已提交到GenBank數(shù)據(jù)庫，登錄號為KP330204[12]。

1.1.2 實驗所用試劑

實驗所用氯金酸購自百靈威科技有限公司 (純度99.9%，Au 49%最低)，硝酸銀和4-硝基苯酚購自國藥集團化學試劑有限公司。其余使用的藥品均為分析純及以上。

1.1.3 溶液配制

HAuCl4溶液：稱取1 g HAuCl4溶于超純水中，定容至50 mL，得到濃度為50 mmol/L的HAuCl4溶液，4 ℃條件下避光保存?zhèn)溆谩?/p>

AgNO3溶液：稱取0.169 9 g AgNO3溶于超純水中，定容至10 mL，得到濃度為100 mmol/L的AgNO3溶液，4 ℃條件下避光保存?zhèn)溆谩?/p>

4-硝基苯酚溶液：稱取0.002 8 g 4-硝基苯酚溶于10 mL去離子水中，配制濃度為2 mmol/L的溶液，于4 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

NaBH4溶液：稱取0.189 2 g NaBH4溶于10 mL去離子水中，得到濃度為50 mmol/L的溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株培養(yǎng)

sp. HJ采用改良馬丁培養(yǎng)基 (MMB)培養(yǎng)，培養(yǎng)基主要成分包括：(NH4)2SO41.0 g/L，KH2PO41.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，葡萄糖1.0 g/L，pH 7.0，培養(yǎng)基于115 ℃、15 min滅菌后使用。接菌量為1%，接菌后的培養(yǎng)基于30 ℃、150 r/min恒溫搖床中振蕩培養(yǎng)。

1.2.2 納米金銀合金的合成

收集培養(yǎng)24 h的菌株HJ進行實驗，用定性濾紙過濾菌體，超純水沖洗數(shù)次以去除殘余培養(yǎng)基組分。稱取適量清洗后的菌體，加入適量磷酸鹽緩沖溶液 (PBS，50 mmol/L，pH 7.0) 重懸，利用超聲破碎儀 (Ultrasonic Processor CPX 750，美國) 破碎40 min。將破碎后得到的混合液于 10 000 r/min、4 ℃條件下離心10 min，取上清液過膜3次后 (0.45 μm，水膜)，得到菌株HJ的細胞提取物。

利用考馬斯亮藍法測定提取物中的蛋白濃度，并用PBS溶液調(diào)節(jié)蛋白濃度為300 mg/L。取5 mL細胞提取物于10 mL小管中，加入HAuCl4與AgNO3溶液，將小管密封后置于30 ℃、150 r/min搖床中避光反應。Au∶Ag濃度分別為0.5∶0.5、0.5∶1.0、0.5∶1.5、0.5∶2.0、0.5∶3.0，以及不加入HAuCl4與AgNO3的細胞提取物作為空白對照。

1.2.3 納米金銀合金的表征

紫外-可見分光光度計：將合成的納米金銀合金用紫外-可見光分光光度計 (UV-vis，JASCO V-560，日本) 在250–500 nm波長范圍進行全波長掃描，掃描間隔1 nm。

透射電子顯微鏡：取適量納米金銀合金溶液于10 000 r/min條件下離心5 min，棄上清，沉淀用去離子水清洗3遍以去除游離蛋白，將得到的樣品于80 ℃下干燥24 h備用。另取菌株HJ破碎后的提取物于80 ℃下干燥24 h作為對照。最后將樣品進行透射電子顯微鏡 (TEM, Tecnai G220 S-Twin型，美國FEI公司) 表征分析。

傅立葉紅外光譜儀：將干燥后的納米金銀合金和提取物分別與溴化鉀混合，于瑪瑙研缽中充分混合研磨，將研磨好的粉末壓片，在室溫下用傅立葉紅外光譜儀 (FTIR, Shimadzu IR Prestige-21, 日本島津公司) 400–4 000 cm–1范圍內(nèi)測量其吸收光譜，掃描速度為5 kHz。

X射線衍射光譜：使用X-射線衍射儀 (XRD，DMAX-2000，Rigaku公司) 進行納米金銀合金樣品的物相分析，射線源為Cu-Kα輻射 (λ=1.541 8 ?)，Ni濾液，石墨單色器，管電流40–60 mA，管電壓40 kV。在測樣前把催化劑樣品研磨成粉末狀，然后固定在載玻片上測定，掃描速率為4°/min。

1.2.4 納米金銀合金對4-硝基芳烴的催化還原

利用4-硝基苯酚的催化還原反應考察合成的納米金銀合金催化特性。取100 μL的4-硝基苯酚溶液 (2 mmol/L) 與400 μL的NaBH4溶液 (50 mmol/L) 混合。由TEM圖分析可知，當加入金銀離子比例為0.5∶1.5時，合成的納米金銀合金平均粒徑最小，相對表面積大，表面共振等離子體效應強，據(jù)文獻報道納米粒子粒徑越小催化性能越強，故我們選擇加入金銀離子比例為0.5∶1.5合成的納米金銀合金催化降解4-硝基苯酚。加入10 μL納米金銀合金溶液，最后用超純水調(diào)節(jié)反應體系總體積為2 mL。使用紫外可見分光光度計監(jiān)測這一反應過程，于250–500 nm處定時連續(xù)全波掃描，掃描間隔1 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同金銀離子比例對合成產(chǎn)物的影響

本實驗探究了不同比例的Au、Ag離子濃度對真菌sp. HJ合成納米金銀合金的影響。在實驗中分別選取Au∶Ag離子濃度比為0.5∶0.5、0.5∶1.0、0.5∶1.5、0.5∶2.0、0.5∶3.0時加入反應體系，待穩(wěn)定后觀察其顏色變化以及UV-vis光譜圖的變化。結(jié)果如圖1A所示，在不同比例的金銀離子濃度條件下合成的納米金銀合金有明顯的顏色差異，與空白組對照可觀察到反應體系中均產(chǎn)生了紫色及深紫色的物質(zhì)。當金銀離子濃度比為0.5∶0.5、0.5∶1.0時溶液呈現(xiàn)淺紫色和紫色，而隨著銀離子濃度的增加，反應后體系顏色逐漸變深，當金銀離子濃度比為0.5∶3.0時，反應體系顏色最深，呈棕色。不同反應體系的UV-vis如圖1B所示，當金銀離子濃度比為0.5∶0.5和0.5∶1.0時，反應體系在550 nm左右有明顯的特征吸收峰，而當金銀離子濃度比為0.5∶1.5、0.5∶2.0和0.5∶3.0時，反應體系在530 nm左右有明顯的特征吸收峰。通常納米金的特征吸收峰值范圍為500–600 nm，而納米銀的特征吸收峰值范圍為400–500 nm[13]。而我們觀察到隨著混合體系中銀離子濃度的增加，其特征吸收峰值發(fā)生明顯的藍移，從550 nm變?yōu)?30 nm，結(jié)合納米金和納米銀的特征吸收峰值的范圍推測這是由于合成的納米金銀合金中銀的比例逐漸增加而形成的。

圖1 不同金銀離子濃度比例下菌株HJ合成納米金銀合金的顏色 (A) 及UV-vis光譜圖 (B)

2.2 納米金銀合金的表征

為進一步觀察合成的納米合金的形貌，本研究利用透射電子顯微鏡對合成的納米金銀合金進行表征，結(jié)果如圖2所示。該方法合成的納米金銀合金尺寸與形貌都較為均一且分散性良好，主要為球形和偽球形。利用粒徑分析軟件計算可得菌株HJ在3種不同的金銀離子濃度比例下合成的納米顆粒的平均粒徑分別約為19.24 nm、15.98 nm和19.33 nm。

對合成的納米金銀合金進行XRD表征分析，結(jié)果如圖3所示。其2θ在26.38°、33.28°、38.62°、44.83°、65.69°以及78.79°處出現(xiàn)的6個衍射峰分別與金銀合金面心立方 (FCC) 結(jié)構(gòu)標準對比卡 (ICDD card No. 87-0597) 的 (111)、(200)、(111)、(220)、(311) 晶面相對應，以 (200) 晶面為主，說明菌株HJ合成的納米金銀合金晶體結(jié)構(gòu)為面心立方結(jié)構(gòu)[14-15]。

為探索在合成納米金銀合金過程中所起作用的生物大分子，本研究利用FTIR分別對菌株HJ胞內(nèi)提取物以及納米金銀合金的表面官能團進行檢測，表征結(jié)果如圖4所示。菌株HJ胞內(nèi)提取物在~3 300 cm–1、~2 920 cm–1、~2 850 cm–1、 ~1 740 cm–1、~1 650 cm–1、~1 400 cm–1、~1 300 cm–1和~1 080 cm–1處出現(xiàn)特征吸收峰。其中， ~3 300 cm–1可能是-OH伸縮振動產(chǎn)生；~2 920 cm–1和~2 850 cm–1可能是-CH3與-CH2伸縮振動峰；~1 740 cm–1可能為-COOH或-COOR特征吸收峰；~1 650 cm–1處的特征吸收峰可能為氨基Ⅰ的特征峰；~1 400 cm–1可能是-C-H的變形振動產(chǎn)生的結(jié)果；~1 080 cm–1處可能為-C-N的伸縮振動的特征吸收峰[16]。通過對比發(fā)現(xiàn)與菌株HJ胞內(nèi)提取物相比合成的納米金銀合金在~1 540 cm–1出現(xiàn)了特異的特征吸收峰，其對應的官能團為氨基Ⅱ。由此可以推斷，在納米金銀合金合成與穩(wěn)定的過程中-OH、-NH3、-COOH等官能團可能參與反應[17-18]。

圖2 不同金銀離子濃度條件下菌株HJ合成納米金銀合金的TEM圖及其尺寸分布

圖3 菌株HJ合成納米金銀合金的XRD光譜圖

圖4 菌株HJ合成納米金銀合金的FTIR光譜圖

2.3 納米金銀合金對4-硝基苯酚的催化還原

4-硝基苯酚是環(huán)境中常見的一種有機污染物，由于該類污染物存在高毒性、難降解等問題，在我國被列為水中優(yōu)先控制的污染物之一[19]。在許多研究中，4-硝基苯酚的還原反應常常被用于檢驗催化材料的活性。本實驗選取4-硝基苯酚 (4-NP) 作為底物，考察菌株HJ胞內(nèi)提取物合成的納米金銀合金的催化性能。在常溫條件下4-NP呈現(xiàn)淡黃色，特征吸收峰位于320 nm處，加入NaBH4后混合溶液變?yōu)樯铧S色，同時特征吸收峰位置由320 nm轉(zhuǎn)移至400 nm，對應生成的新物質(zhì)——4-硝基苯酚鈉[20]，如圖5A所示。加入納米金銀合金后，400 nm處的特征吸收峰迅速下降，同時在310 nm處出現(xiàn)新的特征吸收峰，其對應產(chǎn)物為4-氨基苯酚。反應360 s后，反應體系黃色完全消退，400 nm處的特征吸收峰完全消失，證明該反應結(jié)束。由于該反應中NaBH4的濃度遠高于4-NP的濃度，因此可以認為NaBH4的濃度在整個反應中始終保持不變，該反應服從假一級反應。該反應/0-關(guān)系如圖5B 所示，90 s時4-NP的去除率達到50%，300 s時4-NP去除率為90%。根據(jù)反應動力學方程計算可知，該反應的催化反應速率常數(shù)為7.85×10–3s–1。2017年P(guān)ei等利用sp. HJ合成的納米金顆粒催化還原4-NP的催化速率常數(shù)為5.7×10–3s–1[18]。Narayanan等利用sp.合成的納米金顆粒在硼氫化鈉的作用下催化還原4-NP的催化速率常數(shù)為4.45×10–4s–1[21]，與本實驗結(jié)果相比較說明利用菌株HJ胞內(nèi)提取物合成的納米金銀合金的催化性能優(yōu)于單金屬的納米金顆粒。

圖5 納米合金催化4-NP的UV-vis光譜 (A)及速率曲線 (B)

3 結(jié)論

本研究利用菌株sp. HJ胞內(nèi)提取物合成納米金銀合金，采用UV-vis、TEM、XRD、FTIR等方法對納米金銀合金的特性進行表征，最后考察了納米合金對4-硝基苯酚催化還原能力，得出如下結(jié)論：1) 菌株HJ胞內(nèi)提取物能夠合成納米金銀合金，反應體系中金銀離子比例不同會對納米金銀合金的組成產(chǎn)生一定影響，銀離子比例越大，合金中納米銀所占比例也越大。2) 在本實驗中合成的納米金銀合金主要為球形和偽球形，晶型為面心立方結(jié)構(gòu)。通過FTIR分析，推測菌株HJ的胞內(nèi)提取物中含-OH、-NH3、-COOH等官能團的物質(zhì)，在其合成過程中起到重要作用。3) 本實驗合成的納米金銀合金對4-硝基苯酚具有良好的催化還原活性，其催化速率常數(shù)為7.85×10–3s–1，通過比較可知在相同條件下菌株HJ合成的納米金銀合金的催化性能優(yōu)于單金屬的納米金顆粒。

本文利用綠色低毒的生物法成功制備了納米金銀合金，為綠色合成貴金屬以及合金納米材料的發(fā)展提供了一定的參考。同時我們發(fā)現(xiàn)納米金銀合金對4-硝基苯酚還原的催化能力相較于單金屬的納米金及納米銀顆粒更好，對污水中難降解有機污染物的高效處理開辟了新的思路和方向。

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Characterization of Au-Ag nanoparticles biosynthesized by fungussp. HJ

Hao Fang1, Yongquan Yan1, Ziyi Ju1, Shengyang Lian1, Xiaofang Pei1, Qiao Ma2, and Yuanyuan Qu1

1(),,,116024,,2,,,116026,,

Biosynthesis of gold-silver alloy nanoparticles (Au-AgNPs) is a simple operation and ecological friendly, but with limited reports on the availability of fungal resources. In this study, cell-free extracts ofsp. HJ was used to synthesize Au-AgNPs, and the effects of the different ratios of Au and Ag ion concentrations on the synthesis of Au-AgNPs were also studied. The results clearly showed that the ratio of Au and Ag ion concentrations had an impact on the composition of Au-AgNPs. With the Ag ion increasing, the color of culture supernatant changed from light purple to brown and an obvious blue shift of characteristic absorption peak was observed in UV-vis spectra, indicating an increase of the percentage of Ag in the Au-AgNPs. Transmission electron microscope showed that the morphologies of the Au-AgNPs were mainly spherical and pseudo spherical, and the average particle sizes of the Au-AgNPs at three different ion concentrations, including 0.5:0.5, 0.5:1.5 and 0.5:3.0, were 19.24 nm, 15.99 nm and 19.33 nm, respectively. X-ray diffraction results showed that the Au-AgNPs had a surface-centered cubic structure. Fourier transform infrared spectroscopy was used to characterize and speculate the involvement of -OH, -NH3and -COOH functional groups in the reduction and stability process of Au-AgNPs. Furthermore, 4-nitrophenol (4-NP) was used to explore catalytic activity of Au-AgNPs. Catalytic experiments demonstrated that the Au-AgNPs had a good catalytic activity on 4-NP reduction with a catalytic reaction rate constant of 7.85×10–3s–1. In brief, the present study suggested thatsp. HJ could synthesize Au-AgNPs with good dispersity, and had a potential application in the catalytic reduction of nitro aromatic hydrocarbons.

gold-silver alloy nanoparticles, biosynthesis,sp., catalytic ability, 4-nitrophenol

April25, 2019;

August19, 2019

The Open Project of State Key Laboratory of Urban Water Resource and Environment, Harbin Institute of Technology (No. QAK201943), National Natural Science Foundation of China (No. 31970107).

Yuanyuan Qu. E-mail: qyy@dlut.edu.cn

房皓, 閆永全, 居子逸, 等.sp. HJ合成納米金銀合金的特性考察. 生物工程學報, 2019, 35(11): 2061–2068.

Fang H, Yan YQ, Ju ZY, et al. Characterization of Au-Ag nanoparticles biosynthesized by fungussp. HJ. Chin J Biotech, 2019, 35(11): 2061–2068.

哈爾濱工業(yè)大學城市水資源與水環(huán)境國家重點實驗室開放課題 (No. QAK201943)，國家自然科學基金 (No. 31970107) 資助。

(本文責編 郝麗芳)