李紅霞

摘? ? ? 要：酒精發(fā)酵液中乙醇、糖、有機(jī)酸等含量的高低，體現(xiàn)了發(fā)酵水平，因此利用高效液相色譜法進(jìn)行成分分析是關(guān)鍵。在液相色譜儀（HPLC）的定量分析中，因樣品前處理方法、標(biāo)準(zhǔn)品配制、儀器參數(shù)的設(shè)置、色譜圖積分方式等的不同，造成測定存在系統(tǒng)誤差。操作方法統(tǒng)一，把誤差減少到最小，使酒精發(fā)酵液質(zhì)量與發(fā)酵水平提高。

關(guān)? 鍵? 詞：酒精發(fā)酵液;乙醇;糖;系統(tǒng)誤差

中圖分類號(hào)：O652? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A? ? ? 文章編號(hào)： 1671-0460（2019）10-2403-04

Abstract： The content of ethanolP-aminobenzenesulfonic acid-naphthylamine hydrochloride spectrophotometry，sugar and organic acid in alcohol fermentation liquid reflects the level of fermentation and guides the improvement of production technology. Therefore， the correct use of high-performance liquid chromatography is the key to component analysis. In the quantitative analysis of liquid chromatography， there are systematic errors in the determination due to differences in sample pretreatment methods， preparation of standard products， setting of instrument parameters， and chromatographic integration methods. In this paper， the methods of these operation were unified， the error was reduced to the minimum level， and the quality of alcohol fermentation liquid and the level of fermentation were improved.

Key words： Alcohol fermentation liquid; Ethanol; Sugar; System error

高效液相色譜定量分析過程可分為樣品的前處理、標(biāo)準(zhǔn)品的配制、進(jìn)樣、色譜分離、檢測及數(shù)據(jù)處理等七個(gè)步驟[1]。尤其在高效液相色譜定量分析中，實(shí)驗(yàn)結(jié)果的誤差可能主要來源于樣品的前處理及標(biāo)準(zhǔn)品的配制、操作細(xì)節(jié)、積分方式。不同的檢測方法檢測誤差較大，同一種檢測方法，也要細(xì)化細(xì)節(jié)，才能得出較為準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)。

利用HPLC對(duì)酒精發(fā)酵液各組分的分析，現(xiàn)采用的是結(jié)合國標(biāo)優(yōu)化后的檢測方法，而同行業(yè)公司采用的是諾維信公司應(yīng)用的方法。諾維信的酒精發(fā)酵液檢測方法已在全球?qū)?biāo)。為了與同行業(yè)生產(chǎn)情況進(jìn)行對(duì)比、為技術(shù)改進(jìn)、過程控制提供強(qiáng)數(shù)據(jù)支持，現(xiàn)利用諾維信方法進(jìn)行糖譜分析，同時(shí)諾維信公司對(duì)同一樣品進(jìn)行分析對(duì)比，找出檢測誤差，統(tǒng)一公司內(nèi)部檢測方法，把誤差減少到最小范圍。

誤差按其性質(zhì)和產(chǎn)生原因，可分為系統(tǒng)誤差、隨機(jī)誤差和過失誤差。系統(tǒng)誤差又稱可測誤差、恒定誤差或偏倚。指測量值的總體均值與真值之間的差別，是由測量過程中某些恒定因素造成的，在一定條件下具有重現(xiàn)性，并不因增加測量次數(shù)而減少系統(tǒng)誤差，它的產(chǎn)生可以是方法、儀器、試劑、恒定的操作人員和恒定的環(huán)境所造成。我們主要研究的是系統(tǒng)誤差。

1? 實(shí)驗(yàn)部分

1.1? 儀器

1.1.1? 安捷倫液相色譜儀 1200

G1311A 四元泵、G1316A 恒溫箱、G1329A自動(dòng)進(jìn)樣器、G1362A 示差折光檢測器。

1.1.2? 色譜柱

BIO-RAD Aminex HPX-87H （300 mm×7.8 mm）;保護(hù)柱;將BIO-RAD 預(yù)柱Micro-Guard Cation H cartridge（Cat.nr.125-0129）裝入與其匹配的BIO-RAD 標(biāo)準(zhǔn)套筒中? （Cat.no.125-0131），用一根 10 cm×0.15 mm ID 的不銹鋼細(xì)管將其與分析柱相連。

1.1.3? 離心機(jī)

轉(zhuǎn)速可以達(dá)到4 000 r/min。

1.1.4? 其他

分析天平、移液管、直吸管、容量瓶等。

1.2? 分離機(jī)理

高效液相色譜法（HPLC）按分離機(jī)制的不同分為液固吸附色譜法、液液分配色譜法（正相與反相）、離子交換色譜法、離子對(duì)色譜法及分子排阻色譜法。離子分配色譜法是一種利用 HPLC 通過離子交換樹脂來分離極性非離子化合物的方法。其分離機(jī)制不同于離子交換，而由分子排阻和基團(tuán)交換組成。樹脂上的電荷提供了離子排阻的能力，而聚苯乙烯主鏈則提供了疏水相互作用。根據(jù)不同的化合物和選擇性的程度，可選擇運(yùn)用一個(gè)或多個(gè)分離機(jī)制。

在寡聚糖的分離過程中，分子排阻是最主要的分離機(jī)制。尺寸過大的分子無法滲透進(jìn)入離子交換樹脂的孔結(jié)構(gòu)中而首先被洗脫出來。尺寸較小的分子，如單糖、二糖、三糖和一些短鏈的低聚糖，可以進(jìn)入樹脂的內(nèi)孔而逐步洗脫。

1.3? 主要試劑

麥芽三糖：Sigma，? W=504.4， >95%;

麥芽糖：Sigma， MW=360.3， >99%;

葡萄糖：Sigma， MW=180.2， >99.5%;

果糖：Sigma， MW=180.2， <0.05mol% 葡萄糖;

乙醇：Chem Service，? MW=46， 99.5%;

乳酸：Sigma，， MW-90.08， >98%;

乙酸：TEDIA， MW=60.08， >99.7%;

甘油：Chem Service， MW=92， 99%;

硫酸：AR，98%。

1.4? 流動(dòng)相配制

1.8 mol/L H2SO4的配制：取90 mL 蒸餾水于燒杯中，用10 mL 移液管吸取10 mL 濃硫酸，在攪拌的狀態(tài)下緩慢加入到90 mL 水中，使其充分混勻。

0.005 mol/L H2SO4溶液的配制：用0.22μm的過濾器過濾上述溶液約5～20 mL備用。用移液器吸取過濾液11.12 mL，到已預(yù)先放入蒸餾水的2 L容量瓶中，用水定容量瓶刻度線，充分混勻。用超聲波脫氣20 min。

1.5? 混合標(biāo)準(zhǔn)的配制

取一定質(zhì)量的各種標(biāo)品，以蒸餾水溶解并定容到 100 mL，混合均勻，配制成混合標(biāo)準(zhǔn)樣，標(biāo)準(zhǔn)含量過少可用稀釋法，配制多級(jí)標(biāo)準(zhǔn)（表1）。

1.6? 樣品預(yù)處理[2]

將樣品混合均勻，取適量樣品于帶蓋離心管中，室溫下4 000 r/min離心5 min;用5 mL的注射器將上清液通過 0.22μm濾膜，注入到2 mL 的樣品瓶中，蓋緊瓶帽。同樣的方法將標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行過濾。

1.7? 儀器參數(shù)[3，4]

色譜柱：Aminex HPX-87H， 7.8 mm×300 mm;

流動(dòng)相： 0.005 mol/L H2SO4;

溫度： 65 ℃;

流速：0.6 mL/min;

進(jìn)樣量： 15μL;

檢測器： 折光檢測器;

分析時(shí)間： 30 min。

2? 對(duì)標(biāo)分析

第一次對(duì)標(biāo)數(shù)據(jù)及分析見表2-3。

結(jié)果表明：控制值=偏差÷平均值×100%;麥芽糖、甘油、乙醇數(shù)據(jù)符合控制要求。其他仍需要繼續(xù)對(duì)標(biāo)。

3? 結(jié)果分析

3.1? 標(biāo)準(zhǔn)試劑不統(tǒng)一帶來的誤差

作為標(biāo)準(zhǔn)溶液使用的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)其純度要求很高，應(yīng)避免使用純度不符合要求[5]的試劑，不同的試劑廠家的試劑純度不同，直接影響到檢測結(jié)果，標(biāo)準(zhǔn)的準(zhǔn)確是檢測結(jié)果準(zhǔn)確的保證，減少誤差有三種方法：一是購買權(quán)威標(biāo)準(zhǔn)廠家的標(biāo)準(zhǔn)，二是統(tǒng)一試劑廠家、統(tǒng)一貨號(hào)，三是利用諾維信標(biāo)準(zhǔn)對(duì)本公司的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行標(biāo)定。

另外，選擇與樣品濃度要求相適應(yīng)的天平，應(yīng)該盡可能使用高精度的天平，這樣才能把由于天平使用帶來的稱量操作誤差降至最低。

3.2? 標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制不規(guī)范帶來的誤差

標(biāo)準(zhǔn)配制可以3～7個(gè)梯度不等，至少不應(yīng)低于3個(gè)梯度。樣品檢測結(jié)果必須在曲線范圍內(nèi)，可根據(jù)樣品含量不同，調(diào)整標(biāo)準(zhǔn)濃度。

3.3? 酒精發(fā)酵液樣品預(yù)處理帶來的誤差

樣品預(yù)處理同樣重要，不同的預(yù)處理方法可能造成檢測結(jié)果不同。如離心程度不同，造成的雜質(zhì)含量不同，進(jìn)而樣品中物質(zhì)的含量不同，所以待測定溶液不具有可比性。揮發(fā)性的物質(zhì)的要注意保存和轉(zhuǎn)移，如會(huì)造成乙醇含量檢測不準(zhǔn)確。

3.4? 較好的分離度是色譜分離的保障

實(shí)際應(yīng)用中色譜分離度對(duì)分析結(jié)果的影響可概括為三個(gè)主要方面：

（1）一些微量雜質(zhì)和主蜂的分離度太小，雜質(zhì)峰包含在主峰中或只表現(xiàn)為小的肩蜂，積分儀無法，識(shí)別該雜質(zhì)蜂而將其并入主峰[6]。

（2）色譜峰的分離度不好，使得數(shù)據(jù)處理機(jī)無法正確判斷色譜峰的基線，導(dǎo)致積分結(jié)果失真。

（3）重疊峰影響峰面積測定的結(jié)果。

麥芽三糖、果糖檢測誤差較大，誤差主要來源是色譜柱塌陷造成分離度較差、積分誤差大，見表3、圖1-2。

3.5? 增加平行測定的次數(shù)

增加測定次數(shù)可以減少隨機(jī)誤差。在一般分析工作中，測定次數(shù)為2～4次。減少偶然誤差，基本上可以得到比較準(zhǔn)確的分析結(jié)果。

3.6? 積分不一致帶來的誤差

數(shù)據(jù)處理機(jī)參數(shù)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，對(duì)色譜結(jié)果的處理通常借助于數(shù)據(jù)處理機(jī)來完成，數(shù)據(jù)處理機(jī)一般都設(shè)有多種積分方式供使用者選擇。對(duì)沒達(dá)到基線分離的色譜峰，選擇不同的積分方式將得到不同的結(jié)果， 見圖3。

色譜峰自動(dòng)積分相差較大，手動(dòng)積分應(yīng)盡量選擇相同的積分參數(shù)（最小峰寬、峰面積、積分方式），減少人為誤差。因?yàn)檫x用不同數(shù)值，將影響色譜峰起止點(diǎn)的識(shí)別，得到不同的峰面積，進(jìn)而影響到所得定量結(jié)果的準(zhǔn)確程度。一定要保證處理同一系列數(shù)據(jù)（各個(gè)標(biāo)樣數(shù)據(jù)和未知樣品數(shù)據(jù)）時(shí)，這兩個(gè)參數(shù)值是一致的。

3.7? 第二次對(duì)標(biāo)情況

從結(jié)果看出，經(jīng)過誤差分析和統(tǒng)一分析過程，結(jié)果誤差在允許范圍之內(nèi)，見表4。

4? 結(jié) 論

酒精發(fā)酵液中糖譜的液相對(duì)標(biāo)分析，結(jié)果表明，樣品處理方法、色譜柱的分離效果、儀器分析參數(shù)的選擇、標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制、色譜圖的積分處理等是誤差的來源，將這些細(xì)節(jié)問題進(jìn)行明確化，是獲得一致數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)。

通過對(duì)標(biāo)分析，使酒精發(fā)酵液質(zhì)量與發(fā)酵水平可以與行業(yè)、甚至國際生產(chǎn)水平進(jìn)行對(duì)比，為生產(chǎn)技術(shù)改進(jìn)等提供準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)支持。

參考文獻(xiàn)：

[1]范正苑.色譜定性與定量[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2000.

[2]楊艷， 陳旭冰， 陳光勇，劉光明.超高效液相色譜在中藥研究中的應(yīng)用[J].云南中醫(yī)中藥雜志， 2012， 33 （6） ：70-72.

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[4]郭福陽，劉輝，從志會(huì)，王澤興.高效液相色譜法檢測白酒基酒中的乳酸[J].當(dāng)代化工， 2015，44（12）： 2923-2925.

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