1. 航天神舟生物科技集團有限公司，北京 100190 2. 北京市空間生物工程技術(shù)研究中心，北京 100190 3. 中國航天科技集團有限公司 空間生物工程研究中心，北京 100190

微生物污染是進行長期載人航天活動面臨的一個嚴重問題，已經(jīng)有多起航天器的微生物污染事件發(fā)生。和平號空間站在運行期間曾發(fā)生多次由微生物導致的設備故障。舷窗曾因霉菌的生長造成能見度降低，光學性能下降，氧氣電解裝置因真菌的繁殖而出現(xiàn)堵塞，溫控系統(tǒng)管道被真菌繁殖形成的膠狀物質(zhì)堵塞引發(fā)故障[1-2]。在國際空間站的運行期間，也曾多次報道發(fā)生微生物污染事件。俄羅斯艙的一個煙感器曾因真菌對電子部件的降解引發(fā)故障，在美國發(fā)生滲漏的搭載儲水設備(Payload Water Reservoir (PWR))上發(fā)生真菌污染[3-4]。另外一項在空間站上俄羅斯艙段進行的關于空間站材料微損傷早期癥狀調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，在30處發(fā)生材料微損傷的地點中，有一半以上是由微生物污染引起[5]。因此，為保障航天器系統(tǒng)的長期運行安全，微生物防護與控制是航天器系統(tǒng)工程中的一項重要工作。

航天器的微生物防護與控制必須從控制微生物的來源，杜絕適宜微生物生長的環(huán)境，清除滋生的微生物，監(jiān)測微生物生長情況，研究微生物的演變與應對措施等幾個方面形成閉環(huán)控制[6]。在微生物來源方面，現(xiàn)有的研究結(jié)果顯示航天器總裝廠房是航天器攜帶微生物的重要環(huán)境來源之一。盡管廠房有嚴格的清潔要求且環(huán)境(干燥、缺乏營養(yǎng)物質(zhì)等)極度不利于微生物的生長繁殖，但由于往來人員貨物較多，仍有大量的微生物在飛船組裝廠房中被發(fā)現(xiàn)[7-8];且地面廠房中的微生物種類及數(shù)量要遠多于飛行器[9]，因此對廠房中微生物的監(jiān)測和微生物生理生化特性研究,可以有效了解航天器的潛在微生物污染情況，并為微生物防護控制提供指導。歐美等國制定了一系列的標準方法和程序，用于航天器裝配環(huán)境和硬件設備的微生物監(jiān)測、控制和防護[2]。對于航天器潔凈間內(nèi)的微生物，NASA和ESA等主要利用培養(yǎng)法、ATP法、分子法等方法進行總量和多樣性等方面的研究，建立微生物數(shù)據(jù)庫[7-8]。同時對分離出的微生物進行生理特性方面的研究，主要包括微生物對干燥、氧化劑、紫外輻射、溫度、鹽濃度、pH值等方面的耐受性研究，為航天器裝配環(huán)境和硬件設備的微生物防護控制提供科學參考[10]。目前針對我國航天器AIT(總裝、集成和測試)廠房微生物的研究已有報道。文獻[11]基于培養(yǎng)法對我國AIT中心空氣微生物進行了分析，文獻[12]利用高通量測序技術(shù)分析對我國某航天器AIT中心空氣微生物組成與多樣性進行了研究。目前這些研究僅對AIT廠房微生物群落特征進行了研究，但對各微生物的生理生化特征研究還未見報道。

本研究通過對中國3個地區(qū)的航天器AIT廠房多次進行空氣微生物采集，利用傳統(tǒng)培養(yǎng)法獲得53株霉菌菌株。通過ITS(internal transcribed spacer)測序法將所有真菌鑒定到屬水平，進一步結(jié)合β-tubulin基因片段測序?qū)⒋蟛糠謽悠疯b定到種水平。通過對霉菌菌株的菌落徑向生長速率和消毒劑敏感性測試，對AIT廠房空氣霉菌生理生化特征有了更深入的了解，為日后菌種庫的構(gòu)建和廠房與航天器的微生物防護控制提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 AIT廠房空氣采樣

在中國3個地區(qū)的航天器AIT廠房進行空氣采樣。使用SAS空氣微生物采樣器(VWR-PBI)采集空氣樣品1 000 L(流速180 L/min)。采樣器中裝有沙氏培養(yǎng)基(SDA，蛋白胨10 g/L、葡萄糖40 g/L、瓊脂20 g/L)用于收集空氣中的真菌。

1.2 菌株純化培養(yǎng)與形態(tài)觀察

SDA平板進行30℃、72 h培養(yǎng)后，將平板上的真菌分別挑取到新的SDA培養(yǎng)基上劃線涂板，直到得到單菌落。將純化得到的單菌落重新劃線涂板培養(yǎng)(30℃、72 h)后，置于4℃保存?zhèn)溆?。將純化培養(yǎng)得到的單菌落接種到馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA，馬鈴薯浸粉3.0 g/L、葡萄糖20 g/L、瓊脂14 g/L)平板上，30℃培養(yǎng)4天后觀察菌落形態(tài)，主要記錄菌落顏色、邊緣形態(tài)、底部顏色、孢子數(shù)量等。

1.3 霉菌種屬鑒定

PDA平板上刮取少量霉菌菌絲體和孢子，采用MP公司FastDNATM SPIN Kit for Soil試劑盒提取各霉菌樣品的基因組DNA。利用引物ITS1/ITS4 PCR擴增各霉菌樣品DNA的ITS區(qū)，測序后與GenBank序列比對進行霉菌屬水平鑒定。利用引物btub1/btub2 PCR擴增曲霉屬benA基因片段[13]，引物Bt2a/Bt2b PCR擴增青霉屬、枝孢霉屬、踝節(jié)霉屬和輪枝霉屬β-tubulin基因片段，測序后與GenBank序列比對進行種水平鑒定[14]。PCR擴增體系為25 μl，擴增條件為：94℃，2 min；94℃，30 s；58℃，30 s；72℃，30 s；30個循環(huán)；72℃，5 min。PCR擴增引物序列如表1所示。

表1 PCR基因擴增引物序列

1.4 菌落徑向生長測試

各霉菌樣品接種到PDA平板上，30℃培養(yǎng)7天后收集孢子，制備孢子懸液，調(diào)整孢子液濃度至106/ml，取10 μl接種到PDA平板中心位置，30℃培養(yǎng)，第3天開始測量菌落直徑，直至第7天。每個樣品3個平行。

1.5 消毒劑敏感性測試

使用聚六亞甲基雙胍(polyhexamethylene biguanide簡稱PHMB，胍類消毒劑)和4250Z(復合季銨鹽類消毒劑，包含25%烷基二甲基氯化銨C14 60%，C16 30%，C12 5%，C18 5%，25%烷基二甲基芐基氯化銨C12 68%，C14 32%)兩種消毒劑對鑒定后得到的53株霉菌進行消毒劑最低抑菌濃度(MIC)測試。實驗方法基于CLSI(Clinical and Laboratory Standards Institute)的孔板稀釋法[15]。培養(yǎng)基使用馬鈴薯葡萄糖肉湯培養(yǎng)基(PDB，馬鈴薯浸粉5.0 g/L、葡萄糖15 g/L、蛋白胨10 g/L，氯化鈉5 g/L)，霉菌孢子液濃度為106/ml。PHMB濃度(ppm)梯度設為2.5、5、10、20、40、80、160、320、640、1 280；4 250Z濃度(ppm)梯度為2.5、5、10、20、40、80、160、320。陽性對照孔不含消毒劑，陰性對照孔為培養(yǎng)基PDB。進行3次重復實驗。

2 結(jié)果

2.1 霉菌分離與鑒定

三個航天器AIT廠房空氣霉菌的形態(tài)特征、種屬鑒定結(jié)果及對人體或材料潛在危害如表2所示。分離鑒定得到53株霉菌，其中青霉屬(Penicillium sp)13株、曲霉屬(Aspergillus sp)23株、枝孢霉屬(Cladosporium sp)7株、踝節(jié)菌屬(Talaromyces sp)6株、派侖霉屬(Peyronellaea sp)1株、輪枝霉屬(Lecanicillium sp)1株、鏈格孢屬(Alternaria sp)1株和共頭霉屬(Syncephalastrum sp)1株。通過擴增ITS和β-tubulin基因片段測序相結(jié)合進行的種水平鑒定結(jié)果發(fā)現(xiàn)青霉屬和曲霉屬內(nèi)的全部菌株可以鑒定到種水平，青霉屬內(nèi)包括草酸青霉、產(chǎn)紅青霉、橘青霉等7個種，曲霉屬內(nèi)包括土曲霉、煙曲霉、構(gòu)巢曲霉等11個種。但枝孢霉屬和踝節(jié)菌屬的部分菌株未能鑒定到種水平。

表2 形態(tài)特征和種屬鑒定結(jié)果

續(xù)表2

注：N表示未鑒定到種

2.2 菌落徑向生長測定

53株霉菌菌落徑向生長曲線如圖1所示。結(jié)果顯示：

1)曲霉屬內(nèi)菌株徑向生長直徑范圍較寬，第7天直徑范圍為22～84 mm(圖1b)。其中煙曲霉、黑曲霉、黃曲霉、塔賓曲霉、溜曲霉徑向生長直徑較大，第7天直徑范圍為81～85 mm；構(gòu)巢曲霉、土曲霉、赤曲霉徑向生長直徑一般，第7天直徑范圍為54～75 mm；雜色曲霉、聚多曲霉、田納西曲霉徑向生長直徑較小，第7天直徑范圍為22～41 mm。

2)青霉屬內(nèi)菌株徑向生長直徑范圍亦較寬，第7天直徑范圍為23～75 mm(圖1a)。其中草酸青霉、繩狀青霉、意大利青霉徑向生長直徑一般，第7天直徑范圍為45～75 mm；而產(chǎn)黃青霉、產(chǎn)紅青霉和癭青霉徑向生長直徑較小，第7天直徑范圍為23～37 mm。

3)枝孢霉屬和踝節(jié)菌屬內(nèi)菌株徑向生長直徑均比較小，第7天直徑范圍為16～33 mm(圖1c、d)。

4)另有4個屬只有單株菌，其中輪枝霉屬菌株徑向生長直徑較小，第7天直徑為36 mm(圖1d)；派倫霉屬菌株和鏈格孢屬菌株徑向生長直徑一般，第7天直徑約為70 mm；共頭屬菌株徑向生長直徑最大，第7天直徑大于90 mm(圖1d)。

圖1 菌落徑向生長測定結(jié)果Fig.1 Radial growth measurement results

2.3 消毒劑敏感性

53株霉菌對PHMB和4250Z兩種消毒劑的MIC結(jié)果如表3所示。結(jié)果顯示大部分霉菌對復合季銨鹽類消毒劑4250Z均敏感，所有霉菌MIC4250均不超過80 ppm，說明較低濃度的4250Z即可很好的抑制霉菌生長。

而不同霉菌對雙胍類消毒劑PHMB敏感差異非常大：1)輪枝霉屬菌對PHMB極不敏感，MICPHMB已經(jīng)大于1280 ppm。2)曲霉屬中的煙曲霉、溜曲霉、黃曲霉對PHMB不敏感，MICPHMB大于320 ppm；雜色曲霉、黑曲霉、構(gòu)巢曲霉、赤曲霉、田納西曲霉、聚多曲霉對PHMB敏感，MICPHMB小于20 ppm。3)青霉屬中的橘青霉對PHMB不敏感，MICPHMB為640 ppm，而其他青霉則較為敏感，MICPHMB小于80 ppm，繩狀青霉和癭青霉最為敏感，MICPHMB僅為5 ppm。4)枝孢霉屬內(nèi)絕大部菌株對PHMB均敏感，MIC值小于10 ppm，只有一株對PHMB的MIC值為160 ppm。5)共頭霉屬菌株、鏈格孢屬菌株、派倫霉屬菌株和踝節(jié)菌屬內(nèi)各菌株均對PHMB較為敏感，MICPHMB小于80 ppm。

表3 消毒劑最低抑菌濃度

續(xù)表3

注：N表示未鑒定到種

3 分析

航天器AIT廠房內(nèi)微生物種屬鑒定是載人航天工程中微生物防控的重要環(huán)節(jié)，對評估微生物對航天器材料和宇航員潛在風險具有重要意義，同時為航天器清潔和滅菌方法的研究和應用提供指導。歐美等主要利用培養(yǎng)法或分子法對航天器潔凈廠房內(nèi)微生物多樣性和豐度進行監(jiān)測[16-17]。基于培養(yǎng)法的微生物檢測技術(shù)簡單實用、穩(wěn)定可靠，是可以確定微生物存活和能否繁殖擴增的檢測方法，因此是航天器廠房內(nèi)微生物檢測的必要方法[16]。培養(yǎng)法的微生物檢測技術(shù)首先分離純化菌株，進一步利用DNA測序技術(shù)進行種屬鑒定。目前在真菌種屬鑒定方面主要利用ITS測序法。真菌ITS區(qū)是位于核糖體DNA(rDNA)上18S 和28S 基因之間的區(qū)域片段，主要包括內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1(ITS1)、5.8S rDNA、內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2(ITS2)，長度一般在650～750 bp之間[18]。通過PCR擴增真菌ITS區(qū)再與數(shù)據(jù)庫進行比對的方法已經(jīng)可以將真菌鑒定到屬的水平，少數(shù)真菌可以鑒定到種的水平。

本研究中分離純化的53株霉菌利用ITS測序法全部可以鑒定到屬的水平。在真菌種水平鑒定方面，對于曲霉屬和青霉屬的研究報道較多，而其他屬的報道較少。Janet F. Staab等利用PCR-RFLP檢測發(fā)現(xiàn)曲霉屬β-tubulin基因(benA)內(nèi)含子區(qū)種內(nèi)差異相對保守，而具有較高的種間差異，因此benA基因(btub1/btub2)可以用于曲霉屬鑒定[13]。朱敏等利用ITS序列分析和β-tubulin基因序列分析法鑒定曲霉屬菌株發(fā)現(xiàn)β-tubulin基因序列分析曲霉的分辨率較ITS高，可以將曲霉準確鑒定到種，ITS序列可以分析到曲霉復合種[19]。N. Louise Glass 等針對histone3、histone4 、β-tubulin和ATPase設計了五對引物用于絲狀子囊菌(Filamentous Asconmycetes)鑒定[13]，Kazuo Satoh等利用其中的Bt2a/Bt2b引物擴增β-tubulin基因用于青霉屬種水平鑒定[20]。本研究通過擴增ITS和β-tubulin基因片段測序相結(jié)合進行的種水平鑒定結(jié)果顯示23株曲霉屬菌株和13株青霉屬菌株全部可以鑒定到種水平。本研究還嘗試了β-tubulin基因在枝孢霉屬、踝節(jié)霉屬和輪枝霉屬菌株種水平的鑒定，結(jié)果顯示7株枝孢霉屬菌中有5株可以鑒定到種水平，6株踝節(jié)菌屬菌株只有1株鑒定到種水平，由此可見β-tubulin基因片段在這些真菌屬內(nèi)菌株種水平的鑒定并不太合適，需要進一步的研究。

利用傳統(tǒng)培養(yǎng)法得到純化菌株53株，通過ITS和β-tubulin基因片段測序鑒定發(fā)現(xiàn)分屬8個屬，其中青霉屬和曲霉屬菌株居多，而青霉屬和曲霉屬菌株多對材料有腐蝕作用[21-22]。如黑曲霉可以在聚合材料、金屬材料、泡沫等許多材料上大量生長，土曲霉可以侵蝕帆布、紙板、塑料等，黃曲霉對皮革、織物造成影響，繩狀青霉可以侵蝕許多材料尤其是紡織品，雜色曲霉、橘青霉和產(chǎn)黃青霉可以影響光學儀器等等。而航天器應用的材料復雜多樣，有很多容易被霉菌腐蝕，因此這些霉菌會威脅到航天器系統(tǒng)的長期運行安全。霉菌除對大量材料有腐蝕危險外，部分霉菌還對人體有潛在危害，包括感染、毒性和過敏反應等。盡管大部分霉菌對免疫系統(tǒng)健康人群沒有危險，但大量研究顯示很多宇航員的免疫系統(tǒng)受空間飛行影響[23-24]。由于空間飛行相關因素引起免疫系統(tǒng)的大部分指標發(fā)生變化，通常是降低[25]，而霉菌感染通常會在免疫力低下情況時發(fā)生，因此防控這些霉菌種屬對保障宇航員健康是非常必要的。本研究中亦檢出了多種條件致病菌(表2)，如引發(fā)曲霉病的煙曲霉、黃曲霉、黑曲霉、土曲霉、構(gòu)巢曲霉和聚多曲霉[26-27]。霉菌除引起感染外，很多霉菌還會產(chǎn)生真菌毒素和過敏原，能夠影響免疫系統(tǒng)和其他器官。例如黃曲霉會產(chǎn)生黃曲霉毒素，一種致癌物[28]。產(chǎn)黃青霉能夠產(chǎn)生毒素引起發(fā)炎、細胞毒性反應[29]，橘青霉的橘青霉素可引起腎小球損害[30]。

微生物的生長曲線可以明確微生物的生長規(guī)律，本研究利用PDA平板法測定了53株霉菌的徑向生長曲線，結(jié)果顯示不同種屬霉菌生長速率差異非常大——培養(yǎng)到第7天，最小菌落直徑只有16 mm(枝孢霉屬菌)，最大的菌落直徑可以達到90 mm(共頭霉屬菌)。綜合比較各屬之間生長差異發(fā)現(xiàn)輪枝霉屬、枝孢霉屬和踝節(jié)菌屬菌株一般生長較慢，派倫霉屬菌株和鏈格孢屬菌株生長較快，共頭霉屬菌株生長最快。青霉屬和曲霉屬的屬內(nèi)不同種間菌株生長差異較大，但大部分生長較快。曲霉屬內(nèi)的雜色曲霉生長最慢，黑曲霉生長最快；青霉屬內(nèi)的產(chǎn)黃青霉生長最慢，草酸青霉生長較快。對于生長速度快，同時對材料或人體具有潛在危險的霉菌需要特別注意防護控制，如黑曲霉、煙曲霉、黃曲霉、構(gòu)巢曲霉、繩狀青霉、草酸青霉、共頭霉屬菌等，這些霉菌一旦開始繁殖，會迅速擴增，會對材料或人體帶來較大危害。

航天器的微生物防護與控制是一項復雜的系統(tǒng)工程，在航天器設計、地面建造和在軌飛行等階段都需要進行嚴格的微生物控制。消毒劑作為一種有效的微生物控制措施，在國外已經(jīng)應用于航天器微生物防控的多個階段[7]。例如制定航天器裝配車間例行的清潔消毒規(guī)程；在國際空間站美國艙段，每周會安排4 h進行清潔，使用一種便攜式吸塵器，6種消毒濕巾對艙內(nèi)環(huán)境進行清潔消毒。由于消毒劑具有相應的抗菌譜，對不同微生物的抗性效果差異較大，因此消毒劑對航天器廠房內(nèi)微生物的抗菌性研究對于航天器消毒劑的選擇具有重要意義。

本研究進行了4250Z和PHMB兩種消毒對航天器AIT廠房內(nèi)53株霉菌的抗菌性(MIC)研究。消毒劑4250Z屬于季銨鹽消毒劑，由4種烷基二甲基芐基氯化銨和2種烷基二甲基乙基芐基氯化銨混合制成，NASA曾將其用于空間站表面清潔[31]。季銨鹽為銨離子中四個氫原子都被烴基取代而生成的化合物，其中的有機根和氮離子結(jié)合成1價陽離子集團，可吸附于微生物表面，形成離子微團，穿透細胞壁并與細胞膜結(jié)合，深入類脂層和蛋白層，改變細胞膜的通透性，使細胞內(nèi)容物泄露，蛋白質(zhì)、核酸降解，導致微生物死亡[32]。本研究結(jié)果顯示4250Z對霉菌具有非常廣的抗菌性，對枝孢霉屬、曲霉屬、青霉屬、踝節(jié)菌屬、派倫霉屬、輪枝霉屬、鏈格孢屬和共頭霉屬都有抗性，并且這些種屬菌株對4250Z都很敏感，MIC4250均不超過80 ppm，由此說明較低濃度的4250Z即可很好的抑制這些霉菌的生長，是一種理想的消毒劑。本研究使用的另一種消毒劑是雙胍類消毒劑PHMB，是一種新型、高效、多用途的高分子聚合物，具有廣譜低毒、抑菌濃度低，易溶于水，水溶液無色無味，不燃不爆等特性，有極強的殺滅細菌和病毒的能力[33]。研究發(fā)現(xiàn)PHMB通過帶正電荷的雙胍集團吸附在帶負電荷的細菌表面，與磷脂雙分子層相互作用，破壞膜結(jié)構(gòu)與細菌染色體結(jié)合并將其濃縮形成納米級顆粒，最終導致細菌死亡[34]。目前認為PHMB對真菌具有廣譜抗菌性[35]，本研究結(jié)果亦顯示PHMB對霉菌具有較廣的抗菌性，對枝孢霉屬、鏈格孢屬、共頭霉屬、派倫霉屬、踝節(jié)菌屬和大部分青霉屬和曲霉屬菌株都有抗性，但對輪枝霉屬菌的抗性極差。

消毒劑具有相應的抗菌譜，對不同微生物的抗菌性可能差異較大，本研究僅對廠房內(nèi)部分霉菌進行了兩種消毒劑的抗菌性(MIC)檢測，結(jié)果表明受試的霉菌對雙胍類消毒劑PHMB敏感差異非常大，而對復合季銨鹽類消毒劑4250Z都較為敏感，相比較而言，消毒劑4250Z可能較為適合本研究AIT總裝廠房所分離鑒定出真菌的消毒應用。但由于本研究僅對部分空氣霉菌進行了試驗，還有大量其他霉菌以及細菌，特別是芽孢等耐受性強的微生物需要更廣泛深入的試驗。 同時在消毒劑的選擇應用時還需要考慮到消毒劑的安全性，如消毒劑的揮發(fā)性、殘留問題等，這些都將加劇航天器微生物污染與防護控制的難度。

4 結(jié)束語

通過對中國3個地區(qū)的航天器AIT廠房內(nèi)空氣中霉菌進行采集，利用培養(yǎng)法微生物檢測技術(shù)鑒定出53株霉菌，分屬8個屬。其中檢出多種對人體有潛在危險的條件致病菌和對材料具有腐蝕作用的霉菌，如黑曲霉、煙曲霉、黃曲霉、構(gòu)巢曲霉、繩狀青霉、草酸青霉、共頭霉屬菌等。這些霉菌生長速度又比較快，一旦開始繁殖，會迅速擴增，會對人體和材料帶來較大危害，因此在AIT廠房霉菌防護控制工作中需要特別注意防護控制。消毒劑作為一種有效的微生物控制措施，在國外已經(jīng)應用于航天器微生物防控的多個階段。本研究進行的消毒劑敏感性研究結(jié)果表明AIT廠房內(nèi)的不同霉菌對雙胍類消毒劑PHMB敏感差異非常大，而對復合季銨鹽類消毒劑4250Z都較為敏感，這些差異加劇了航天器微生物污染與防護控制的難度。