張晨萍，趙志剛，宿 婧，伊文博，趙 悅

(忻州師范學(xué)院 生物系，山西 忻州 034000)

現(xiàn)代人對(duì)健康食品和食品安全的要求越來(lái)越高，天然色素直接取自于自然界中的動(dòng)物、植物和微生物，不僅具有良好色澤，而且具有一定的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和保健功效，用于食品、化妝品乃至藥品安全可靠[1]。刺玫花(Rose rugosa)，薔薇科薔薇屬植物，多年生常綠或落葉小灌木[2]。刺玫紅色素屬于水溶性色素，易溶于水、甲醇、乙醇等極性溶劑。有研究表明，品種不同、溶液pH值不同，刺玫紅色素的顏色也不同，最大吸收波長(zhǎng)也不同，一般在可見(jiàn)光區(qū)500～530nm有吸收。刺玫色素屬于花色苷色素，具有抗氧化和調(diào)節(jié)血脂作用，同時(shí)具有抑菌作用，對(duì)金黃色葡萄球菌、銅鋁假單胞菌、白色念珠球菌等菌種作用最為明顯[3]。刺玫色素對(duì)羊毛和蠶絲織物染色效果較好，可作為蛋白質(zhì)纖維染色劑[4]。本實(shí)驗(yàn)以刺玫花瓣為原料，采用微波輔助提取刺玫紅色素，并研究其體外抗氧化性，為刺玫的開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

新鮮刺玫，山西忻州，取花瓣于40℃烘干后粉碎；矢車菊-3，5-O-雙葡萄糖苷(Cy-3,5-diglu)標(biāo)準(zhǔn)品，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙醇：鄭州派尼化學(xué)試劑廠，分析純。

1.2 主要儀器

752N紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海儀電分析儀器有限公司；LC-4016低速離心機(jī)：安徽中佳科學(xué)儀器有限公司；UV-2800 型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海尤尼柯公司；NJLO7-3型實(shí)驗(yàn)專用微波爐：南京杰全微波設(shè)備有限公司；FA2004N電子天平：上海菁海儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 刺玫紅色素最大吸收波長(zhǎng)

圖1 刺玫紅色素吸收光譜

Fig.1 Absorption spectrum of rose rugosa red pigment

準(zhǔn)確稱取0.5g刺玫花瓣粉末，以50%的乙醇為浸提液，料液比(m/V) l∶10，微波功率400W，40℃下提取5min，過(guò)濾離心后取上清液定容至100mL，以50%乙醇溶液作為空白，在200～700 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描得圖1，由圖可知最大吸收波長(zhǎng)為520.2nm。

1.3.2 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)刺玫紅色素的最大吸收波長(zhǎng)，選取Cy-3,5-diglu作為參照物，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[5]。精確稱取Cy-3,5-diglu標(biāo)準(zhǔn)品1.00 mg，溶于50%乙醇溶液中，再稀釋成5.0、10.0、15.0、20.0、30.0 μg/mL一系列濃度梯度，520 nm處測(cè)定各自的吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖2。

圖2 Cy-3,5-diglu 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of Cy-3,5-diglu

其中，X為刺玫紅色素得率(mg/g)，C為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出的濃度(μg/mL),V為定容體積(mL)，M為原料刺玫花質(zhì)量(g)。

1.3.3 刺玫紅色素的提取方法

1.3.3.1 單因素實(shí)驗(yàn)

稱取0.5g的刺玫花瓣粉末，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)0%、50%、70%、80%、90%、100%，微波功率300W、400W、500W、600W、700W，提取時(shí)間2min、3min、4min、5min、6min，液料比1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12，提取所得溶液于4000r/min離心20min，取上清液，定容至100mL，在520nm處測(cè)量吸光度[6]，并計(jì)算得率。

1.3.3.2 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以紅色素得率為參考指標(biāo)，采用正交表L9(34)優(yōu)化微波法輔助提取刺玫紅色素的最佳工藝條件，其因子水平見(jiàn)表 1。

表1 L9(34)正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Tab.e 1 Factors and levels of L9(34) orthogonal test

1.3.4 刺玫花紅色素體外抗氧化性測(cè)定

按照上述試驗(yàn)得出的最佳工藝條件提取刺玫紅色素，得到的提取液濃縮干燥后用體積分?jǐn)?shù) 50 %的乙醇溶液配制為10 mg/mL、20 mg/mL、30mg/mL、40 mg/mL、50mg/mL質(zhì)量濃度的刺玫花紅色素溶液，并配制同濃度的Vc作對(duì)照[7]。

1.3.4.1 總還原力測(cè)定

采用鐵離子還原力測(cè)定法[8]，取5支試管分別加入不同濃度的樣品溶液1 mL，加入3.0 mL pH值為6.8的磷酸鹽緩沖液和2.5 mL1%的鐵氰化鉀溶液，45℃水浴30 min后放在室溫下自然冷卻后加入3.0 mL 10%的三氯乙酸溶液，震蕩混合后離心(6000 r/min，20 min)。取上清液3 mL加入2 mL蒸餾水和1 mL0.1%三氯化鐵溶液振蕩搖勻，在700 nm處測(cè)吸光度值，以同濃度的Vc作對(duì)照。

1.3.4.2 刺玫花紅色素清除羥基自由基(·OH)能力的測(cè)定

采用水楊酸法[9]，取5支試管分別加入不同濃度的樣品溶液1 mL，向其加入濃度為6 mmol/L的亞硫酸鐵溶液1 mL，再加入相同濃度的雙氧水1 mL，振蕩搖勻后放置10 min，再加入1 mL6 mmol/L的水楊酸溶液，振蕩搖勻放置30 min，在510 nm處測(cè)吸光度值，以同濃度的Vc作陽(yáng)性對(duì)照。

其中：A0——不加樣品的吸光度值；Ai——加入樣品的吸光度值；Aj——不加入水楊酸的吸光度值。

1.3.4.3 刺玫花紅色素清除超氧陰離子自由基(O2-·H)能力的測(cè)定

采用鄰苯三酚自氧化法[10]，取5支試管分別加入不同濃度的樣品溶液1 mL，加入pH為8.2的Tris-HCl緩沖液6 mL，振蕩搖勻置于37℃水浴鍋中水浴10 min，加入37℃鄰苯三酚鹽酸溶液1 mL，振蕩搖勻靜置4 min后用1 mL濃鹽酸終止反應(yīng)，在波長(zhǎng)325 nm處測(cè)定吸光度值。以同濃度的Vc作陽(yáng)性對(duì)照。

其中：A0——不加樣品測(cè)定的吸光度值；A——加入樣品測(cè)定的吸光度值。

2 結(jié)果與分析

2.1 微波法輔助提取刺玫紅色素工藝條件優(yōu)化

2.1.1 單因素實(shí)驗(yàn)

從圖2(a)可以看出，紅色素得率伴隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增加而逐步降低，乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%時(shí)，紅色素得率較高。從經(jīng)濟(jì)方面考慮，50%乙醇作為溶劑也較為合適。

從圖2(b)可以看出，微波法功率在300～500W之間，紅色素得率伴隨著微波功率增加而增加，在微波法功率達(dá)到500W的時(shí)候，紅色素得率達(dá)到了最大值，但是之后隨著微波功率增加得率降低，這可能是因?yàn)槲⒉ǚㄓ泻軓?qiáng)的熱效應(yīng)，功率過(guò)大可能會(huì)使色素受到一定的破壞，引起得率降低[11]。

從圖2(c)可以看出，微波時(shí)間達(dá)到3min時(shí)，色素得率達(dá)到了最大值，之后伴隨著微波時(shí)間的逐步增加色素得率降低，提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，色素長(zhǎng)期處于較高溫度下，結(jié)構(gòu)會(huì)被破壞，得率降低[12]。由此可知微波法提取刺玫紅色素時(shí)間不應(yīng)過(guò)長(zhǎng)。

從圖2(d)可以看出，溫度在25-50℃之間，色素得率伴隨著溫度的增加逐步增加，溫度大于50℃時(shí)，色素得率降低。

從圖2(e)可以看出，液料比在1∶4～1∶8之間，色素得率伴隨著液料比的變化逐步增加，液料比為1∶8～1∶12時(shí)，伴隨著液料比的變化色素得率降低。

圖3 單因素實(shí)驗(yàn)

Fig.3 Single factor experiment

2.1.2 正交試驗(yàn)分析

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析，對(duì)提取刺玫紅色素的微波功率、提取時(shí)間、提取溫度、料液比進(jìn)行了L9(34)試驗(yàn)，其結(jié)果如表2。由正交試驗(yàn)可以看出各因素對(duì)刺玫紅色素得率的影響順序?yàn)镃>B>A>D，即提取溫度>微波時(shí)間>微波功率>料液比。由正交試驗(yàn)可得到刺玫紅色素最佳提取的優(yōu)化工藝參數(shù)為：A2B1C3D3，即在微波功率500W，微波時(shí)間2min，提取溫度60℃，料液比為1∶10 g/m L。對(duì)所得出的正交表進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，用最佳優(yōu)化的條件進(jìn)行三次重復(fù)試驗(yàn)，刺玫紅色素得率接近2.03mg/g，結(jié)果重現(xiàn)性好。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.e 2 Result of orthogonal experiment

表2(續(xù))

2.2 刺玫紅色素體外抗氧化活性測(cè)定結(jié)果

2.2.1 總還原力測(cè)定結(jié)果

分析圖4可以得出，刺玫紅色素溶液的還原力與Vc溶液的還原力都隨著溶液濃度的增加而增加，說(shuō)明刺玫紅色素具有一定的抗氧化活性，且與濃度成正比。

圖4 刺玫紅色素還原力Fig.4 Reducing force of rose rugosa red pigment

2.2.2 刺玫紅色素對(duì)羥基自由基(·OH)清除率的測(cè)定

體系發(fā)生化學(xué)反應(yīng)使得在510 nm處測(cè)定的吸光度值變小，根據(jù)測(cè)得的吸光度值可以計(jì)算出刺玫紅色素對(duì)羥基自由基(·OH)的清除能力。分析圖5可以得出，隨著刺玫紅色素溶液濃度的增加，其吸光度值降低，對(duì)羥基自由基的清除率增加，說(shuō)明刺玫紅色素羥基自由基(·OH)有一定的清除能力，并與濃度呈正比。

圖5 刺玫紅色素對(duì)羥基自由基(·OH)清除率Fig.5 Red pigment ability to remove hydroxyl radicals(·OH)

2.2.3 刺玫紅色素對(duì)超氧陰離子(O2-·)清除能力測(cè)定結(jié)果

在堿性條件下鄰苯三酚發(fā)生氧化反應(yīng)，產(chǎn)生有色的產(chǎn)物和超氧陰離子自由基(O2-·H)；超氧陰離子自由基(O2-·H)對(duì)此氧化反應(yīng)有催化作用，加速反應(yīng)的進(jìn)行。隨著反應(yīng)的進(jìn)行，有色中間產(chǎn)物產(chǎn)生的越多，顏色越深，在325nm處測(cè)得的吸光度值越大[13]，其對(duì)羥基自由基的清除率越大，根據(jù)測(cè)得的吸光度值可以判斷刺玫紅色素對(duì)超氧陰離子(O2-·H)的清除能力。分析圖6可以得出，刺玫紅色素提取液對(duì)超氧陰離子自由基(O2-·H)具有較好的清除能力。

圖6 刺玫紅色素對(duì)超氧陰離子自由基清除率Fig.6 Red pigment ability superoxide anion radicals(O2-·H)

3 結(jié)論

本研究采用正交試驗(yàn)對(duì)工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，最后根據(jù)刺玫紅色素得率，得出微波提取的最優(yōu)方案是乙醇濃度50%，微波功率500W，微波時(shí)間2min，提取溫度60℃，料液比為1∶10 g/m L，此時(shí)花色素得率為2.03mg/g。與傳統(tǒng)水浴提取法和超聲波提取法對(duì)比微波提取法大大地提高了色素得率，同時(shí)縮短了提取時(shí)間。此實(shí)驗(yàn)證明了微波法提取刺玫紅色素的可行性。通過(guò)對(duì)刺玫紅色素的體外抗氧化性的測(cè)定結(jié)果可以看出，刺玫紅色素具有一定的體外抗氧化性，且隨著刺玫紅色素溶液濃度的增大，還原力增加，其對(duì)羥基自由基(·OH)的清除能力增加，對(duì)超氧陰離子自由基(O2-·H)的清除能力也在增加。