梁 玉,趙鵬昊,尚佳萃,劉瑞娜,賀 菁,侯雨佳,孟祥晨

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江哈爾濱 150030)

嬰兒時(shí)期為腸道菌群定植的關(guān)鍵窗口時(shí)期,腸道菌群對(duì)嬰兒早期免疫系統(tǒng)、消化系統(tǒng)的發(fā)育及成年后機(jī)體的生理狀況均有深遠(yuǎn)的影響。腸道菌群的生態(tài)失調(diào)與各種疾病相關(guān),包括肥胖、高血壓、心血管疾病、糖尿病、癌癥、炎癥性腸病、痛風(fēng)、抑郁癥等[1]。

膳食中的非消化糖不會(huì)被消化酶分解,因此非消化糖可通過胃和小腸并最終作為腸道菌群發(fā)酵的底物,生成促進(jìn)機(jī)體健康的代謝產(chǎn)物,并形成腸道特定的微環(huán)境[2]。腸道菌群可合成多種碳水化合物降解酶,因此腸道菌群能較好地利用非消化糖[3]。

腸道菌群依靠非消化糖提供能量來(lái)源,同時(shí),非消化糖的攝入是腸道菌群生態(tài)、多樣性和功能的關(guān)鍵決定因素[4]。Peril等[5]研究低聚半乳糖對(duì)腸道菌群的影響,研究發(fā)現(xiàn)低聚半乳糖可增加糞便菌群中雙歧桿菌屬和乳桿菌屬的相對(duì)豐度。Andenplas等[6]研究添加低聚果糖和低聚半乳糖的嬰幼兒配方奶粉對(duì)嬰幼兒腸道菌群的影響,結(jié)果表明非消化糖的加入均可軟化糞便、降低糞便pH、提高管腔滲透水結(jié)合能力和提高嬰幼兒糞便中短鏈脂肪酸的含量。Oliveira等[7]研究發(fā)現(xiàn),在低脂牛奶中添加菊粉,可促進(jìn)食用者腸道菌群中嗜酸乳桿菌、鼠李糖乳桿菌和雙歧桿菌的生長(zhǎng)。國(guó)內(nèi)外學(xué)者的研究多集中于月齡較大的嬰幼兒及成人對(duì)非消化糖的發(fā)酵作用,而對(duì)于一月齡嬰兒糞便菌群對(duì)非消化糖的發(fā)酵作用的對(duì)比還未見報(bào)道。

本研究的主要目的是解析一月齡嬰兒糞便對(duì)低聚果糖、低聚半乳糖、低聚木糖、菊粉、聚葡萄糖五種非消化糖的發(fā)酵作用,通過體外發(fā)酵方式揭示并對(duì)比各種非消化糖與嬰兒腸道菌群間的互作,對(duì)一月齡嬰兒膳食中非消化糖的選擇提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

低聚果糖(純度≥95%)、低聚半乳糖(純度≥98%)、低聚木糖(純度≥95%)、菊粉(純度≥99%)、聚葡萄糖(純度≥99%) 上海源葉生物科技有限公司;乳酸、乙酸、丙酸及丁酸標(biāo)準(zhǔn)品(色譜純) 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、SuperReal PreMix Plus、質(zhì)粒小提試劑盒 北京天根生化科技有限公司;pMD 19-T simple vector 大連寶生物工程有限公司;其他試劑 均為分析純。

Waters 2695型高效液相色譜儀(配有可變波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器和色譜工作站) 美國(guó)Waters公司;BCN1360型生物潔凈工作臺(tái) 上海佳勝實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司公司;1029型厭氧培養(yǎng)箱 Thermo Fisher Scientific;DK-8D型電熱恒溫水槽 上海一恒科技有限公司;GL-21 M高速冷凍離心機(jī) 上海市離心機(jī)械研究所;HVE-8D型全自動(dòng)高壓滅菌鍋 日本HIRAYAMA;AF100型制冰機(jī) SCOTSMAN公司;DYY-10C型電泳儀 北京市六一儀器廠;微量臺(tái)式離心機(jī) Microfuge20R,美國(guó)Beckman公司;StepOnePlus實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀 美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司;NanoDrop 1000超微量分光光度計(jì) 美國(guó) Nanodrop公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 體外發(fā)酵培養(yǎng)基的配制 根據(jù)Yan等[8]體外發(fā)酵培養(yǎng)方法配制基礎(chǔ)培養(yǎng)基,培養(yǎng)為蛋白胨2.0 g/L、酵母提取物2.0 g/L、NaCl 0.1 g/L、K2HPO40.04 g/L、MgSO40.01 g/L、CaCl20.01 g/L、NaHCO32.0 g/L、血紅素0.02 g/L、半胱胺鹽酸鹽0.5 g/L、膽鹽0.5 g/L、刃天青1.0 mg/L、吐溫80 2.0 mL/L、維生素K 10 μL/L。分別稱取50 mg低聚果糖、低聚半乳糖、低聚木糖、菊粉、聚葡萄糖做培養(yǎng)基中唯一碳源,加入到含4.5 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基的10 mL西林瓶中;空白對(duì)照不加入任何碳源,于121 ℃、高壓滅菌15 min備用。

1.2.2 糞便菌懸液的配制 選擇3位無(wú)胃腸道疾病及抗生素治療史的一月齡健康嬰兒為受試者。收集受試者的新鮮糞便,且于排便后2 h內(nèi)處理糞便樣品,分別將樣品稱重并用無(wú)菌磷酸鹽緩沖液1∶10 (w/v)稀釋[9]。充分振蕩后,經(jīng)4層紗布過濾制成糞便菌懸液[10]。

1.2.3 糞便菌群對(duì)非消化糖的發(fā)酵 接種糞便菌懸液:分別向配制好的體外發(fā)酵培養(yǎng)基中加入0.5 mL糞便菌懸液[11],充分振蕩。接種完成后,厭氧培養(yǎng)并于37 ℃發(fā)酵24 h,得到糞便發(fā)酵液樣品。

1.2.4 糞便發(fā)酵液中部分細(xì)菌的檢測(cè)

1.2.4.1 細(xì)菌DNA的提取 參照天根細(xì)菌DNA提取試劑盒說(shuō)明書提取糞便發(fā)酵液中細(xì)菌總DNA。提取后放置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4.2 部分細(xì)菌的絕對(duì)定量 選擇糞便中的主要細(xì)菌(雙歧桿菌屬、乳酸桿菌屬、擬桿菌屬、腸球菌屬、腸桿菌屬、梭菌屬)的高效特異性引物,并進(jìn)行驗(yàn)證(表1)。對(duì)上述細(xì)菌進(jìn)行絕對(duì)定量qPCR,反應(yīng)體系:樣本DNA模板2 μL;SYBR Green Super Mix 10 μL;上、下游引物各 0.7 μL;50×ROX Reference Dye 1 μL;滅菌蒸餾水5.6 μL;擴(kuò)增條件:95 ℃預(yù)變性15 min,95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s,40個(gè)循環(huán),每個(gè)樣本重復(fù)檢測(cè)3次。將擴(kuò)增的六種目的基因連接于pMD 19-T載體上,然后轉(zhuǎn)化到DH5α宿主中。測(cè)定轉(zhuǎn)化成功的陽(yáng)性質(zhì)粒濃度,根據(jù)分子質(zhì)量計(jì)算拷貝數(shù),并進(jìn)行梯度稀釋,作為絕對(duì)定量qPCR的標(biāo)準(zhǔn)物,制備標(biāo)準(zhǔn)曲線[12]。將1.2.4.1中提取的糞便發(fā)酵液樣品細(xì)菌DNA進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè),操作方法和條件與標(biāo)準(zhǔn)曲線制作時(shí)一致。待測(cè)樣品的Ct值結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線即可計(jì)算出各樣品中六個(gè)目標(biāo)細(xì)菌的含量[13]。

表1 細(xì)菌16S rDNA引物序列Table 1 Primer pairs for bacterial 16S rDNA

1.2.5 乳酸及短鏈脂肪酸含量的測(cè)定 分別取乳酸、乙酸、丙酸和丁酸標(biāo)準(zhǔn)品,加去離子水配制為50 mmol/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,稀釋至合適濃度并混合作為液相色譜的混合標(biāo)準(zhǔn)品。

取2 mL培養(yǎng)完成的糞便發(fā)酵液分別于13000 r/min離心15 min,除去菌體及其他顆粒物[10]。取1.5 mL發(fā)酵上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后,使用液相色譜儀檢測(cè)乳酸及短鏈脂肪酸。

高效液相色譜條件:色譜柱BIO-RAD Aminex HPX-87H柱(300 mm×78 mm,9 μm)。流動(dòng)相為5 mmol/L的H2SO4,流速為0.5 mL/min,柱溫為50 ℃,進(jìn)樣量為10 μL,210 nm紫外檢測(cè)器[11]。

定性與定量:以乳酸、乙酸、丙酸、丁酸標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間和峰面積對(duì)非消化糖發(fā)酵后所含的有機(jī)酸進(jìn)行定性和定量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

上述實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)三次,采用SPSS 24軟件的單因素方差分析(one-way ANOVA)分析方差,采用 Duncan法進(jìn)行多重比較,P<0.05為差異顯著。試驗(yàn)數(shù)據(jù)表示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”。

2 結(jié)果與討論

2.1 主要目標(biāo)細(xì)菌的標(biāo)準(zhǔn)曲線

六種引物經(jīng)qPCR熔解曲線分析,熔解曲線均為單峰(圖略),說(shuō)明擴(kuò)增產(chǎn)物單一,產(chǎn)物均為目的DNA片段。采用實(shí)驗(yàn)方法中所述的qPCR擴(kuò)增條件,建立拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)和定量PCR反應(yīng)過程中達(dá)到熒光閾值的初始循環(huán)數(shù)(Ct)的回歸方程(表2),在測(cè)定范圍內(nèi)各樣品均具有較好的線性關(guān)系,R2均在0.99以上。

表2 菌屬含量的回歸方程及決定系數(shù)Table 2 Regression equation for bacterialcontent and determination coefficient

注:表中x代表標(biāo)準(zhǔn)物拷貝數(shù)的對(duì)數(shù),y代表達(dá)到熒光閾值的初始循環(huán)數(shù)(Ct)。

2.2 五種非消化糖經(jīng)一月齡嬰兒糞便菌群發(fā)酵后發(fā)酵液中主要細(xì)菌的含量

低聚果糖、低聚半乳糖、低聚木糖、聚葡萄糖、菊粉對(duì)一月齡嬰兒糞便菌群中主要細(xì)菌的作用有所差異(表3、圖1)。五種非消化糖均能促進(jìn)嬰兒糞便菌群中乳酸桿菌、雙歧桿菌的生長(zhǎng),其中低聚果糖對(duì)乳桿菌和雙歧桿菌的促進(jìn)作用最強(qiáng)(P<0.05),與不含碳源的空白組中菌屬含量的比值分別為1.07、1.12。表3可知一月齡嬰兒糞便發(fā)酵五種非消化糖后,糞便發(fā)酵液中的雙歧桿菌含量均高于乳桿菌。菊粉可以顯著促進(jìn)擬桿菌的生長(zhǎng)(P<0.05),與空白組中菌屬含量的比值為1.15。五種非消化糖均能抑制梭菌屬的生長(zhǎng)(P<0.05),低聚果糖對(duì)其抑制作用最強(qiáng),與空白組中菌屬含量的比值為0.92。低聚半乳糖可顯著抑制糞便菌群中腸桿菌的增殖,與空白組中菌屬含量的比值為0.98。低聚木糖可顯著減少糞便發(fā)酵液中腸球菌的含量(P<0.05),與空白組中菌屬含量的比值為0.97。

圖1 糞便菌群發(fā)酵五種非消化糖后發(fā)酵液中主要細(xì)菌含量與空白組的比值Fig.1 The ratio of main bacterial content in the fermentedfive non-digested polysaccharides to the blank group

嬰兒腸道菌群的定殖與發(fā)展是連續(xù)的動(dòng)態(tài)變化的過程,腸道菌群的失衡會(huì)提高嬰兒患免疫和代謝疾病的風(fēng)險(xiǎn),嬰兒時(shí)期腸道菌群對(duì)嬰兒及成年后的機(jī)體健康均具有積極的生理意義[18]。

表3 糞便菌群發(fā)酵非消化糖后其中主要細(xì)菌的含量(lg copies/mL)Table 3 The content of bacterial in anaerobic fermentation broth(lg copies/mL)

注:右上角標(biāo)字母a～g表示同列結(jié)果比較的差異顯著性,字母不同代表差異顯著,即P<0.05;表5同。此外,腸道菌群能夠分泌多種酶,參與未消化完全的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的代謝,對(duì)嬰兒的代謝也有著至關(guān)重要的作用[19]。嬰兒腸道菌群可利用非消化糖,并產(chǎn)生乳酸、乙酸、丙酸、丁酸等對(duì)機(jī)體有益的代謝產(chǎn)物,滿足菌體自身及嬰兒的營(yíng)養(yǎng)需要[20]。生成代謝產(chǎn)物的種類與含量主要取決于嬰兒腸道菌群的組成及菌群可利用的底物種類[21]。

雙歧桿菌和乳桿菌是嬰兒腸道中具有益生作用的重要微生物,可在腸道中合成多種維生素和氨基酸,增強(qiáng)Fe2+、維生素D和鈣的吸收,還可以通過產(chǎn)生乙酸來(lái)防止腸道致病菌感染,維持嬰兒腸道健康[22]。本研究各實(shí)驗(yàn)組中的非消化糖均能促進(jìn)雙歧桿菌和乳酸桿菌和生長(zhǎng)。其中,低聚果糖對(duì)雙歧桿菌的促進(jìn)作用最強(qiáng)(P<0.05),低聚果糖對(duì)乳桿菌生長(zhǎng)的促進(jìn)作用最為顯著(P<0.05)。低聚果糖對(duì)乳桿菌的促進(jìn)作用略低于雙歧桿菌。周景欣等[23]的研究表明,低聚果糖可促進(jìn)成人糞便中雙歧桿菌和乳桿菌的生長(zhǎng),對(duì)前者的促進(jìn)作用高于后者,發(fā)酵后雙歧桿菌屬和乳桿菌屬的含量與未加碳源空白組的比值分別為1.20和1.09。與本研究相比,低聚果糖對(duì)成人雙歧桿菌和乳桿菌的促進(jìn)作用強(qiáng)于對(duì)一月齡嬰兒的菌群的作用,這是由于固體食物的引入后,腸道菌群中會(huì)富含更多利用非消化糖的功能的基因編碼,有助于菌體對(duì)非消化糖的利用[19]。

擬桿菌是在腸道中定植的優(yōu)勢(shì)菌群,擬桿菌屬也是腸道中降解碳水化合物的主要微生物,可提高食物中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用率,在促進(jìn)腸道發(fā)育方面具有重要作用[24]。本研究所有實(shí)驗(yàn)組的非消化糖均能促進(jìn)擬桿菌的生長(zhǎng),其中菊粉組最優(yōu)。而Hughes等人[11]采用成人糞便體外發(fā)酵菊粉時(shí)發(fā)現(xiàn),菊粉可顯著抑制糞便中擬桿菌的生長(zhǎng)。此差異可能由于嬰兒與成人源擬桿菌產(chǎn)生的多聚半乳糖醛酸酶和果膠甲酯酶的含量不同[25]。

腸球菌屬和腸桿菌屬是腸道內(nèi)的條件致病菌[26]。本研究發(fā)現(xiàn):僅有低聚半乳糖可減少嬰兒糞便中腸桿菌的含量(P<0.05),而其他非消化糖對(duì)腸桿菌則無(wú)抑制作用。低聚木糖可顯著降低一月齡嬰兒糞便菌群中腸球菌的含量(P<0.05),這與徐海燕等人[27]通過成人糞便體外發(fā)酵低聚木糖的結(jié)果一致,表明低聚木糖也可減少成人糞便菌群中腸球菌的含量。梭菌屬也是嬰兒腸道中數(shù)量較多的一類細(xì)菌,大部分梭菌屬菌株會(huì)對(duì)機(jī)體構(gòu)成一定的威脅,腸道中梭菌屬的含量增多對(duì)機(jī)體有致癌作用[28]。除低聚木糖組外,本研究各實(shí)驗(yàn)組的非消化糖均可減少糞便中梭菌屬的含量(P<0.05),其中,低聚果糖組的梭菌屬含量最低。Hughes等人[11]研究表明,成人糞便發(fā)酵菊粉后,其中梭菌屬的含量下降(P>0.05)?？梢姵扇撕蛬雰杭S便菌群體外發(fā)酵非消化糖時(shí),梭菌屬受到的影響不同,此差異可能由于嬰兒時(shí)期雙歧桿菌屬和乳桿菌屬為優(yōu)勢(shì)菌屬含量較多,對(duì)梭菌屬的增殖起到了競(jìng)爭(zhēng)抑制的作用[29]。

2.3 有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品的回歸方程

采用液相色譜方法分析有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品(乳酸、乙酸、丙酸、丁酸),發(fā)現(xiàn)四種酸可以被色譜柱有效分離(圖2),保留時(shí)間分別為14.5、17.4、20.5和25.3 min。在測(cè)定范圍內(nèi),各標(biāo)準(zhǔn)品均具有較好的線性關(guān)系,R2均在0.999以上(表4)。

表4 有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品的回歸方程及決定系數(shù)Table 4 Regression equations with correlation coefficientsfor organic acid and coefficient of determination

注:表中x代表標(biāo)準(zhǔn)品的摩爾濃度(mmol/L),y代表的是色譜峰面積值。

圖2 四種有機(jī)酸的HPLC分析色譜圖Fig.2 HPLC analysis chromatogram of four organic acids注:峰1:乳酸;峰2:乙酸;峰3:丙酸;峰4:丁酸。

2.4 五種非消化糖經(jīng)一月齡嬰兒糞便菌群發(fā)酵后所產(chǎn)有機(jī)酸分析

五種非消化糖經(jīng)嬰兒糞便菌群發(fā)酵后,發(fā)酵液中乳酸和總短鏈脂肪酸的含量均顯著增多(P<0.05)(表5)。低聚果糖組中乳酸、乙酸及丁酸的含量最高(P<0.05),發(fā)酵液中三種有機(jī)酸含量分別為23.00、11.10、1.47 mmol/L,且嬰兒糞便發(fā)酵低聚果糖生成的乳酸及各種短鏈脂肪酸的總含量最高為40.03 mmol/L;低聚木糖促進(jìn)丙酸生成的能力最強(qiáng)(P<0.05),發(fā)酵液中丙酸含量為5.35 mmol/L。低聚果糖、低聚半乳糖、菊粉組中乳酸及各種短鏈脂肪酸的相對(duì)含量由高到低均依次為:乳酸、乙酸、丙酸、丁酸;低聚木糖組和聚葡萄糖組中相對(duì)含量由高到低均依次為:乙酸、乳酸、丙酸、丁酸。

表5 五種非消化糖經(jīng)嬰兒糞便菌群發(fā)酵后短鏈脂肪酸及乳酸含量(mmol/L)Table 5 Short-chain fatty acids and lactic acid content of five non-digestible polysaccharides fermented by infant fecal(mmol/L)

腸道菌群可通過發(fā)酵未消化的碳水化合物產(chǎn)生乳酸各種短鏈脂肪酸來(lái)維持機(jī)體健康,其中乙酸、丙酸、丁酸,約占SCFAs總量的90%以上[30]。菌群的代謝過程是腸道菌群與宿主間相互作用最重要的體現(xiàn),腸道菌群代謝產(chǎn)物的種類和含量與人類機(jī)體健康與病理狀況之間的直接聯(lián)系[31]。本研究中五種非消化糖經(jīng)一月齡嬰兒糞便菌群發(fā)酵后,發(fā)酵液中乳酸和各種短鏈脂肪酸的含量均顯著增多(P<0.05),其中嬰兒糞便發(fā)酵低聚果糖產(chǎn)生的乳酸及短鏈脂肪酸的總含量最多。說(shuō)明一月齡嬰兒腸道菌群代謝低聚果糖生成對(duì)機(jī)體有益的代謝產(chǎn)物的作用最強(qiáng)(P<0.05),同時(shí)低聚果糖也可顯著促進(jìn)一月齡嬰兒糞便中雙歧桿菌和乳桿菌的生長(zhǎng)(P<0.05),綜合對(duì)比五種非消化糖對(duì)一月齡嬰兒糞便中益生菌群促進(jìn)作用及生成有益代謝產(chǎn)物的能力,低聚果糖是最適于促進(jìn)一月齡嬰兒腸道健康的非消化糖。此外,五種非消化糖經(jīng)一月齡嬰兒糞便發(fā)酵后產(chǎn)生的短鏈脂肪酸的含量由高到低依次為乙酸、丙酸、丁酸。與本研究相似,Jonathan等人[32]通過成人糞便體外發(fā)酵菊粉和低聚果糖,各組發(fā)酵液中的短鏈脂肪酸含量由高到低依次為乙酸、丙酸、丁酸。盡管嬰兒和成人的糞便中優(yōu)勢(shì)菌群有明顯差異,但發(fā)酵非消化糖生成代謝產(chǎn)物的趨勢(shì)明顯的相似,這是由于腸道菌群代謝方面的功能冗余的特性[33]。

3 結(jié)論

低聚果糖可促進(jìn)一月齡嬰兒糞便菌群中雙歧桿菌屬、乳桿菌屬的生長(zhǎng),抑制梭菌屬的增殖,與不含碳源的空白組中菌屬含量的比值分別為1.12、1.07、0.92;低聚半乳糖可抑制糞便菌群中腸桿菌的增殖,與空白組中菌屬含量的比值為0.98;低聚木糖可降低糞便中腸球菌屬的含量,與空白組菌屬含量的比值為0.97。低聚果糖經(jīng)糞便發(fā)酵生成的乳酸、乙酸、丁酸均為最高,含量分別為23.00、11.10、1.47 mmol/L,且生成的有機(jī)酸總含量也為最高,含量為40.03 mmol/L;低聚木糖組發(fā)酵液中丙酸含量最高,含量為5.35 mmol/L。結(jié)果表明,綜合對(duì)比五種非消化糖對(duì)一月齡嬰兒糞便中益生菌群促進(jìn)作用及生成有益代謝產(chǎn)物的能力,低聚果糖是最適于促進(jìn)一月齡嬰兒腸道健康的非消化糖。在試圖通過非消化糖調(diào)節(jié)嬰兒腸道菌群時(shí),應(yīng)注意食物因子的選擇不同于成人。