關(guān) 鵬，代小娟，秦培剛，宋金東，賀志有

（1.渭南職業(yè)技術(shù)學(xué)院農(nóng)學(xué)院，陜西渭南714026；2.新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，新疆烏魯木齊830011）

蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）是全球應(yīng)用非常廣泛的一種微生物殺蟲劑，其在生長過程中能產(chǎn)生多種對(duì)不同害蟲具有特異性殺蟲活性的毒素，如分泌期殺蟲蛋白（Secreted insecticidal proteins，SIPs）、殺蟲晶體蛋白（Insecticidal crystal proteins，ICPs，又稱伴胞晶體蛋白）及營養(yǎng)期殺蟲蛋白（Vegetative insecticidal proteins，VIPs）等[1-4]。Vip蛋白是Bt 菌株在營養(yǎng)期產(chǎn)生的，其序列是與殺蟲晶體蛋白（Cry 和Cyt）完全不同的一類毒蛋白，對(duì)鱗翅目、半翅目、鞘翅目等多種害蟲具有特異性殺蟲活性[5-9]，因此，vip 基因資源的挖掘一直是國內(nèi)外Bt研究的熱點(diǎn)之一。

目前，已發(fā)現(xiàn)的Vip 蛋白共有147 個(gè)（截至2019 年4 月10 日），根據(jù)國際Bt 營養(yǎng)期殺蟲蛋白的命名原則，將這些蛋白分為Vip1、Vip2、Vip3 和Vip4 四大類。其中，Vip1 和Vip2 可形成二元毒蛋白，對(duì)鞘翅目和半翅目害蟲具有特異性殺蟲活性[7-8]；Vip3 蛋白數(shù)量最多，分為Vip3A、Vip3B 和Vip3C等3 個(gè)亞類，共111 個(gè)，其對(duì)鱗翅目害蟲具有特異性殺蟲活性；Vip4 蛋白僅有一個(gè)，其殺蟲活性尚不明確。在Vip3A 亞類中Vip3Aa 類蛋白數(shù)量最多，共66 個(gè)，這些蛋白之間同源性均在95%以上，但是序列中個(gè)別氨基酸的差異對(duì)不同Vip3Aa 類蛋白在殺蟲譜和殺蟲毒力方面都具有顯著影響[10-12]。因此，對(duì)每個(gè)新型vip3Aa 類基因編碼蛋白的殺蟲活性研究具有非常重要的意義。

Bt TB22- 5 是從太白山森林土壤中分離得到的，能產(chǎn)生菱形伴胞晶體，是對(duì)鱗翅目的棉鈴蟲、甜菜夜蛾具有明顯殺蟲活性的菌株。本研究采用多對(duì)vip 基因通用引物對(duì)該菌株中vip 型基因進(jìn)行鑒定，獲得一個(gè)新型vip3Aa 類基因片段，通過對(duì)其全長序列的克隆及原核表達(dá)，并進(jìn)一步研究表達(dá)蛋白的殺蟲活性，旨在明確該新型vip3Aa 基因的殺蟲活性，為其應(yīng)用在農(nóng)業(yè)害蟲的生物防治中提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)菌株 野生型Bt TB22- 5 菌株、大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞均保存于渭南職業(yè)技術(shù)學(xué)院農(nóng)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 測試?yán)ハx 棉鈴蟲和甜菜夜蛾標(biāo)準(zhǔn)化測試幼蟲均飼養(yǎng)于渭南職業(yè)技術(shù)學(xué)院農(nóng)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室。

1.1.3 培養(yǎng)基 蛋白胨和NaCl 各10 g，酵母提取物5 g，用無菌水定容至1 L，即做成LB 液體培養(yǎng)基；在LB 液體培養(yǎng)基中加入1.5% 瓊脂粉即可做成LB固體培養(yǎng)基。

1.1.4 試劑 T4 DNA 連接酶、DNA 和蛋白質(zhì)Marker、氨芐青霉素（Amp）、卡那霉素、X- gal、IPTG、PCR SuperMix 均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；Axygen 質(zhì)粒提取試劑盒及DNA 凝膠回收試劑盒均購于上海百賽生物技術(shù)有限公司；pMD19- T載體購自日本TaKaRa 公司。

1.2 方法

1.2.1 Bt TB22- 5 質(zhì)粒的提取及vip3A 基因的鑒定參照REYES- RAMíREZ 等[13]的方法對(duì)Bt TB22- 5菌株中質(zhì)粒DNA 進(jìn)行提取。使用表1 中vip 通用引物對(duì)Bt TB22- 5 菌株的vip 基因進(jìn)行PCR 鑒定。vip1- F 和vip1- R、vip2- F 和vip2- R 引 物 序 列 及PCR 反應(yīng)條件參照HERNáNDEZ- RODRíQUEZ等[14]的 方 法；vip3- 1F 和vip3- 1R、vip3- 2F 和vip3- 2R引物序列及PCR 反應(yīng)條件參照FANG 等[15]的方法。若鑒定vip3 型基因的2 對(duì)引物均能擴(kuò)增出與其預(yù)測大小一致的產(chǎn)物，表明該擴(kuò)增片段與vip3Aa1 基因具有高度相似性；如果僅有1 對(duì)引物擴(kuò)增出與其預(yù)測大小一致的產(chǎn)物，則表明擴(kuò)增片段是一個(gè)序列同源性較低的新型vip3 基因[12，15]。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測及凝膠回收后，送深圳華大基因科技有限公司進(jìn)行測序。

表1 vip 基因鑒定的通用引物

1.2.2 vip3Aa 基因的全長克隆及測序 鑒定獲得的vip 基因片段經(jīng)NCBI BlastX 在線分析工具比對(duì)分析后，設(shè)計(jì)并合成引物vip3Aa- F（5′- ATGAACAA GAATAATACTAAATT - 3′）和vip3Aa- R（5′- TTAC TTAATAGAGACATCGTAA - 3′） 用于vip 基因的全長擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物與克隆載體pMD19- T 連接形成重組子，經(jīng)大腸桿菌DH5α 轉(zhuǎn)化后，對(duì)陽性單克隆中的插入基因序列進(jìn)行測序分析。

1.2.3 vip3Aa 基因的生物信息學(xué)分析 在NCBI數(shù)據(jù)庫中使用BLASTx 工具對(duì)vip3Aa 基因序列的同源性進(jìn)行分析；運(yùn)用Vector NTI Advance 11 和DNAStar 生物信息學(xué)分析軟件對(duì)vip3Aa 基因與其同源序列進(jìn)行序列比對(duì)；以pET- 28a 為大腸桿菌表達(dá)載體，vip3Aa 基因表達(dá)載體構(gòu)建的酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)，以及編碼蛋白的序列同源性分析均采用DNAMAN 7.0.2.176 軟件進(jìn)行。

1.2.4 vip3Aa66 基因的表達(dá)及檢測 以Bt TB22- 5質(zhì)粒DNA 為模板，采用引物vip3Aa66- F：5′- CGCATGAACAAGAATAATACTAAATT- 3′（ 下劃線部分為酶切位點(diǎn)：BamH I） 和vip3Aa66- R：5′-GCTTACTTAATAGAGACATCGTAA- 3′（下劃線部分為酶切位點(diǎn)：Sal I） 對(duì)vip3Aa66 基因進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。將擴(kuò)增產(chǎn)物和pET- 28a 載體分別經(jīng)過BamH I 和Sal I 雙酶切后，經(jīng)T4 連接酶連接后，得到重組質(zhì)粒pET- vip3Aa66；重組質(zhì)粒通過大腸桿菌DH5α 轉(zhuǎn)化，篩選陽性單克隆，用BamH I 和Sal I內(nèi)切酶對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行驗(yàn)證；最后，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21（DE3）中，并加入100 mL LB 液體培養(yǎng)基（含100 μg/mL 卡那霉素），在37 ℃180 r/min搖床中培養(yǎng)過夜。吸取5 mL 培養(yǎng)液加入到500 mL新鮮的無菌LB 液體培養(yǎng)基（含100 μg/mL 卡那霉素）中，在37 ℃180 r/min 下培養(yǎng)至菌液OD600值為1.6～1.8 時(shí)，加入500 μL 1 mol/mL IPTG 溶液后誘導(dǎo)表達(dá)8 h。培養(yǎng)產(chǎn)物經(jīng)4 ℃5 000×g 離心10 min后，棄上清，沉淀于- 20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｍ瑫r(shí)，空載pET- 28a 質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21（DE3）中經(jīng)上述方法誘導(dǎo)表達(dá)后作為陰性對(duì)照。表達(dá)產(chǎn)物的SDSPAGE 蛋白電泳檢測參照SCH?GGER 等[16]的方法進(jìn)行。

1.2.5 Vip3Aa66 蛋白殺蟲活性測定 對(duì)Vip3Aa66表達(dá)蛋白粗提物稱質(zhì)量，然后加入10 mL 無菌水，振蕩混勻后，懸液經(jīng)梯度稀釋法依次稀釋成5，10，20，40，80，160，320 μg/mL 共7 組不同濃度的樣品，等量的每組樣品分別加入到適量養(yǎng)蟲飼料中混勻，然后分別裝入到12 孔培養(yǎng)板中。每孔中放入大小相同的二齡期幼蟲2 頭，每組樣品3 次重復(fù)。同時(shí)以野生型Bt TB22- 5 菌株作為陽性對(duì)照，以加無菌水的飼料以及空載pET- 28a 質(zhì)粒在大腸桿菌BL21（DE3） 中表達(dá)的粗提物作為陰性對(duì)照。28 ℃飼養(yǎng)7～10 d 后統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果。

1.3 數(shù)據(jù)分析

殺蟲活性測定數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 10.0 軟件分析，計(jì)算LC50值。

2 結(jié)果與分析

2.1 Bt TB22-5 菌株中vip 基因的鑒定

電泳檢測結(jié)果表明，vip1- F 和vip1- R、vip2- F和vip2- R 引物擴(kuò)增產(chǎn)物大小均約為150 bp，這與預(yù)測的擴(kuò)增片段大小不相同；vip3- 1F 和vip3- 1R引物擴(kuò)增產(chǎn)物約為450 bp，vip3- 2F 和vip3- 2R 引物擴(kuò)增產(chǎn)物約為360 bp，這2 對(duì)引物擴(kuò)增結(jié)果與預(yù)測的擴(kuò)增片段大小一致（圖1）。由此可推測，Bt TB22- 5 菌株中含有一個(gè)與vip3Aa1 基因同源性較高的vip3 型基因。通過對(duì)這2 個(gè)vip3 型基因鑒定片段的測序分析表明，其與vip3Aa1 基因的序列同源性分別為98.9%和99.5%。結(jié)果表明，Bt TB22- 5菌株中含有一個(gè)vip3Aa 型基因片段。

2.2 Bt TB22-5 菌株中vip3Aa 型基因的全長克隆及其序列分析

利用vip3Aa- F 和vip3Aa- R 引物對(duì)vip3Aa 型基因的全長序列進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果檢測表明，PCR 產(chǎn)物大小約為2.4 kb（圖2）。測序結(jié)果分析表明，該基因總長2 370 bp，其推導(dǎo)的編碼蛋白由790 個(gè)氨基酸組成，分子量約為88.5 ku，等電點(diǎn)為5.02。Vip3Aa 類蛋白序列比對(duì)分析表明，該Vip3Aa 蛋白與已知的Vip3Aa9 蛋白質(zhì)序列具有最高的序列同源性（99.1%），二者之間僅有4 個(gè)氨基酸不同（圖3）。根據(jù)國際Bt 殺蟲晶體蛋白基因的命名規(guī)則，該基因被正式命名為vip3Aa66 （GenBank 登錄號(hào)為MK252100）。

2.3 vip3Aa66 基因的原核表達(dá)

表達(dá)產(chǎn)物的SDS- PAGE 分析表明，vip3Aa66基因表達(dá)約89 ku 大小的產(chǎn)物（圖4），這與預(yù)測的vip3Aa66 基因編碼蛋白質(zhì)分子量大小相一致。

2.4 vip3Aa66 表達(dá)蛋白粗提物的生物活性分析

生物活性測定分析表明，vip3Aa66 基因表達(dá)蛋白粗提物對(duì)甜菜夜蛾幼蟲具有較高的殺蟲活性，其LC50值為23.75 μg/mL；對(duì)鱗翅目的棉鈴蟲幼蟲殺蟲活性較低，其LC50值為243.87 μg/mL。然而，與野生型Bt TB22- 5 菌株相比，vip3Aa66 基因表達(dá)產(chǎn)物的殺蟲活性明顯較低（表2）。

表2 vip3Aa66 表達(dá)蛋白粗提物對(duì)2 種鱗翅目幼蟲的生物活性測定結(jié)果μg/mL

3 結(jié)論與討論

Bt 是目前應(yīng)用最為廣泛的一種微生物殺蟲劑，其內(nèi)生質(zhì)粒中攜帶的伴胞晶體蛋白編碼基因（cry和cyt）被大量克隆并已應(yīng)用在農(nóng)林、衛(wèi)生等害蟲的生物防治中。然而，隨著單一Bt 菌株或殺蟲基因的長期使用，造成害蟲耐藥性不斷出現(xiàn)，其防治效果日益降低[17]。因此，挖掘新的Bt 菌株資源、克隆新型殺蟲功能基因成為解決害蟲耐藥性問題的有效手段。Vip 蛋白是Bt 菌株在營養(yǎng)期產(chǎn)生的一類對(duì)多種昆蟲具有特異殺蟲活性的、完全不同于Cry 蛋白的一類殺蟲蛋白，而且Vip 和Cry 蛋白之間的交叉抗性極低[18]。因此，vip 基因作為一種新的殺蟲基因資源，可成為cry 基因的替代品，有效延緩害蟲耐藥性的出現(xiàn)。

在已報(bào)道的Vip3Aa 類蛋白中，Vip3Aa11、Vip3Aa39、Vip3Aa46、Vip3Aa58、Vip3Aa59、Vip3Aa-60、Vip3Aa61 等蛋白對(duì)甜菜夜蛾幼蟲均具有殺蟲活性[6，11-12，19-20]。本研究表明，Vip3Aa66 蛋白與Vip3Aa類蛋白之間序列差異性極小，但是它們對(duì)甜菜夜蛾幼蟲的殺蟲活性卻差異明顯，甚至有些Vip3Aa 類蛋白具有更廣泛的殺蟲譜，如Vip3Aa39 蛋白對(duì)小地老虎（Agrotis ipsilon）幼蟲也具有明顯的殺蟲活性[11]；亞洲玉米螟（Ostrinia furnacalis） 幼蟲對(duì)Vip3Aa46蛋白敏感[19]；Vip3Aa58 和Vip3Aa59 蛋白均對(duì)蘋果蠹蛾（cydia pomonella）有一定的殺蟲活性[12]。因此，vip3Aa66 作為一個(gè)新型vip3Aa 基因，對(duì)其表達(dá)蛋白進(jìn)行生物活性研究顯得尤為重要。

之前殺蟲活性分析表明，野生型Bt TB22- 5 菌株對(duì)棉鈴蟲和甜菜夜蛾幼蟲的殺蟲活性明顯高于Vip3Aa66 蛋白，其原因可能是由于產(chǎn)伴胞晶體的Bt TB22- 5 菌株表達(dá)某些Cry 或Cyt 蛋白，或者產(chǎn)生某些其他的毒蛋白，這些毒蛋白之間有可能產(chǎn)生協(xié)同增效的作用。因此，在后續(xù)的研究中，將對(duì)Bt TB22- 5 菌株中其他殺蟲基因進(jìn)行研究，為該菌株在農(nóng)業(yè)害蟲的生物防治提供理論依據(jù)。