孟琴琴 郭美亮 范 晴 袁定芬 鄧 輝

日光性角化病(actinic keratosis，AK)、基底細(xì)胞癌(basal cell carcinoma，BCC)及鱗狀細(xì)胞癌(squamous cell carcinoma，SCC)是與紫外線和化學(xué)因素等有關(guān)的皮膚腫瘤。三者均多見于中老年皮膚白皙者。AK的發(fā)病在基因水平上可能與P53基因的表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致細(xì)胞更少的增值抑制與凋亡有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，AK與SCC中凋亡蛋白含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase-3)明顯降低，其中AK作為癌前期皮膚病是鱗癌的誘發(fā)因素之一[1,2]。血清和糖皮質(zhì)激素蛋白激酶(serum and glucocorticoid-regulated protein kinases，SGKs)在多種腫瘤中作為判斷預(yù)后的標(biāo)志并作為治療的靶點(diǎn)。SGK1亞基的磷酸化不僅調(diào)控細(xì)胞的增殖和分化，而且促進(jìn)細(xì)胞的存活和凋亡抑制。SGK1在許多惡性腫瘤中高表達(dá)，例如非小細(xì)胞肺癌、食管鱗狀細(xì)胞癌、口腔鱗狀細(xì)胞癌、宮頸癌等[3-6]。同時，SGK1對黑素瘤細(xì)胞的肺轉(zhuǎn)移也具有促進(jìn)作用[7]。在高滲鹽氯化鈉存在的條件下，SGK1對特應(yīng)性皮炎的發(fā)展具有促進(jìn)作用[8]。但是目前SGK1在非黑素瘤皮膚癌(non-melanoma skin carcinoma，NMSC)中的研究尚未有發(fā)現(xiàn)。本研究旨在通過檢測正常皮膚組織(normal skin，NS)、AK、BCC及SCC中SGK1水平，初步探討其在AK、BCC和SCC發(fā)生發(fā)展過程中的作用及意義，為臨床早期診斷和治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料及方法

1.1 組織標(biāo)本 AK標(biāo)本25例，BCC標(biāo)本28例，SCC標(biāo)本28例及正常標(biāo)本25例均來自本院。臨床和人口資料取自患者檔案，病理資料來自本院病理科醫(yī)師。石蠟包埋的組織經(jīng)常規(guī)HE染色分別確診為AK，BCC，SCC及正常標(biāo)本NS。正常組織取自良性腫塊周圍的正常皮膚。各組年齡及性別均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(表1)。

表1 標(biāo)本的年齡及性別分布

1.2 試劑 SGK1抗體購自美國Abcam公司(ab32374)，稀釋濃度為1∶200，免疫組化試劑盒(SA1022)購自武漢博士德生物有限公司。

1.3 免疫組化 將石蠟包埋組織塊切成4 μm厚的組織切片，貼于免疫組化專用載玻片上。采用SABC法進(jìn)行免疫組化染色。步驟如下：石蠟切片62℃烘箱烘烤1 h，三份二甲苯中分別浸泡15 min脫蠟，梯度酒精水化后將組織切片置于PH=9.0的EDTA修復(fù)液中用水浴鍋加熱法抗原修復(fù)20 min。0.5%的Triton-100對細(xì)胞膜進(jìn)行破膜處理，3%的過氧化氫溶液封閉內(nèi)源性過氧化物酶10 min。5%的牛血清白蛋白封閉非特異性結(jié)合60 min。組織切片上加SGK1抗體4℃過夜孵育。生物素標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白作為二抗室溫孵育30 min，SABC復(fù)合物37℃孵育30 min。DAB作為顯色劑，蘇木精作為復(fù)染劑，依次加入。依照試劑說明，上述步驟每一步操作后用PBS清洗玻片。除了特殊說明外，所有孵育均在常溫下進(jìn)行。

1.4 結(jié)果判定 SGK1染色后，每個標(biāo)本隨機(jī)選擇三個高倍視野(HPFs，200)，利用Image Pro Plus軟件進(jìn)行陽性細(xì)胞率分析，計(jì)算出三個視野中的平均陽性細(xì)胞率。采用半定量評估方法將染色分為四個等級：陰性(-)、弱陽性(+)、陽性(++)以及強(qiáng)陽性(+++)(表2)。

表2 半定量評估方法

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0軟件分析結(jié)果。計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)，多組之間陽性細(xì)胞率的比較使用方差分析，其中兩兩比較采用方差分析LSD法。P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化照片

2.2 SGK1在正常皮膚的表達(dá) 在正常皮膚標(biāo)本中，SGK1弱陽性表達(dá)，陽性著色主要定位于表皮基底層的細(xì)胞質(zhì)(圖1)。

2.3 SGK1在AK中的表達(dá) 在25例AK中，3例(12%)強(qiáng)陽性表達(dá)(表3)；大部分AK標(biāo)本中，SGK1弱陽性或陽性表達(dá)，主要表達(dá)于增厚的表皮基底層的細(xì)胞質(zhì)(圖2)；AK中SGK1陽性細(xì)胞率與正常標(biāo)本相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(表5)。

表3 SGK1的表達(dá)

表4 AK，BCC，SCC與正常組織中SGK1強(qiáng)陽性率的比較

2.4 SGK1在BCC中的表達(dá) 在28例BCC中，16例(57.14%)強(qiáng)陽性表達(dá)(表3)，表達(dá)于癌細(xì)胞的胞質(zhì)和胞核(圖3)。BCC組織中SGK1陽性細(xì)胞率明顯高于正常標(biāo)本和AK標(biāo)本，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表3，5)。

2.5 SGK1在SCC中的表達(dá) 在28例SCC中，14例(50%)強(qiáng)陽性表達(dá)(表3)，在癌細(xì)胞的胞質(zhì)和胞核中均強(qiáng)陽性表達(dá)(圖4)。 57.14%的BCC和50%的SCC出現(xiàn)強(qiáng)陽性表達(dá)，明顯高于正常皮膚組織中的強(qiáng)陽性率，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表3，4)。SCC標(biāo)本中SGK1陽性細(xì)胞率明顯高于AK與正常組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表3，5)。

表5 SGK1陽性細(xì)胞率的兩兩比較

2.6 統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果 BCC和SCC中SGK1強(qiáng)陽性率明顯高于正常標(biāo)本，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；AK強(qiáng)陽性率與正常標(biāo)本相比差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表3，4)。BCC和SCC中SGK1陽性細(xì)胞率明顯高于NS和AK組織，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；BCC和SCC陽性細(xì)胞率比較不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，AK和NS陽性細(xì)胞率比較也不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(表3，5)。

圖1 1a、1b、1c:SGK1在正常皮膚組織中表達(dá)(免疫組化，×40，×200，×400)圖2 2a、2b、2c:SGK1在AK組織中表達(dá)(免疫組化，×40，×200，×400)圖3 3a、3b、3c:SGK1在BCC組織中表達(dá)(免疫組化，×40，×200，×400)圖4 4a、4b、4c:SGK1在SCC組織中表達(dá)(免疫組化，×40，×200，×400)

3 討論

SGK1屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶的亞家族，其受到多種刺激的急性轉(zhuǎn)錄調(diào)控，包括血清和糖皮質(zhì)激素。SGK1被證明影響許多生理功能，如細(xì)胞增殖，分化和凋亡[9,10]，且與細(xì)胞遷移有關(guān)。一方面，細(xì)胞的遷移主要依賴于Ca2+信號傳導(dǎo)[11]，在細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+儲存耗盡后， SGK1上調(diào)膜上鈣離子釋放激活鈣離子通道蛋白(Calcium-release- activated-calcium，Orai1)的數(shù)量進(jìn)而促進(jìn)Ca2+依賴性腫瘤細(xì)胞的遷移[12]。 另一方面，在慢性心理壓力下， SGK1的表達(dá)升高導(dǎo)致P53(腫瘤抑制蛋白)的功能減弱或喪失，促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生[13]。最后，Wnt信號通路的激活誘導(dǎo)SGK1的表達(dá)導(dǎo)致叉頭框蛋白O家族(forkhead box protein O，F(xiàn)oxOs)的核外移，最終抑制FoxOs介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[14]，促進(jìn)腫瘤的發(fā)展?；谶@些機(jī)制，SGK1在多種腫瘤中被研究，與SGK1在皮膚鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)模式相比，在肺非小細(xì)胞肺癌和原發(fā)性轉(zhuǎn)移性前列腺癌中，SGK1呈不均勻著色，在癌細(xì)胞團(tuán)周邊的癌細(xì)胞中，SGK1強(qiáng)陽性著色，在其內(nèi)部的細(xì)胞則為灶性著色[15,16]。除了自身代謝對腫瘤發(fā)展的影響，作為新型免疫調(diào)節(jié)抑制劑，SGK1對免疫促炎細(xì)胞因子如白介素1(Interleukin1，IL-1)表達(dá)的抑制導(dǎo)致腫瘤的免疫逃避，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生[17]。

細(xì)胞內(nèi)外多種刺激均可引起SGK1表達(dá)的升高。真核細(xì)胞翻譯起始因子4E(eukaryotic initiation factor-4E，eIF4E)在BCC中表達(dá)升高[18]，eIF4E能夠上調(diào)AKT蛋白的表達(dá)[19]，考慮到AKT蛋白與SGK1蛋白在基因序列上具有一致性，我們推測在BCC中eIF4E可能通過上調(diào)SGK1的表達(dá)參與了BCC的發(fā)展過程。紫外線(ultraviolet，UV)的曝曬導(dǎo)致AK和SCC中基因的表達(dá)較未受紫外線照射的皮膚明顯上調(diào)[20]。AK到SCC的發(fā)展是一個連續(xù)的過程，這一過程受紫外線曝曬的影響，而SGK1在皮膚鱗狀細(xì)胞癌中高表達(dá)[3,5,15]，這進(jìn)一步證實(shí)了 SGK1在皮膚鱗狀細(xì)胞癌中的高表達(dá)與紫外線曝曬密切相關(guān)，進(jìn)而說明SGK1在皮膚鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

本實(shí)驗(yàn)中，BCC和SCC的SGK1陽性細(xì)胞率均明顯高于正常和AK標(biāo)本，這可能是SGK1的高表達(dá)導(dǎo)致其相關(guān)蛋白轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的紊亂，進(jìn)而導(dǎo)致BCC和SCC的發(fā)病?？傊?，我們證實(shí)了SGK1在非黑素瘤皮膚癌(non-melanoma skin carcinoma，NMSC)中可能的致癌作用。受UV曝曬及其他多種因素的影響，皮膚組織中SGK1的表達(dá)升高，其高表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞代謝和功能的紊亂，進(jìn)而導(dǎo)致BCC和SCC的發(fā)病，并影響B(tài)CC和SCC的預(yù)后。