顧建忠 李海 黃凌凌 陳建海 黎飚 楊潔 方曉燕

(右江民族醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，廣西 百色 533000)

Ⅰ型骨質(zhì)疏松臨床上也叫絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松(PMOP)，絕經(jīng)后卵巢萎縮退化，女性激素分泌銳減，護(hù)骨素血液隨之下降，成骨細(xì)胞成骨功能得不到保護(hù)，反而破骨細(xì)胞功能亢進(jìn)，引起溶骨大于成骨，導(dǎo)致總骨質(zhì)量較少，骨質(zhì)松散變脆，輕則腰酸背痛腿抽筋，重者骨折。臨床雌激素(E2)對PMOP防治效果較好，但令人擔(dān)憂是日益顯現(xiàn)的毒副作用〔1，2〕。本研究主要探討山茶籽對去卵巢大鼠血清護(hù)骨素和股骨組織的影響。

1 材料和方法

1.1材料 96只5月齡雌性SD大白鼠(300～350 g；SPF級(jí))，榨油后的廣西百色市凌云山區(qū)的山茶籽剩余物：茶麩，茶麩經(jīng)過石油醚進(jìn)行3次重復(fù)脫脂，用濃度為95%的乙醇3次回流得到提取沉積物，并將提取物合并，并進(jìn)行低溫濃縮至8.6 g/g生藥的濃度，濃縮乙醇提取物經(jīng)過無菌處理后置于冰箱2～5℃密封狀態(tài)下保存?zhèn)溆?。給實(shí)驗(yàn)大鼠用藥再臨時(shí)加無菌生理鹽水配成5 g/g生藥濃度的大鼠灌胃液。苯甲酸注射E2針劑 (每支100 μg，浙江省仙居制藥有限公司，批號(hào)：20162086)。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物大鼠分組 在去卵巢和假手術(shù)之前把96只實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)行隨機(jī)分成4組，假去卵巢(Sham)組、去卵巢動(dòng)物模型(OVX)組、去卵巢+苯甲酸注射E2(E2)組、去卵巢+山茶籽醇提物稀釋液(Ts)組，每組24只，分籠常規(guī)飼養(yǎng)，用標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格飼料，飲水機(jī)自由給水。用藥后各組大鼠通風(fēng)、照明、濕度、溫度和飼料各個(gè)飼養(yǎng)條件均相同。

1.3去卵巢動(dòng)物模型建立 取OVX組、E2組、Ts組大鼠，配濃度為10 g/L戊巴比妥鈉麻醉液，按3.0 mg/kg劑量，局部消毒后腹腔注射，待大鼠進(jìn)入麻醉狀態(tài)消毒條件下在背部雙切開進(jìn)入腹腔，切去兩側(cè)卵巢，切口由內(nèi)向外依次分層縫合。切除所得卵巢的組織學(xué)塊，經(jīng)固定切片染色進(jìn)行組織學(xué)鑒定確認(rèn)。術(shù)后用注射卡那霉素液涂擦手術(shù)切口，連續(xù)3 d，避免手術(shù)切口化膿感染。術(shù)后1 w開始實(shí)驗(yàn)用藥。Sham組操作方法和步驟同上，但不切去卵巢，只摘除貼附在卵巢的一近似卵巢大小塊的脂肪塊。術(shù)后用注射卡那霉素液涂擦手術(shù)切口，連續(xù)3 d，避免手術(shù)切口化膿感染。

1.4給藥方法 (1)Ts組：將8.6 g/g的山茶籽醇提物加無菌生理鹽水配成5 g/g生藥濃度的大鼠灌胃液，按10 ml/(kg·d)劑量進(jìn)行灌胃。(2)E2組，E2 200 μg/kg，左右兩側(cè)大腿交替皮下注射，注射口按壓2 min，2次/w。(3)Sham組及OVX組，無菌生理鹽水灌胃，按10 ml/(kg·d)劑量進(jìn)行灌胃。

1.5檢測指標(biāo)及方法 各實(shí)驗(yàn)動(dòng)物組從第4周起，每隔4 w處死一批大鼠。即第4、8、12和16周每組取6只實(shí)驗(yàn)大鼠，經(jīng)腹腔注射濃度為10 g/L戊巴比妥鈉溶液，按3.0 mg/kg劑量，進(jìn)行腹腔適度麻醉，經(jīng)左心室取血完畢后再，常規(guī)處死。(1)各組大鼠右側(cè)股骨骨組織結(jié)構(gòu)：分離右側(cè)股骨，取股骨頭1 cm，按常規(guī)骨組織制片過程：10%甲醛固定24 h、經(jīng)酸溶液快速脫鈣、梯度酒精脫水、熱熔石蠟進(jìn)行包埋，石蠟組織塊冷卻后進(jìn)行切片，最后進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色。放大200倍觀察各組光鏡骨組織結(jié)構(gòu)；(2)各組大鼠左側(cè)股骨骨鈣：左側(cè)股骨頭剝離干凈周圍軟組織，并取近端1 cm。取左側(cè)的股骨頭集中放置瓷性烤盤，并置恒溫烤箱內(nèi)，經(jīng)105℃恒溫烤48 h直到恒重。北京愛尚陽光科技有限公司的十萬分之一實(shí)驗(yàn)室分析天平稱其質(zhì)量，將干骨置于坩堝進(jìn)行炭化到無煙為止，把溫度降到600℃，保持恒溫1 h，加入20%的鹽酸(HCl)輕輕攪拌至完成溶解，再加入去離子水到需要容量刻度，用上海美譜達(dá)儀器有限公司的WFX-IE2型原子吸收分光光度計(jì)進(jìn)行股骨頭骨鈣測定。(3)用骨鈣相同方法使股骨頭烘干脫水至恒重，稱其烘干股骨質(zhì)量后，放入容量為10 ml的容器瓶中，注入20%的HCl于容器瓶中并封其口，把容器瓶放在恒溫烤箱中，110℃恒溫24 h，使股骨全部溶解。最后取出股骨容器瓶注入去離子水至相應(yīng)容量刻度，用上海晶抗生物工程有限公司生產(chǎn)的磷試劑盒，上海光學(xué)儀器廠726型可見分光光度計(jì)測定股骨頭骨磷的含量。(4)各組大鼠血清護(hù)骨素：大鼠麻醉后切開胸腔用采血器穿刺左心室吸取心血5 ml，經(jīng)過離心器以4 000 r/min進(jìn)行10 min離心分離，沉淀獲取血清，置于低溫(-20℃)冰箱保存。用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)按試劑盒操作說明測定血清護(hù)骨素。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SSPS18.0軟件行方差分析。

2 結(jié) 果

2.1各組骨組織形態(tài)結(jié)構(gòu) Sham組骨組織骨質(zhì)致密，骨皮質(zhì)較厚，骨細(xì)胞規(guī)則密集，小梁粗且均勻，骨小梁排列有序，有明顯橫向連接。OVX組骨質(zhì)薄，骨細(xì)胞稀少，骨小梁疏而細(xì)小、骨小梁斷裂、紊亂，骨小梁之間腔隙較大，骨質(zhì)明顯疏松；E2組和Ts組與OVX組比較，骨皮質(zhì)厚度和骨質(zhì)密度明顯增加，疏松骨質(zhì)病理改善顯著，骨質(zhì)內(nèi)部小梁較OVX組明顯增密、增粗，骨質(zhì)之間腔隙變小而少。E2組和Ts組骨組織切片放大200倍光鏡下的結(jié)構(gòu)形態(tài)相似。見圖1。

2.2各組骨鈣測量結(jié)果 OVX組在第4、8、12、16周采樣骨鈣顯著低于同時(shí)期其他3組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；Ts組第4、8、12、16周骨鈣與同時(shí)期Sham組和E2組比較無顯著差異(P>0.05)。見表1。

2.3各組骨磷測量結(jié)果 OVX動(dòng)物組在第4、8、12、16周骨磷明顯低于同時(shí)期其他3組(P<0.01)；Ts組第4、8、12、16周的骨磷與同時(shí)期Sham組和E2組比較無顯著差異(P>0.05)，見表1。

2.4各組血清護(hù)骨素檢測結(jié)果 OVX組在第4、8、12、16周血清護(hù)骨素顯著低于同時(shí)期其他3組(P<0.01)；Ts組第4、8、12、16周血清護(hù)骨素與同時(shí)期Sham組和E2組比較無顯著差異(P>0.05)。見表2。

組別骨鈣第4周第8周第12周第16周Sham組170.35±10.471)168.69±16.231)170.12±12.201)171.60±11.301)OVX組148.26±12.22147.53±8.60146.59±10.16147.68±11.51E2組166.50±12.091)169.16±16.201)169.28±12.231)172.18±13.121)Ts組 162.40±13.431)164.59±15.361)166.26±13.651)168.29±13.281)組別骨磷第4周第8周第12周第16周Sham組101.20±10.31)99.89±12.181)97.58±10.141)98.98±13.101)OVX組80.33±10.3279.89±10.1580.40±9.7278.12±10.12E2組102.33±12.301)99.32±13.081)98.38±11.281)98.10±10.121)Ts組 97.20±10.061)96.22±11.211)95.12±13.051)96.82±12.321)

與OVX組比較：1)P<0.05；表2同

表2 各組血清護(hù)骨素檢測結(jié)果

3 討 論

骨質(zhì)內(nèi)鈣化骨小梁多少用骨量表示，鈣化的骨基質(zhì)把骨細(xì)胞之間各種纖維包含在其中，形成堅(jiān)硬骨基質(zhì)，當(dāng)成骨細(xì)胞功能優(yōu)于破骨細(xì)胞功能時(shí)，骨小梁粗而密，骨質(zhì)結(jié)實(shí)而堅(jiān)硬；當(dāng)成骨細(xì)胞功能劣于破骨細(xì)胞功能時(shí)，骨小梁小而疏，骨質(zhì)變脆易斷，也稱為骨質(zhì)流失，導(dǎo)致骨質(zhì)疏松。當(dāng)卵巢功能正常時(shí)，足量女性雌激素水平維持成骨細(xì)胞正常功能〔3〕，而拮抗破骨細(xì)胞，成骨細(xì)胞功能大于破骨細(xì)胞功能，骨質(zhì)生成與流失平衡，骨質(zhì)保持正?！?～7〕。絕經(jīng)期女性，卵巢退化，卵巢功能下降，低量女性雌激素水平不維持成骨細(xì)胞功能，而拮抗不了破骨細(xì)胞，成骨細(xì)胞功能劣于破骨細(xì)胞功能，骨質(zhì)生成量小于流失量，骨量自然減少，骨質(zhì)出現(xiàn)疏松〔8，9〕。雌性SD大鼠去卵巢很好模擬絕經(jīng)女性卵巢功能退化導(dǎo)致雌激素水平下降所致骨質(zhì)疏松，所以出現(xiàn)OVX組的骨鈣、磷和血清護(hù)骨素明顯低于其他3組。股骨頭部骨質(zhì)切片有顯著骨小梁變小，變疏松的病理改變〔10，11〕。本研究結(jié)果表明雌激素可以提高成骨細(xì)胞功能的成骨功能，拮抗雌激素減少引起骨質(zhì)疏松，提高血鈣、磷和護(hù)骨素。也可能是雌激素通過增加護(hù)骨素，再通過護(hù)骨素提高成骨細(xì)胞的成骨功能，增加骨質(zhì)生成，最終提高骨密度〔12，13〕。

本研究結(jié)果說明山茶籽醇提物有雌激素樣作用，屬于植物性雌激素。山茶籽醇提物可以提高護(hù)骨素，增加骨量，拮抗雌激素減少導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松〔14，15〕。如果進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明山茶籽醇提物能防治PMOP，將為臨床防治PMOP提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。如果臨床推廣山茶籽醇提物防治PMOP，可以大大減輕雌激素防治PMOP毒副作用，不僅提高患者生活質(zhì)量，減輕社會(huì)和家庭負(fù)擔(dān)，也可以使廣大山區(qū)的山茶籽榨油后的茶麩充分利用，大大提高其經(jīng)濟(jì)效益。