皮膚惡性黑色素瘤(CMM)屬于皮膚腫瘤的一種,由表皮基底部的黑色素細(xì)胞惡變形成[1],是近年來發(fā)病率增長最快的腫瘤之一,多見于中老年人,且我國黑色素瘤死亡與新發(fā)病例比例明顯高于全球平均水平[2]。CMM早期不容易被發(fā)現(xiàn),一旦病情進(jìn)展到中晚期不僅治療效果不佳,而且容易發(fā)生轉(zhuǎn)移,復(fù)發(fā)率高,預(yù)后差。有研究發(fā)現(xiàn)，基質(zhì)金屬蛋白酶類(MMPs)、內(nèi)源性抑制劑(TIMPs)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、白細(xì)胞介素-23(IL-23)及S100蛋白等血清因子在多種惡性腫瘤中均存在異常表達(dá),與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移等進(jìn)程存在明顯的相關(guān)性[3-6]。本研究通過檢測老年CMM病人MMPs、VEGF及血清因子的表達(dá)水平,探討其在CMM發(fā)生發(fā)展中的意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2016年10月至2017年12月間在我院收治的經(jīng)病理學(xué)確診的老年CMM病人35例為黑色素瘤組,其中男19例,女16例;年齡65～78歲,平均(68.2±9.5)歲;臨床分期按照1992 年美國癌癥聯(lián)合委員會(AJCC)CMM TNM分期標(biāo)準(zhǔn):Ⅰ期5例,Ⅱ期11例,Ⅲ期10例,Ⅳ期9例。將同期普通色素痣病人35例作為對照組,其中男18例,女17例;年齡66～80歲,平均(69.3±9.7)歲。

納入標(biāo)準(zhǔn):(1)經(jīng)手術(shù)或者病理確診為CMM病人及普通色素痣;(2)未進(jìn)行藥物、激光、放射治療的病人;(3)未合并其他惡性腫瘤疾病。排除標(biāo)準(zhǔn):排除自身免疫性疾病及不配合研究的病人。

1.2 樣本采集 收集2組病人的CMM及對照組織做成標(biāo)本,以4%甲醛固定,石蠟包埋,蘇木精-伊紅(HE)染色,均以3～4μm厚度連續(xù)切片。

CMM組進(jìn)行相關(guān)治療前及對照組進(jìn)行黑痣切除前抽取病人清晨空腹靜脈血5 mL。

1.3 檢測方法 應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)、MMP-9、金屬蛋白酶組織抑制劑-2(TIMP-2)、血管內(nèi)皮生長因子-A(VEGF-A)、VEGF-C、血管內(nèi)皮生長因子受體-3(VEGFR-3)在CMM及普通對照組織中的陽性表達(dá)情況;MMP-2、MMP-9及TIMP-2以細(xì)胞膜或胞質(zhì)出現(xiàn)明顯的紅色或橘紅色顆粒視為陽性著色;VEGF-A、VEGF-C及VEGFR-3以胞質(zhì)有棕黃色顆粒狀沉淀物為陽性;采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測病人血中IL-23及S100蛋白水平。本研究所用抗體及ELISA試劑盒均購自北京中杉金橋生物工程有限公司。

2 結(jié)果

2.1 2組MMPs及其抑制劑的陽性表達(dá)率 35例CMM組病人中,MMP-2、MMP-9及TIMP-2陽性率分別為57.14%、65.71%及54.29%,明顯高于對照組病人中的陽性率22.86%、20.00%及8.57%(P<0.05)。隨著分期升高,MMP-2、MMP-9及TIMP-2陽性率有升高趨勢,但由于樣本量較少,4組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 2組MMPs及其抑制劑的陽性表達(dá)情況(n,%)

注:與對照組比較,*P<0.05

2.2 2組VEGF及其受體的陽性表達(dá)率 35例CMM組病人中,VEGF-A、VEGF-C及VEGFR-3陽性率分別為82.86%、85.71%及80.00%,顯著高于對照組病人中的17.14%、8.57%及11.43%(P<0.05)。隨著分期升高,VEGF-A、VEGF-C及VEGFR-3陽性率均有升高趨勢,但由于樣本量較少,4組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

2.3 2組血清因子的表達(dá)水平比較 CMM組病人血清中IL-23及S100蛋白水平顯著高于對照組病人,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期及Ⅳ期CMM組病人IL-23及S100蛋白水平均明顯高于對照組病人(P<0.05),且隨著分期升高,IL-23及S100蛋白水平均呈現(xiàn)升高趨勢(P<0.05)。見表3。

表2 2組VEGF及其受體的陽性表達(dá)情況(n,%)

注:與對照組比較,*P<0.05

表3 2組血清因子的表達(dá)水平比較

注:與對照組比較,*P<0.05;與Ⅰ期比較,△P<0.05;與Ⅱ期比較,▲P<0.05;與Ⅲ期比較,#P<0.05

3 討論

CMM來源于神經(jīng)嵴黑色素細(xì)胞,早期臨床表現(xiàn)主要為色素斑點(diǎn)或痣發(fā)生惡性變化,如短時(shí)間內(nèi)增大、破潰、顏色改變等,由于其與黑色素痣外形類似,病人多不引起重視,易錯(cuò)過最佳治療時(shí)機(jī)[7]。且隨著年齡的增長,老年人皮膚免疫能力逐漸下降,皮膚逐漸呈現(xiàn)老化[8-9],常因病人無特殊不適而造成病人CMM頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,后果嚴(yán)重[10]。

細(xì)胞外基質(zhì)處于不斷代謝更新和降解重塑的動(dòng)態(tài)平衡之中,腫瘤細(xì)胞通過表面受體與細(xì)胞外基質(zhì)成分黏附,使貼近腫瘤表面的有限區(qū)域的基質(zhì)降解,導(dǎo)致這種動(dòng)態(tài)平衡失調(diào)[11]。細(xì)胞外基質(zhì)的動(dòng)態(tài)平衡失調(diào)與腫瘤的浸潤、轉(zhuǎn)移有密切聯(lián)系[12]。MMPs和TIMPs是細(xì)胞外基質(zhì)合成與降解的代謝平衡調(diào)節(jié)中的兩個(gè)重要的酶系統(tǒng)。MMPs是一組鋅離子依賴性內(nèi)肽酶,幾乎能降解細(xì)胞外基質(zhì)的所有成分。TIMPs是MMPs的特異性抑制劑,在體內(nèi)分布廣泛,在腫瘤細(xì)胞生長、擴(kuò)散中主要起調(diào)節(jié)MMPs水解活性的作用。李佳青等[13]研究認(rèn)為MMPs家族中的蛋白通過高表達(dá)在腫瘤轉(zhuǎn)移中起到促進(jìn)作用,促進(jìn)CMM病程的發(fā)展。本研究中發(fā)現(xiàn),CMM組MMP-2、MMP-9及TIMP-2的陽性表達(dá)率較對照組明顯升高,且隨著分期升高,MMP-2、MMP-9及TIMP-2陽性率均有升高趨勢,提示MMPs及其抑制劑表達(dá)狀況與人CMM局部侵襲和轉(zhuǎn)移關(guān)系密切,在CMM發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用。

VEGF是促血管新生的重要因子,正常組織中的少量VEGF能夠維持血管內(nèi)皮細(xì)胞正常的新老更替,而腫瘤細(xì)胞能大量分泌VEGF,促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖,從而促進(jìn)腫瘤血管的新生,現(xiàn)已被證實(shí)在肺癌、肝癌、乳腺癌等眾多實(shí)體瘤中存在高表達(dá)[14-15]。本研究中發(fā)現(xiàn),CMM組VEGF-A、VEGF-C及其受體VEGFR-3的陽性表達(dá)率較對照組明顯升高,且隨著分期升高,VEGF-A、VEGF-C及VEGFR-3陽性率均有升高趨勢,提示其過度表達(dá)與CMM的轉(zhuǎn)移和預(yù)后有關(guān),但仍需進(jìn)一步的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)闡明其作用機(jī)制。

IL-23是白細(xì)胞介素家族成員之一,是由IL-12 P40和P35通過二硫鍵形成的異二聚體,是一種促炎性細(xì)胞因子,通過刺激T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子發(fā)揮抗腫瘤作用,與腫瘤、細(xì)菌或病毒感染、自身免疫病、再生障礙性貧血等的發(fā)病關(guān)系密切[5,16]。S100蛋白為酸性鈣結(jié)合蛋白,來源于如神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、黑色素細(xì)胞、乳腺上皮、雪旺細(xì)胞或肌上皮細(xì)胞等,或起源于這些細(xì)胞的腫瘤。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),CMM組血清IL-23及S100蛋白水平較對照組明顯升高,Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期及Ⅳ期CMM組病人IL-23及S100蛋白水平均明顯高于對照組病人,且隨著分期升高,IL-23及S100蛋白水平均呈現(xiàn)升高趨勢(P<0.05),提示CMM病人存在IL-23及S100蛋白的高表達(dá),兩者可能與其發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

綜上認(rèn)為,MMPs及其抑制劑、VEGF及受體及相關(guān)血清因子在老年CMM病人中高表達(dá),可能與CMM發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、侵襲等過程有關(guān)。但本研究由于樣本量不足,導(dǎo)致不同分期組間MMPs、VEGF的陽性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。下一步將擴(kuò)大樣本量,驗(yàn)證它們的變化趨勢。