□ 李明麗

今年8月19日，在第二個(gè)“中國(guó)醫(yī)師節(jié)”到來(lái)之際，李克強(qiáng)總理作出重要批示強(qiáng)調(diào)：更好發(fā)揮廣大醫(yī)務(wù)工作者主力軍作用，努力攻克癌癥等重大疾病和更多疑難雜癥。他要求，切實(shí)擔(dān)負(fù)起人民健康守護(hù)者、健康中國(guó)推動(dòng)者、醫(yī)者仁心踐行者的重要使命，不斷增進(jìn)人民群眾健康福祉。這是新時(shí)代對(duì)廣大醫(yī)務(wù)工作者的新要求，有力地鼓舞了他們的工作斗志，增強(qiáng)了他們攻克重大疑難雜癥的信心。

身為建設(shè)“健康中國(guó)”主力軍中的一員，首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院教授陳志國(guó)也在“新要求”下備受激勵(lì)。他是神經(jīng)生物學(xué)/干細(xì)胞領(lǐng)域?qū)＜?，多年?lái)一直致力于針對(duì)重大疾病的新技術(shù)研發(fā)和臨床轉(zhuǎn)化研究工作，已經(jīng)在帕金森、脊髓損傷、腫瘤的免疫治療等方面做出了眾多突破性成果。“沒(méi)有全民健康，就沒(méi)有全面的小康”，正如我國(guó)千千萬(wàn)萬(wàn)的醫(yī)務(wù)工作者一樣，在新時(shí)代的號(hào)召下，在人們?nèi)罕娊】档男滦枨笙拢愔緡?guó)也正在醫(yī)學(xué)這條道路上，與時(shí)間競(jìng)走，與死神斗爭(zhēng)，力求能用先進(jìn)的醫(yī)療技術(shù)解決廣大患者的病痛，真正實(shí)現(xiàn)“健康中國(guó)”的目標(biāo)。

從醫(yī)為夢(mèng)，立足交叉學(xué)科研究重大疾病

位于瑞典首都斯德哥爾摩，地處波羅的海和梅拉倫湖交匯處的卡羅林斯卡學(xué)院是世界上最大最好的單一醫(yī)學(xué)院之一，也是世界醫(yī)學(xué)排名前十的醫(yī)學(xué)院。它承擔(dān)了瑞典全國(guó)43%的醫(yī)藥類(lèi)學(xué)術(shù)研究，并擁有聞名于世的負(fù)責(zé)評(píng)審和頒發(fā)諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)的諾貝爾委員會(huì)。在歷史上，人類(lèi)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域諸多革命性的突破誕生于此，包括血沉（ESR）的發(fā)現(xiàn)、伽瑪?shù)兜陌l(fā)明、線(xiàn)粒體疾病的開(kāi)創(chuàng)性研究以及前列腺素的首次發(fā)現(xiàn)等。

這所享譽(yù)世界的知名學(xué)府是很多投身醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的學(xué)子們所向往的地方，這其中當(dāng)然也包括陳志國(guó)。他從小喜歡生物，對(duì)于自然、對(duì)于生命懷抱著極大的好奇與敬畏。從考上大學(xué)以后，他就決心投身醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。1999年，大學(xué)畢業(yè)的陳志國(guó)如愿進(jìn)入卡羅林斯卡學(xué)院進(jìn)行深造，他在該學(xué)院的學(xué)習(xí)分為兩個(gè)階段，第一階段他先學(xué)習(xí)了分子醫(yī)學(xué)，主要從事端粒酶的活性及調(diào)控研究；第二階段，他系統(tǒng)地研究了免疫系統(tǒng)的不同分支對(duì)興奮性神經(jīng)毒造成的海馬損傷的影響和作用機(jī)理，并在國(guó)際上首次用滴鼻灌注法在C57BL/6小鼠上建立了興奮性神經(jīng)毒誘導(dǎo)海馬損傷的模型。

現(xiàn)有的轉(zhuǎn)基因小鼠絕大多數(shù)都是C57BL/6背景，但是腹腔注射神經(jīng)毒的方法無(wú)法造成海馬損傷。經(jīng)過(guò)幾個(gè)月的苦思冥想和不斷嘗試，陳志國(guó)和他的同事想到了嗅球是一個(gè)不受血腦屏障保護(hù)的，能夠直接和外界發(fā)生聯(lián)系的特殊中樞神經(jīng)部位，通過(guò)鼻腔滴注可能有利于富集神經(jīng)毒并減少其對(duì)外周系統(tǒng)的副作用。通過(guò)實(shí)驗(yàn)，他們發(fā)現(xiàn)，果然滴鼻灌注法能有效地造模，并在不影響血腦屏障的情況下能造成海馬的損傷。這是該領(lǐng)域第一次成功在C57BL/6小鼠上造模,這一發(fā)現(xiàn)受到了同行的認(rèn)可和好評(píng)。

在美國(guó)留學(xué)期間留影

在這一模型的基礎(chǔ)上，陳志國(guó)和他的同事又系統(tǒng)地研究了免疫系統(tǒng)的不同分支在神經(jīng)毒造成海馬損傷的過(guò)程中所起的作用。他們發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞、B細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、年齡等因素均能對(duì)海馬損傷產(chǎn)生影響，其中T細(xì)胞有加重海馬損傷的作用。經(jīng)過(guò)進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，T細(xì)胞產(chǎn)生的IL-12是一個(gè)關(guān)鍵因子：將IL-12敲除后海馬損傷減輕。由于在此之前很少有人關(guān)注免疫系統(tǒng)對(duì)神經(jīng)毒造成的海馬損傷的影響，更沒(méi)有人系統(tǒng)地研究該過(guò)程中不同的免疫分支的作用，所以陳志國(guó)和他的同事所做的研究工作對(duì)該領(lǐng)域有一定的開(kāi)拓性貢獻(xiàn)。

2004年，陳志國(guó)從卡羅林斯卡學(xué)院博士畢業(yè)后前往美國(guó)斯坦福大學(xué)從事研究工作。他深入研究了先天免疫系統(tǒng)在神經(jīng)干細(xì)胞移植過(guò)程中的作用，并發(fā)現(xiàn)了有效的藥物能夠顯著提高干細(xì)胞移植的效果；作為核心人員參加了美國(guó)國(guó)家衛(wèi)生院和加州再生醫(yī)學(xué)學(xué)院的科研項(xiàng)目，積累了豐富的科研經(jīng)驗(yàn)。

“博觀而約取，厚積而薄發(fā)”，經(jīng)過(guò)10多年的海外學(xué)習(xí)與工作積累，陳志國(guó)自2010年回國(guó)后在包括干細(xì)胞治療帕金森病、免疫細(xì)胞抗腫瘤等治療領(lǐng)域取得了一系列重要成果。他說(shuō)道：“在端粒酶方面的研究主要與腫瘤相關(guān)，后來(lái)的研究其實(shí)就是神經(jīng)系統(tǒng)與免疫系統(tǒng)的交叉研究，所以在國(guó)外的留學(xué)和工作經(jīng)歷為我回國(guó)后在這3個(gè)學(xué)科上的交叉研究打下了很好的基礎(chǔ)?！?/p>

砥志研思，推動(dòng)CAR-T技術(shù)產(chǎn)品的研發(fā)應(yīng)用

2017年，美國(guó)FDA批準(zhǔn)了兩款以B細(xì)胞表面受體CD19為靶點(diǎn)的嵌合抗原受體修飾性T細(xì)胞(CAR-T)產(chǎn)品上市，分別是Kymriah應(yīng)用于兒童和青年成人的難治/復(fù)發(fā)急性B淋巴細(xì)胞白血病(r/rBALL)和Yestacata應(yīng)用于彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤(DLBL)的治療。這兩款產(chǎn)品使用的CAR受體均是基于以小鼠來(lái)源的CD19特異性單鏈抗體可變區(qū)(scFv)構(gòu)建的。截至2019年，我國(guó)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局藥品審評(píng)中心（CDE）受理的CAR-T類(lèi)新藥申請(qǐng)也已經(jīng)達(dá)到13項(xiàng)，其中12項(xiàng)是關(guān)于以CD19分子為靶點(diǎn)，且使用小鼠來(lái)源scFv構(gòu)建的CAR修飾性T細(xì)胞生物制劑的申請(qǐng)。由此可見(jiàn)，CAR-T已經(jīng)成為免疫抗腫瘤治療領(lǐng)域中極具應(yīng)用潛力的新型細(xì)胞類(lèi)生物制劑。

雖然鼠源性CD19CAR-T在r/rB-ALL的臨床治療中表現(xiàn)出了令人振奮的臨床療效，但是隨著受試者使用數(shù)量的增加，其臨床應(yīng)用的瓶頸也日益凸顯。一方面，根據(jù)最新的研究表明，接受Kymriah治療達(dá)到完全緩解（CR）的r/rB-ALL患者中，12個(gè)月的復(fù)發(fā)率為30%～50%,另外大約10%～20%的受試者在第一次輸注鼠源性CD19CAR-T時(shí)未能達(dá)到完全緩解。對(duì)于該部分患者，尤其是CD19陽(yáng)性復(fù)發(fā)的患者，重復(fù)輸注鼠源性CD19CAR-T后的響應(yīng)率非常低。

陳志國(guó)團(tuán)隊(duì)在前期的研究也表明，接受過(guò)鼠源性C D19C A R-T治療緩解后復(fù)發(fā)的患者，接受二次輸注時(shí)鼠源CAR-T的體內(nèi)擴(kuò)增能力顯著降低，且體內(nèi)的腫瘤殺傷活性顯著降低，無(wú)法有效地降低受試者腫瘤負(fù)荷。雖然臨床前利用人源化免疫重建小鼠建立的動(dòng)物模型的研究中也觀察到二次輸注鼠源CD19CAR-T后，小鼠的CR時(shí)間顯著縮短，但是對(duì)這一現(xiàn)象產(chǎn)生的機(jī)制還尚不明確。所以，這也表明了鼠源性CD19CAR-T無(wú)法進(jìn)行重復(fù)輸注，且一旦復(fù)發(fā)，受試者可選擇的治療手段將更為有限，大大降低了受試者臨床獲益的概率。

另一方面，由于鼠源性CD19CAR的scFv區(qū)域?qū)θ梭w是一種異源性蛋白，因此，免疫原性排斥是其臨床應(yīng)用的另一個(gè)風(fēng)險(xiǎn)。雖然目前開(kāi)展的臨床試驗(yàn)中鮮有患者因輸注鼠源性CD19CAR-T發(fā)生移植物抗宿主病（GvHD）的報(bào)道，但是陳志國(guó)團(tuán)隊(duì)的前期研究表明，患者接受鼠源性CD19CAR-T后，體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生抗小鼠scFv的免疫球蛋白類(lèi)抗體，這些患者在緩解后的一定時(shí)間內(nèi)發(fā)生了CD19陽(yáng)性復(fù)發(fā)。陳志國(guó)介紹說(shuō)，免疫排斥可能是鼠源性CD19CAR-T治療緩解后導(dǎo)致CAR-T維持性降低/喪失，從而引起復(fù)發(fā)的重要原因之一。

因此，如何進(jìn)一步提高CD19CAR-T臨床療效的持久性，進(jìn)一步提高CAR-T在體內(nèi)的穩(wěn)定性，降低其被清除的可能性，是CAR-T臨床應(yīng)用中亟待解決的重要科學(xué)問(wèn)題。此外，進(jìn)一步闡明CAR-T在體內(nèi)的抗腫瘤免疫相關(guān)的藥理機(jī)制以及機(jī)體免疫系統(tǒng)、腫瘤微環(huán)境、CAR-T之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)及相關(guān)的分子調(diào)控機(jī)制，也對(duì)CAR-T產(chǎn)品的進(jìn)一步臨床應(yīng)用的推廣具有重要的科學(xué)意義。

針對(duì)這些問(wèn)題，陳志國(guó)率領(lǐng)團(tuán)隊(duì)研發(fā)了一款具有體外選擇性擴(kuò)增能力的人源化CD19CAR-T（CD19hsCAR-T）。CD19hsCAR采用人源化CD19特異性scFv作為CAR受體分子的抗原結(jié)合區(qū)，同時(shí)引入具有選擇性擴(kuò)增活性的篩選肽，一方面通過(guò)人源化scFv降低了鼠源性CD19mCAR的免疫原性，提高了CAR-T臨床應(yīng)用的安全性和重復(fù)輸注后的有效性；另一方面，利用篩選肽的選擇性活化功能,特異性地?cái)U(kuò)增CAR陽(yáng)性T細(xì)胞，提高了終產(chǎn)品CAR-T的純度，并增加了終產(chǎn)品中中央記憶型T細(xì)胞（Tcm）的比例，提高了CAR-T進(jìn)入體內(nèi)之后抗腫瘤活性和持久性，延長(zhǎng)其臨床療效。

目前，在北京市老年病醫(yī)療研究中心專(zhuān)項(xiàng)經(jīng)費(fèi)的資助下，陳志國(guó)團(tuán)隊(duì)已經(jīng)完成了臨床前研發(fā)及I期臨床試驗(yàn)。臨床前研究結(jié)果顯示，CD19hsCAR對(duì)人CD19的親和力比已上市的鼠源性CD19mCAR（Kymriah）高6倍，其體外殺傷活性和體內(nèi)抗腫瘤活性也顯著優(yōu)于CD19mCAR-T。此外，團(tuán)隊(duì)通過(guò)進(jìn)一步研究表明,體外的特異性活化可以提高CD19hsCAR-T終產(chǎn)品中Tcm的比例,有可能進(jìn)一步改善CAR-T進(jìn)入體內(nèi)的維持性。陳志國(guó)團(tuán)隊(duì)和道培醫(yī)院合作，對(duì)5名接受過(guò)鼠源CD19CAR-T治療后又復(fù)發(fā)的白血病人進(jìn)行了CD19hsCAR-T的治療，其中4名（80%）在治療后達(dá)到了分子層面的完全緩解。

近期，陳志國(guó)團(tuán)隊(duì)繼續(xù)以接受鼠源性CD19mCAR-T治療后復(fù)發(fā)/抵抗的r/rB-ALL受試者為研究對(duì)象，與首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京市兒童醫(yī)院血液腫瘤科和首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院血液科合作，開(kāi)展了Ⅱ期臨床研究，進(jìn)一步評(píng)價(jià)CD19hsCAR-T對(duì)治療CD19mCAR-T復(fù)發(fā)/抵抗患者的臨床有效性和安全性。他們將利用多種臨床樣本，結(jié)合單細(xì)胞測(cè)序，全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序以及多種基礎(chǔ)檢測(cè)技術(shù)，進(jìn)一步研究和揭示機(jī)體免疫系統(tǒng)、腫瘤微環(huán)境、CAR-T三者之間的相互作用及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，一方面要闡明機(jī)體對(duì)鼠源性CD19mCAR-T可能的免疫監(jiān)控和排斥機(jī)制；另一方面要研究腫瘤微環(huán)境和CAR-T治療后復(fù)發(fā)過(guò)程中腫瘤細(xì)胞與CAR-T的相互作用，為CAR-T技術(shù)產(chǎn)品更有效地應(yīng)用于臨床抗腫瘤治療提供更多的科學(xué)基礎(chǔ)和全新的解決思路。

創(chuàng)新為重，探索帕金森病的治療方法

作為中老年“三大殺手”之一的帕金森病是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)退行性疾病，其發(fā)病的根本原因是中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的死亡引起其分泌的神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺減少，進(jìn)而導(dǎo)致病人出現(xiàn)靜止性震顫、運(yùn)動(dòng)遲緩、肌強(qiáng)直、姿勢(shì)步態(tài)異常等運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)癥狀和焦慮、抑郁、睡眠障礙等非運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)癥狀。2015年數(shù)據(jù)顯示，全球有450萬(wàn)帕金森患者，220萬(wàn)名患者在中國(guó)，且中國(guó)每年新發(fā)病例近10萬(wàn)人。至今，該病的發(fā)病原因還不清楚，臨床上采用的藥物和手術(shù)治療手段雖然能從一定程度上改善癥狀，但不能根治此病，也不能阻止病情的進(jìn)展。所以，探索出治療帕金森病的有效方法在中國(guó)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，甚至在國(guó)際醫(yī)學(xué)領(lǐng)域都顯得尤為迫切。

當(dāng)前，帕金森病可以從兩個(gè)方面進(jìn)行干預(yù)：一是注入神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，改變?nèi)源婊罴?xì)胞的微環(huán)境，從而達(dá)到減緩疾病發(fā)展的效果；二是在紋狀體植入多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞，當(dāng)植入細(xì)胞整合到紋狀體的神經(jīng)回路中后可以增加多巴胺的釋放。在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的各種神經(jīng)因子中，膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（GDNF）是對(duì)多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)作用最為顯著的。21世紀(jì)初曾進(jìn)行過(guò)3次臨床試驗(yàn)，將GDNF重組蛋白通過(guò)植入泵泵入病人的腦內(nèi)，但整體試驗(yàn)效果沒(méi)有達(dá)到預(yù)期。分析其中一個(gè)可能原因是通過(guò)泵入的方式達(dá)不到理想的濃度分布。

在舊金山參加學(xué)術(shù)交流時(shí)留影

于是，陳志國(guó)團(tuán)隊(duì)設(shè)想能否通過(guò)自體的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）作為GDNF的表達(dá)載體并通過(guò)植入多個(gè)位點(diǎn)的方式使得GDNF能夠較均勻持久地表達(dá)。“因?yàn)槭亲泽w的MSC，所以不存在免疫排斥的問(wèn)題，MSC本身也可以分泌一定的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，用其作為載體具有一定優(yōu)勢(shì)?！眻F(tuán)隊(duì)將6只食蟹猴的自體的MSC在體外培養(yǎng)并轉(zhuǎn)入表達(dá)GDNF的慢病毒，然后單側(cè)移植回同一只猴腦內(nèi)并進(jìn)行造模，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MSC-GDNF能夠改善相應(yīng)側(cè)的動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)功能，同時(shí)移植側(cè)的影像學(xué)數(shù)據(jù)和多巴胺分泌的生化數(shù)據(jù)都得到了顯著的提高。

由于多巴胺能神經(jīng)元是帕金森病人中腦部位受損的神經(jīng)細(xì)胞，所以業(yè)界普遍認(rèn)為鑒于這種局域性的病理特征，細(xì)胞替代療法是一種非常有希望的治療方案。而皮膚細(xì)胞在臨床上較為容易獲得，陳志國(guó)想到，如果能直接將病人的皮膚細(xì)胞變成這種受損的多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞，將會(huì)對(duì)帕金森氏病的發(fā)病機(jī)制研究有巨大的幫助。對(duì)此，陳志國(guó)團(tuán)隊(duì)和合作者嘗試?yán)?種轉(zhuǎn)錄因子，成功地將皮膚細(xì)胞誘導(dǎo)成有功能的、成熟的多巴胺能神經(jīng)元。在此基礎(chǔ)上，他們進(jìn)行了因子的優(yōu)化，最終得到一個(gè)4因子的組合和一個(gè)5因子的組合，都能夠較高效地誘導(dǎo)多巴胺能神經(jīng)元。

從皮膚細(xì)胞轉(zhuǎn)化成的多巴胺能神經(jīng)元可以用來(lái)在體外模擬帕金森病并進(jìn)行藥物篩選，然而成熟的神經(jīng)細(xì)胞無(wú)法在移植后存活，所以陳志國(guó)團(tuán)隊(duì)和合作者同時(shí)也嘗試了另一種途徑，即將皮膚細(xì)胞先轉(zhuǎn)化成具有向多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞分化的潛能的神經(jīng)干細(xì)胞。通過(guò)轉(zhuǎn)入8個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，他們成功地做到了這一點(diǎn)。從皮膚細(xì)胞誘導(dǎo)來(lái)的神經(jīng)干細(xì)胞可以有效地分化成多巴胺能神經(jīng)元，更重要的是，這種誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞可以在移植到成年小鼠腦內(nèi)后很好地存活并分化。

基于這些研究基礎(chǔ)，2014年陳志國(guó)承擔(dān)了國(guó)家自然科學(xué)基金優(yōu)秀青年科學(xué)基金項(xiàng)目“帕金森病的細(xì)胞治療”。團(tuán)隊(duì)通過(guò)從食蟹猴的骨髓間充質(zhì)細(xì)胞中誘導(dǎo)出（誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞）iPSCs和（誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞）iNSCs，以較高效率分化為（多巴胺）DA前體細(xì)胞后移植到自體和異體的帕金森模型猴中，比較其治療效果，明確了重編程來(lái)源的DA前體細(xì)胞自體和異體移植治療帕金森病的安全性和有效性。他們嘗試解決領(lǐng)域內(nèi)已經(jīng)進(jìn)行的兩次雙盲臨床實(shí)驗(yàn)中遇到的問(wèn)題，即植入細(xì)胞的異質(zhì)性和免疫排斥問(wèn)題。這為最終找到一種較為持久有效且副作用小的治療方法起到了推動(dòng)作用。目前，陳志國(guó)團(tuán)隊(duì)已經(jīng)完成了人源iNSC分化為多巴胺能神經(jīng)前體細(xì)胞治療帕金森病的臨床前驗(yàn)證工作，正在積極推動(dòng)自體iNSC-DA前體細(xì)胞治療帕金森病的臨床研究。

人體最復(fù)雜的兩個(gè)系統(tǒng)就是免疫系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)，立足于這兩個(gè)領(lǐng)域，陳志國(guó)的科研之路注定要困難重重。如今，免疫學(xué)發(fā)展日新月異，神經(jīng)學(xué)又相對(duì)有很多空白，一定意義上來(lái)說(shuō)在這兩個(gè)領(lǐng)域的交叉研究更是難上加難。不過(guò)在他看來(lái)，醫(yī)學(xué)領(lǐng)域本身就一個(gè)要經(jīng)受各種打擊的研究領(lǐng)域，面對(duì)問(wèn)題，他要做的只有保持對(duì)工作的極大熱情，永不言棄，切實(shí)擔(dān)負(fù)起人民健康守護(hù)者、“健康中國(guó)”推動(dòng)者、醫(yī)者仁心踐行者的重要使命。