陳克保 林宜錦 歐夢(mèng)瑩

摘要 ? ?蜜環(huán)菌作為天麻重要共生菌，能為天麻的生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)。了解區(qū)域性蜜環(huán)菌的多樣性有助于選育優(yōu)良的土著蜜環(huán)菌，進(jìn)而提高區(qū)域性天麻的產(chǎn)量和質(zhì)量。本文應(yīng)用純培養(yǎng)技術(shù)和基于ITS基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析，對(duì)金口河區(qū)板廠坪天麻種植區(qū)分離的21份蜜環(huán)菌進(jìn)行了多樣性研究。結(jié)果表明，21株蜜環(huán)菌劃分為6個(gè)形態(tài)類(lèi)群;系統(tǒng)發(fā)育分析顯示分離菌株與Armillaria同源性最近，相似性都在99% 以上，主要分布在Armillaria gallica、Armillaria sinapina和Armillaria mellea 3個(gè)種內(nèi)。

關(guān)鍵詞 ? ?蜜環(huán)菌;分離;系統(tǒng)發(fā)育;四川樂(lè)山;金口河區(qū)

中圖分類(lèi)號(hào) ? ?Q949.32 ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 ? ?A

文章編號(hào) ? 1007-5739（2019）20-0049-03 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）

Abstract ? ?As an important symbiotic bacterium of Gastrodia elata，Armillaria can provide nutrition for the growth of Gastrodia elata. Understanding the diversity of regional honey fungus will help to select excellent Armillaria，and thus increase the yield and quality of Gastrodia elata. In this paper，the pure culture technique and phylogenetic analysis based on ITS gene sequence were used to study the diversity of 21 Armillaria isolated from the Gastrodia elata planting area of Jinkouhe district Banchangping.The results showed that 21 strains of Armillaria were divided into 6 morphological groups. The phylogenetic analysis showed that the isolates had the closest homology with Armillaria，and the similarity was over 99%，mainly distributed in Armillaria gallica，Armillaria sinapina and Armillaria mellea.

Key words ? Armillaria;isolation;phylogeny;Leshan Sichuan;Jinkouhe District

蜜環(huán)菌（Armillaria）隸屬于真菌門(mén)擔(dān)子菌亞門(mén)層菌綱傘菌目口蘑科蜜環(huán)菌屬的一種藥食兩用真菌，在世界各地均有分布[1]。目前全世界已經(jīng)鑒定的蜜環(huán)菌生物種有40多種，其中歐洲7個(gè)、北美洲10個(gè)、非洲5個(gè)、澳洲5個(gè)，亞洲至少19個(gè)，我國(guó)分布有15種[2]。該屬真菌有些種可與天麻和豬苓共生為天麻和豬苓的生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)，天麻共生蜜環(huán)菌生物種有Armillaria gallica、Lineage 1、CBS O、CBS L、Armillaria nabsnona、Nag. E 和Armillaria cepistipes，而豬苓共生蜜環(huán)菌的種類(lèi)尚未明確[3]。蜜環(huán)菌屬有些種還是嚴(yán)重的森林病原菌[4]，能侵染針葉樹(shù)、闊葉樹(shù)等600多種樹(shù)木引起根腐病，造成經(jīng)濟(jì)損失[5]。此外，有些種則具有重要的食藥用價(jià)值。東北名菜“小雞燉蘑菇”中的蘑菇別稱榛蘑就是蜜環(huán)菌中的一種[6]。蜜環(huán)菌還具有催眠、鎮(zhèn)靜、改善心腦、血液循環(huán)、降血糖、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫和抑制腫瘤等藥用價(jià)值[7]。

在過(guò)去的幾十年里，基于形態(tài)特征（子實(shí)體大小、形狀、孢子顏色等）和交配試驗(yàn)對(duì)蜜環(huán)菌物種的鑒定取得了很大的進(jìn)展。然而，由于蜜環(huán)菌生物種類(lèi)眾多且形態(tài)特征相似，這些方法都非常有限[8]。近年來(lái)，分子生物學(xué)技術(shù)在蜜環(huán)菌生物種的鑒定方面得到了很好的應(yīng)用[9]。在分子生物學(xué)技術(shù)中，采用單個(gè)的ITS、IGS、EF-1α序列鑒定方法，不能準(zhǔn)確鑒定到每一個(gè)蜜環(huán)菌種[6]，而多序列結(jié)合RFLP 等技術(shù)的應(yīng)用，使難以區(qū)分的近緣種或未知種的準(zhǔn)確鑒定成為可能[1]。

金口河板廠坪天麻種植區(qū)地處四川盆地西南邊緣，該區(qū)分布有大量的杉木、柳杉、核桃等喬木樹(shù)種以及珙桐、水杉、銀杏等珍貴樹(shù)種。同時(shí)板廠坪天麻種植區(qū)海拔1 900 m，年均氣溫17 ℃，年日照時(shí)數(shù)1 130 h，年均降水量1 100 mm，平均濕度在80%左右，非常適合蜜環(huán)菌的生長(zhǎng)[10]，而此地區(qū)蜜環(huán)菌的研究還未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本研究嘗試從金口河板廠坪天麻種植區(qū)采集樣本，分離蜜環(huán)菌，應(yīng)用可培養(yǎng)技術(shù)和基于ITS基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析該地區(qū)蜜環(huán)菌的多樣性，以期為開(kāi)發(fā)金口河蜜環(huán)菌資源及探索適合天麻生長(zhǎng)的本地蜜環(huán)菌選育提供參考。

1 ? ?材料與方法

1.1 ? ?試驗(yàn)材料

1.1.1 ? ?菌株。蜜環(huán)菌菌材采自樂(lè)山市金口河區(qū)板廠坪天麻種植區(qū)，將采回后的菌材培養(yǎng)在外尺寸530 mm×370 mm×270 mm、內(nèi)尺寸485 mm×330 mm×220 mm、裝有2/3土壤、濕度70%～80%的周轉(zhuǎn)箱中，同時(shí)立刻進(jìn)行分離蜜環(huán)菌。

1.1.2 ? ?分離純化培養(yǎng)基。①分離培養(yǎng)基：玉米麥麩培養(yǎng)基（玉米粉100 g，麥麩80 g，大豆10 g，白糖18 g，水1 000 mL）;純化培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（新鮮土豆200 g，切成小塊，加入蒸餾水1 000 mL，水煮沸時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí)，30 min后，停止加熱，用紗布過(guò)濾，補(bǔ)充濾液至1 000 mL，濾液中加入2%葡萄糖，濾液加熱后，加入1.5～2.0%瓊脂，培養(yǎng)基制作完成，并常規(guī)倒平板或斜面，待用）。

1.1.3 ? ?主要試劑和儀器。玉米粉、麥麩、大豆粉、白糖和新鮮土豆，購(gòu)于超市;Biospin真菌基因組DNA提取試劑盒，購(gòu)于杭州博日科技有限公司;PCR試劑，購(gòu)于生工生物工程（上海）股份有限公司;瓊脂糖為BIOWEST AGAROSE;PCR擴(kuò)增儀為EasyCycler;電泳儀為DYY-8C型，北京六一儀器廠;凝膠成像儀為BioDocAnalyze;本研究使用的真菌通用引物ITS4和ITS5由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 ? ?試驗(yàn)方法

1.2.1 ? ?菌索分離、純化。試驗(yàn)采用黃萬(wàn)兵等[11]和張玉方[12]相結(jié)合的分離方法對(duì)蜜環(huán)菌進(jìn)行分離，即在超凈工作臺(tái)中用無(wú)菌水將蜜環(huán)菌菌索洗凈，用75%酒精浸泡30 s，用無(wú)菌濾紙擦干菌索，用左右手的拇指和食指分別捏住菌索相距1 cm處，在酒精燈火焰旁緩慢用力向兩邊拉至斷裂，斷裂處會(huì)拉出長(zhǎng)短不一的白色菌絲，用無(wú)菌剪刀剪取3～5 mm白色菌絲，接種于玉米麥麩培養(yǎng)基，置于26 ℃恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)。培養(yǎng)6 d后將分離培養(yǎng)基中的菌索按以上操作接種于PDA培養(yǎng)基內(nèi)，并在相同條件下培養(yǎng)，觀察記錄菌索形態(tài)特征。

1.2.2 ? ?DNA提取。蜜環(huán)菌菌索用無(wú)菌水沖洗，用無(wú)菌濾紙吸干菌索表面水分，-80 ℃冷凍備用;DNA提取采用Biospin真菌基因組DNA提取試劑盒，提取步驟按說(shuō)明書(shū)嚴(yán)格操作。

2 ? ?結(jié)果與分析

2.1 ? ?分離菌株的形態(tài)特征

從板廠坪天麻種植基地分離得到21株蜜環(huán)菌，采用黃萬(wàn)兵[15]對(duì)蜜環(huán)菌形態(tài)類(lèi)群劃分方法，將分離的21株蜜環(huán)菌劃分為6個(gè)形態(tài)類(lèi)群。G1類(lèi)群菌株菌索開(kāi)始生長(zhǎng)時(shí)間相對(duì)較早，菌索直徑較細(xì)，分支不明顯，生長(zhǎng)不彎曲;G4類(lèi)群菌株菌索開(kāi)始生長(zhǎng)相對(duì)較晚，菌索直徑較粗，分支明顯，生長(zhǎng)卷曲（表1）。

2.2 ? ?菌株DNA提取及系統(tǒng)發(fā)育分析

各類(lèi)群菌株在培養(yǎng)6 d后菌索達(dá)到DNA提取用量，試驗(yàn)選取6個(gè)代表菌株進(jìn)行DNA提取，真菌通用引物ITS4和ITS5擴(kuò)增的DNA分子大小在850 bp左右，擴(kuò)增結(jié)果和凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果一致（圖1），PCR擴(kuò)增得到了較高質(zhì)量的總DNA，擴(kuò)增片段經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳可以檢測(cè)到清晰明亮的PCR擴(kuò)增條帶。

根據(jù)測(cè)序結(jié)果，經(jīng)SeqMan軟件拼接序列后，6個(gè)菌株的ITS序列長(zhǎng)度范圍在853～870 bp之間，GC含量在43.84%～44.31%之間。將6個(gè)菌株的ITS序列在GenBank公共數(shù)據(jù)庫(kù)中用Blast程序進(jìn)行序列比對(duì)，分離菌株與Armillaria同源性最近，相似性比對(duì)都在99%以上。M1和Armillaria gallica的相似性為99.17%，M2、M5和Armillaria mellea的相似性均為99.64%，M3、M4和Armillaria sinapina的相似性為99.06%，M6和Armillaria mellea的相似性為99.30%（表2）。

本文對(duì)蜜環(huán)菌的ITS序列進(jìn)行測(cè)定和系統(tǒng)發(fā)育分析，并構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖2）。系統(tǒng)發(fā)育分析和序列比對(duì)結(jié)果一致，M1菌株和Armillaria gallica聚在一支，支持率為100%;M2、M5、M6親緣關(guān)系較近，以87%的支持率占據(jù)一支，同時(shí)和Armillaria mellea以73%的支持率聚在一大支。

3 ? ?結(jié)論與討論

本文基于ITS序列對(duì)金口河區(qū)板廠坪天麻種植區(qū)蜜環(huán)菌進(jìn)行了分子鑒定，共鑒定出3種蜜環(huán)菌物種：Armillaria gallica、Armillaria sinapina和Armillaria mellea。與貴州天麻主產(chǎn)區(qū)和鄂西地區(qū)的蜜環(huán)菌生物種相比較，金口河區(qū)板廠坪天麻種植區(qū)蜜環(huán)菌物種多樣性相對(duì)較低[6，11]，造成這種現(xiàn)象的原因可能是單個(gè)的ITS、IGS、EF-1α序列的鑒定方法不能準(zhǔn)確對(duì)此地區(qū)部分蜜環(huán)菌進(jìn)行鑒定[6]。門(mén)金鑫等[1]研究表明，用于蜜環(huán)菌生物種的鑒定還有限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性技術(shù)（RFLP，restriction fragment length polymorphism）和隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性 DNA 技術(shù)（RAPD，random amplified polym-orphic DNA）等，但這些技術(shù)也只能準(zhǔn)確鑒定部分蜜環(huán)菌生物種。多序列結(jié)合RFLP 等技術(shù)更能較好地對(duì)金口河區(qū)板廠坪天麻種植區(qū)蜜環(huán)菌資源進(jìn)行鑒定。

在本文鑒定出的蜜環(huán)菌生物種中，3種蜜環(huán)菌在歐洲、北美洲以及亞洲均有分布，卻在澳洲和非洲未見(jiàn)分布[16-17]。通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)造成這種差異性的原因可能是蜜環(huán)菌對(duì)不斷變化的地理環(huán)境的適應(yīng)，從而進(jìn)化出不同的物種。此外，根據(jù)Coetzee MPA等[18]對(duì)中國(guó)蜜環(huán)菌的研究，這3種蜜環(huán)菌在中國(guó)均有分布，然而在不同省份[6，11]蜜環(huán)菌的分布情況也不同，說(shuō)明不同蜜環(huán)菌對(duì)環(huán)境因子的適應(yīng)性存在著差異。另一方面，對(duì)于氣候和環(huán)境變化如何影響蜜環(huán)菌以及寄主和它們的共存卻知之甚少，過(guò)去幾年對(duì)病原體方面的研究并沒(méi)有帶來(lái)許多新見(jiàn)解。例如，預(yù)測(cè)氣候變化對(duì)蜜環(huán)菌根腐病發(fā)病率的影響是具有挑戰(zhàn)性的，因?yàn)樯芷诘牟煌A段，包括傳播、感染和繁殖，可能會(huì)直接或間接的受到影響，并且影響可能完全不同。缺乏與蜜環(huán)菌相關(guān)樹(shù)木死亡率的長(zhǎng)期研究及其與人類(lèi)活動(dòng)引起的環(huán)境變化的多重復(fù)雜相互作用，限制了對(duì)不斷變化的環(huán)境中蜜環(huán)菌的進(jìn)化理解。