張 浩卓詩勤 金蓉蓉王曉艷

［1.臺(tái)州市中醫(yī)院，浙江 臺(tái)州318000；2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江 杭州310053；3.鴻運(yùn)華寧（杭州） 生物醫(yī)藥有限公司，浙江 杭州310053］

肺癌是最常見的肺原發(fā)性惡性腫瘤。非小細(xì)胞肺癌（Non-small-cell carcinoma，NSCC）屬于肺癌的一種，非小細(xì)胞肺癌約占肺癌總數(shù)的80%～85%，主要是采用化療方式進(jìn)行［1-5］。腫瘤細(xì)胞具有自我更新、靶向轉(zhuǎn)化等特點(diǎn)，這些特性均與干細(xì)胞一樣，腫瘤細(xì)胞群中有一小部分細(xì)胞能導(dǎo)致腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移，并具有無限制自我更新、復(fù)制能力、高增殖活性等特性，這一亞群被稱為腫瘤干細(xì)胞，其相對(duì)應(yīng)的特性被稱為腫瘤干性［6-10］。腫瘤干性的一些表現(xiàn)包括耐藥性、遷移、侵襲、上皮間質(zhì)化等。靶向藥物表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑（EGF receptor tyrosine kinase inhibitors，EGFR-TKI）在非小細(xì)胞肺癌的治療中廣泛應(yīng)用，一些患者即使初始有效但也逐漸產(chǎn)生獲得性耐藥［11］。耐藥性的產(chǎn)生極大的影響了靶向藥物的應(yīng)用。如何克服EGFR-TKI 耐藥尋找逆轉(zhuǎn)耐藥的藥物及其機(jī)制也是一個(gè)重點(diǎn)。

中藥以其活血化瘀、清熱解毒、扶正固本等功效發(fā)揮抗腫瘤作用［13］。欖香烯（elemene，ELE）是從中藥溫郁金根莖提取的一種非細(xì)胞毒性抗腫瘤藥物抗癌有效成分。β-欖香烯的化學(xué)名為1-甲基-1-乙烯基-2，4-二異丙基環(huán)己烷，是一種新型的抗癌藥，以其獨(dú)特的藥理作用被廣泛用于治療肺癌、消化道腫瘤、腦瘤以及其它淺表性腫瘤，具有很強(qiáng)殺滅腫瘤細(xì)胞及抑制腫瘤生長的作用［14］，β-欖香烯有良好的抗癌作用，且對(duì)于調(diào)控干性及干細(xì)胞分化甚至對(duì)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）也有相關(guān)作用。本實(shí)驗(yàn)通過β-欖香烯單用或與吉非替尼聯(lián)合作用于吉非替尼的耐藥肺癌細(xì)胞株的一系列實(shí)驗(yàn)，探討β-欖香烯對(duì)肺癌細(xì)胞是否有干性方面作用并且對(duì)其初步探索。

1 材料

1.1 細(xì)胞株 人肺腺癌細(xì)胞株P(guān)C9細(xì)胞、A549細(xì)胞、H522細(xì)胞、HCC827細(xì)胞、NCI-H1299細(xì)胞，均購自 ATCC（American type culture collection），在本實(shí)驗(yàn)室常規(guī)傳代。

1.2 試藥 β-欖香烯購自中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)100268-201701，含有量≥98%；吉非替尼（Gefitinib）購自杭州啟真湖生物科技有限公司，批 號(hào)420019-201702。DMEM 高糖培養(yǎng)基、RPMI 1640培養(yǎng)基、胰酶（0.25% Trypsin-EDTA），購自Hyclone 公司，批號(hào) 161112；胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司，批號(hào) 170119；CellTiter 96? Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay，購自promega 公司，批號(hào) 170111；ZEB1抗體購自CST 公司，批號(hào) 170212；N-Cadherin、ECadherin 抗 體，購 自 EPIT＆MICS 公 司，批 號(hào) 170322；山羊抗鼠、山羊抗兔熒光二抗，購自聯(lián)科生物技術(shù)有限公司，批號(hào)170117。

1.3 儀器 倒置熒光顯微鏡（Nikon ECLIPSE TS100）；研究級(jí)正置顯微鏡（Nikon ECLIPSE 9i）（Nikon）；熒光定量PCR 儀（7500 Real Time PCR System）（BIO-RAD）；細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo Scientific Forma371）；生物安全柜（1300SERIES A2）；流式細(xì)胞儀（Calibur，美國BD 公司）。

2 方法

2.1 藥物配制 β-欖香烯注射液0.8 g／mL，用DMSO 按1 ∶3稀釋后配成母液保存，此時(shí)質(zhì)量濃度為200 mg／mL；吉非替尼母液濃度為200 mmol／L，按照所需體積、分子量及濃度計(jì)算所需稱取的吉非替尼粉末，溶于所需體積的DMSO 中即可；β-欖香烯和吉非替尼的濃度是參照文獻(xiàn)選擇，而200 μg／mL是β-欖香烯的凋亡濃度，選取主要的濃度并做等差或等比數(shù)列遞增。

2.2 體外細(xì)胞活性檢測(cè)（MTS 實(shí)驗(yàn)）取對(duì)數(shù)生長期的肺癌PC9、A549、H522、NCI-H1299細(xì)胞，每孔1×104個(gè)細(xì)胞，接種于96孔板內(nèi)培養(yǎng)；24 h后加入各實(shí)驗(yàn)組藥物，每種濃度設(shè)6個(gè)復(fù)孔，并設(shè)空白組（不接種細(xì)胞）、對(duì)照組（只含等量溶劑）；培養(yǎng)24 h 后每孔加入CellTiter 96? Aqueous One Solution Reagent 20 μL，37 ℃、5%CO2條件下繼續(xù)孵育1～4 h；在酶標(biāo)儀上選擇490 nm 波長，測(cè)定各孔光吸收值OD，計(jì)算細(xì)胞活力=［（OD試驗(yàn)組-OD空白組）／（OD對(duì)照組-OD空白組）］×100%。

2.3 細(xì)胞遷移檢測(cè) 將待檢測(cè)的細(xì)胞預(yù)先鋪入6孔板，使用含10%胎牛血清的DMEM 完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，待細(xì)胞密度達(dá)到100%時(shí)，用100 μL 的槍頭劃過細(xì)胞表面，使平鋪的細(xì)胞間出現(xiàn)縫隙，每孔劃3條；棄培養(yǎng)基，用無菌PBS 洗去懸浮的細(xì)胞，用無血清的含藥DMEM 培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，在板上做好標(biāo)記；取0、6、12、24、36 h 等時(shí)間點(diǎn)，用倒置顯微鏡對(duì)標(biāo)記點(diǎn)進(jìn)行拍照記錄細(xì)胞劃痕愈合情況，計(jì)數(shù)。

2.4 細(xì)胞侵襲檢測(cè) 小室中加入50 μg，40 μL Fibronectin，次日吸取多余的液體，并用無菌PBS清洗后棄去并晾干；待檢測(cè)細(xì)胞用胰酶消化，離心后使用無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，并加入各實(shí)驗(yàn)組藥物，每個(gè)小室5×104個(gè)細(xì)胞，300 μL 的無血清含藥培養(yǎng)基；小室外使用含有10% 胎牛血清的DMEM 完全培養(yǎng)基作為誘導(dǎo)。12～24 h 后，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)基，小室用預(yù)冷的甲醇置于-20 ℃固定8 min，1%結(jié)晶紫染色室溫染色20 min，將小室上方的細(xì)胞擦拭干凈，割下膜，甘油封片；顯微鏡拍照并計(jì)數(shù)。

2.5 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 將待檢測(cè)的細(xì)胞先鋪入6孔板，使用含10%胎牛血清的DMEM 完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，待細(xì)胞密度達(dá)到90% 時(shí)，將培養(yǎng)液換成不同濃度的含藥的無血清培養(yǎng)基，進(jìn)行處理，同時(shí)設(shè)置陰性陽性對(duì)照的細(xì)胞；48 h 后棄去培養(yǎng)基，PBS 洗3遍，用胰酶消化，收集細(xì)胞，離心棄上清，PBS洗2次，離心棄上清；按Annexin V／PI apoptosis kit 說明處理細(xì)胞，加入100 μL 1×bindding buffer重懸細(xì)胞，分別加入10 μL 的FITC 和PI，室溫孵育10～15 min 后，每管再加入400 μL 1×bindding buffer，混勻，將其轉(zhuǎn)移至流式管，上流式儀檢測(cè)。

2.6 細(xì)胞周期檢測(cè) 將待檢測(cè)的細(xì)胞先鋪入6孔板，使用含10%胎牛血清的DMEM 完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，待細(xì)胞密度達(dá)到80% 時(shí)，將培養(yǎng)基換成含有40 μmol／L Gefitinib 的含有10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，進(jìn)行同步化處理；同步化處理24 h 后，將培養(yǎng)液換成不同濃度的含藥的無血清培養(yǎng)基，進(jìn)行處理；24 h 后，棄去培養(yǎng)基，PBS 洗3遍，用胰酶消化，收集細(xì)胞，離心棄上清，PBS洗1次，離心棄上清；按Cell Cycle Staining Kit 說明書先后加入1 mL Reagent A 和10 μL Reagent B，混勻5～10 s，室溫孵育30 min 后轉(zhuǎn)移至流式管，上流式儀檢測(cè)。

2.7 Western blot 取40 μg 蛋白，加入溴酚藍(lán)，體積不同的樣品用RIPA 或超純水補(bǔ)齊至相同體積，100 ℃煮沸5 min，取出放冰上。制膠配方見表1。

表1 SDS-聚丙烯酰胺凝膠的配方Tab.1 Formulation of SDS-polyacrylamide gel

2.7.1 電泳 起始電壓為80 V，約30 min 后溴酚藍(lán)呈一條水平線并進(jìn)入分離膠，再調(diào)至120 V電壓。

2.7.2 轉(zhuǎn)膜 電泳停止后，將SDS-PAGE 膠取下，進(jìn)行半干轉(zhuǎn)膜法轉(zhuǎn)膜，注意放置順序并趕除氣泡，調(diào)電壓至100 V，轉(zhuǎn)膜時(shí)間由蛋白大小決定，一般在60～90 min。

2.7.3 封閉 將轉(zhuǎn)好的膜取出，正面朝上，用5%的牛奶進(jìn)行封閉，室溫約2～4 h。

2.7.4 一抗孵育 按抗體說明書要求用5% 牛奶稀釋抗體，將膜置于稀釋的抗體中，搖床4 ℃過夜。

2.7.5 二抗孵育 將一抗回收，加入適量TBST洗液，水平搖床洗滌5 min，反復(fù)3次，用5%牛奶稀釋二抗，將膜置于稀釋的抗體中，室溫孵育2～3 h。

2.7.6 ECL 顯色 加入適量TBST 洗液，水平搖床洗滌3次，5 min／次，取ECL 發(fā)光試劑A 和B按1 ∶1的比例混勻后，加至膜上，約等待1 min，在暗室曝光顯影。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果均是由獨(dú)立的3次重復(fù)試驗(yàn)得到，應(yīng)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以（）表示，組間比較用t檢驗(yàn)，多組比較用one-way AVONA 檢驗(yàn)，P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 β-欖香烯聯(lián)合吉非替尼對(duì)肺癌細(xì)胞活性的影響 如圖1所示，與對(duì)照組比較，除50 μg／mL β-欖香烯對(duì)肺癌細(xì)胞H1299細(xì)胞活性無影響外，β-欖香烯顯著抑制肺癌細(xì)胞株（A549、H1299、H522、PC9）細(xì)胞活性（P＜0.05，P＜0.01），細(xì)胞增殖抑制。β-欖香烯濃度在0～50 μmol／L 內(nèi)對(duì)肺癌細(xì)胞活性無顯著影響。

圖1 β-欖香烯對(duì)肺癌細(xì)胞活性的影響Fig.1 Effects of β-elemene on the activity of lung cancer cells

已有研究表明，A549細(xì)胞和H1299細(xì)胞對(duì)吉非替尼具有耐藥性，后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用A549細(xì)胞。單用吉非替尼隨著其濃度的增加A549細(xì)胞活性逐漸下降；不同濃度吉非替尼聯(lián)合40 μg／mL β-欖香烯作用時(shí)，A549細(xì)胞活性也逐漸下降，且較單用吉非替尼更能抑制細(xì)胞活性；與對(duì)照組比較，40 μg／mL β-欖香烯聯(lián)合吉非替尼（5、10 μmol／L）能顯著抑制A549細(xì)胞活性（P＜0.05），見圖2。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用5 μmol／L 吉非替尼和40 μg／mL β-欖香烯進(jìn)行。

3.2 β-欖香烯聯(lián)合吉非替尼對(duì)肺癌細(xì)胞凋亡、周期的影響 如圖3所示，β-欖香烯、吉非替尼、β-欖香烯聯(lián)合吉非替尼對(duì)A548細(xì)胞凋亡沒有明顯影響；而β-欖香烯聯(lián)合吉非替尼作用時(shí)，S 期細(xì)胞比例降低（P＜0.05）。

3.3 β-欖香烯聯(lián)合吉非替尼對(duì)肺癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移的影響 如圖4所示，β-欖香烯聯(lián)合吉非替尼處理A549細(xì)胞12 h 后，A549細(xì)胞侵襲能力顯著抑制（P＜0.01）；β-欖香烯聯(lián)合吉非替尼處理A549細(xì)胞12、24、36 h 后，A549細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力顯著抑制（P＜0.05）。

圖2 β-欖香烯聯(lián)合吉非替尼對(duì)A549細(xì)胞活性的影響Fig.2 Effects of β-elemene combined with gefitinib on the activity of A549 cells

3.4 β-欖香烯聯(lián)合吉非替尼作用抑制肺癌細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithlial-Mesenchymal Transition，EMT）神經(jīng)-鈣粘連蛋白（N-Cadherin）、轉(zhuǎn)錄因子（ZEB1），波動(dòng)蛋白（Vimentin）是間質(zhì)化細(xì)胞的標(biāo)記，上皮樣細(xì)胞的標(biāo)志物為上皮-鈣粘蛋白（E-Cadherin）。與對(duì)照組比較，β-欖香烯聯(lián)合吉非替尼處理A549細(xì)胞，E-Cadherin 蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，N-Cadherin、ZEB1、Vimentin 蛋白表達(dá)均顯著下調(diào)（P＜0.01），見圖6。

4 討論

圖3 β-欖香烯聯(lián)合吉非替尼對(duì)肺癌細(xì)胞凋亡、周期的影響Fig.3 Effects of β-elemene combined with gefitinib on apoptosis and cell cycle of lung cancer cells

圖4 β-欖香烯聯(lián)合吉非替尼對(duì)肺癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移的影響Fig.4 Effects of β-elemene combined with gefitinib on invasion and metastasis of lung cancer cells

圖5 β-欖香烯聯(lián)合吉非替尼對(duì)肺癌細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響Fig.5 Effects of β-elemene combined with gefitinib on epithelial-mesenchymal transition of lung cancer cells

綜上結(jié)果，β-欖香烯與吉非替尼合用能夠抑制肺癌細(xì)胞的生長、轉(zhuǎn)移，抑制EMT 過程，對(duì)肺癌細(xì)胞的腫瘤干性有明顯的作用。ZEB1與抑制干性的基因相關(guān)且在胰腺癌細(xì)胞中得到證實(shí)，與胰腺癌干細(xì)胞相關(guān)［15-16］。因此找尋通過調(diào)控干性從而逆轉(zhuǎn)肺癌細(xì)胞對(duì)吉非替尼的耐藥性的分子，可能為抗腫瘤治療提供1個(gè)新靶點(diǎn)，為化療提供輔助藥物，為中藥應(yīng)用拓寬道路。

欖香烯為我國自行研制的國家二類非細(xì)胞毒性抗腫瘤藥，它是從姜科植物溫郁金中提取的萜烯類化合物的混合物，具有免疫調(diào)節(jié)作用，其中的主要成分為β-欖香烯。目前臨床上廣泛應(yīng)用于惡性漿膜腔積液、消化道腫瘤、腦瘤、肺癌及一些淺表性腫瘤的治療。高濃度β-欖香烯通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡來抗腫瘤，有報(bào)道稱低濃度的β-欖香烯能夠逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的耐藥性。最近的研究發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生耐藥性的腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移能力較其他細(xì)胞強(qiáng)，且經(jīng)化療后促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的EMT 過程，產(chǎn)生一些EMT 標(biāo)志性基因的變化。由此可見，耐藥性和EMT 之間可能存在某種聯(lián)系?？鼓[瘤目前的研究熱點(diǎn)在腫瘤干細(xì)胞上，側(cè)重于對(duì)腫瘤干細(xì)胞的相關(guān)特性進(jìn)行研究，更加深入的探索相關(guān)的機(jī)制。