孫銘，王思琪，艾爾肯·達吾提，毛培勝*

(1.中國農(nóng)業(yè)大學草業(yè)科學系，草業(yè)科學北京市重點實驗室，北京 100193；2.新疆草原總站，新疆 烏魯木齊 830049)

種子是植物遺傳資源保存和種質(zhì)創(chuàng)新的基礎[1]。種子在生理成熟后干燥的狀態(tài)下可維持較長時間的活力，但即使在良好的人為管理條件下貯藏也不可避免地要經(jīng)歷老化過程，在該過程中種子生存和萌發(fā)必需的成分被逐漸破壞，使其活力逐漸喪失并最終死亡[2-4]，因此種子老化的研究顯得尤為重要。種子在老化過程中會造成膜系統(tǒng)受損，酶活性普遍降低，遺傳物質(zhì)完整性下降，萌發(fā)及生長減緩，發(fā)芽能力喪失等現(xiàn)象，表現(xiàn)為發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)降低，幼芽和幼根生長受到抑制[5-6]。目前認為活性氧(reactive oxygen species，ROS)產(chǎn)生與消耗失衡是造成種子老化的關鍵[7]，因此ROS清除劑的研究對種子的老化修復尤為重要。

抗氧化劑是維持種子生命力的重要活性物質(zhì)，添加適當?shù)耐庠纯寡趸瘎?，可以與種子內(nèi)部的活性物質(zhì)共同完成ROS的清除，進而延緩或者修復種子的損傷[7]。抗壞血酸(ascorbic acid，AsA)和谷胱甘肽(glutathione，GSH)是抗壞血酸谷胱甘肽循環(huán)中兩種重要的抗氧化物質(zhì)，褪黑素(melatonin，MT)則是目前已知的清除能力最強的自由基清除劑[8]，它們在清除植物體內(nèi)過量的ROS方面具有重要的作用。目前，這些抗氧化劑在種子生理方面已經(jīng)有初步研究，主要集中在正常種子萌發(fā)及其抗逆生理方面。通過AsA處理鹽[9-10]、重金屬[11]、低溫[12]和高溫[13]等脅迫下的種子，發(fā)現(xiàn)AsA可以緩解脅迫對種子萌發(fā)及幼苗生長的抑制作用；MT同樣對鹽脅迫[14]、高溫處理[15]等種子的萌發(fā)具有促進作用。相比而言，利用GSH外源添加研究種子生理的較少，如其對種子膜脂過氧化程度的影響[16]和重金屬離子毒害的緩解[17]等。但在抗氧化劑的研究上，尤其是通過引發(fā)技術對種子老化及活力修復的研究較少。然而引發(fā)處理被認為是提高種子活力的有效手段，可以改善種苗的整齊度和出苗率，并增加種子和種苗的抗逆性[18]。本試驗以無芒雀麥(Bromusinermis)種子為材料，利用AsA、GSH和MT溶液進行引發(fā)處理，探討其對老化種子的發(fā)芽、幼苗生長及抗氧化酶活性的影響，以期為緩解種子的老化提供理論參考，對草牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試的無芒雀麥種子由中國農(nóng)業(yè)大學牧草種子實驗室提供，2016年秋季收獲于河北省承德市國營魚兒山牧場，試驗于2017年5-12月進行。種子基本信息見表1。

表1 無芒雀麥種子基本信息Table 1 Basic information of smooth bromegrass seeds (%)

參照國際種子檢驗協(xié)會種子檢驗規(guī)程(International Seed Testing Association，ISTA，2016)[19]測定種子含水量。稱取潔凈的無芒雀麥種子約4.5 g放入樣品盒后稱重(精確到0.001 g)，設置2次重復。將樣品放于烘箱中在130～133 ℃下烘干1 h，然后蓋好樣品盒蓋在干燥器中冷卻45 min后稱重。種子含水量計算公式為：種子含水量(%)=(M2-M3)/(M2-M1)×100%，式中：M1為樣品盒和蓋的重量(g)，M2為樣品盒、蓋及樣品的烘干前重量(g)，M3為樣品盒、蓋及樣品的烘干后重量(g)。

供試種子的初始含水量為10.6%，目標含水量為10.0%，需將其含水量調(diào)低。首先稱取一定量的種子W0，計算出目標含水量時種子的質(zhì)量，計算公式為：目標含水量時種子的質(zhì)量(g)=[(100-MC0)/(100-MCr)]×W0，式中MC0為初始含水量(%)，MCr為需達到的含水量(%)，W0為初始種子質(zhì)量(g)。將這些種子置于0.075 mm篩中室溫干燥，并頻繁稱量其重量，達到目標含水量時立即將種子密封于鋁箔袋中。

將調(diào)整好含水量的無芒雀麥種子3 g密封于10.0 cm×14.8 cm的鋁箔袋中，在45 ℃恒溫水浴箱內(nèi)進行老化處理16 d，然后將種子恢復至室溫后存放于4 ℃冰箱內(nèi)備用，每個處理4次重復。

1.2 試驗方法

1.2.1老化后抗氧化劑引發(fā)處理 將老化的無芒雀麥種子分別浸入AsA溶液(2 mmol·L-1)、GSH溶液(0.25 mmol·L-1)、MT溶液(100 μmol·L-1)以及蒸餾水(WT)中，在4 ℃冰箱中引發(fā)2 h，每個處理重復4次。引發(fā)后用蒸餾水沖洗3次，并用濾紙將種子表面的水分擦干，在室溫下晾至含水量10.0%時的重量后封入鋁箔袋中存放于4 ℃冰箱中備用。以老化后未引發(fā)的無芒雀麥種子(含水量為10.0%)作為對照(CK)。

1.2.2種子發(fā)芽和幼苗生長指標測定 參照國際種子檢驗協(xié)會種子檢驗規(guī)程(2016)[19]，選取均勻飽滿一致的無芒雀麥種子100粒，將其置于內(nèi)部墊有3層濾紙的11.5 cm×11.5 cm的培養(yǎng)皿中，設4次重復。培養(yǎng)皿放于光照培養(yǎng)箱(GXZ-380B-LED，寧波江南儀器廠)中在15/25 ℃變溫，光照8 h和黑暗16 h條件下培養(yǎng)，光照強度為66%。每24 h統(tǒng)計種子發(fā)芽情況，以胚根突破種皮2 mm為標準，計算平均發(fā)芽時間；以正常種苗作為種子發(fā)芽標準，第7天初次計數(shù)，第14天末次計數(shù)，計算發(fā)芽勢和發(fā)芽率。待第14天發(fā)芽結束后，從中隨機取10株正常種苗測量幼苗長和根長，并對這10株種苗進行稱重。計算發(fā)芽勢、發(fā)芽率、幼苗長、根長、苗重、平均發(fā)芽時間、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)。具體計算方法如下：

發(fā)芽勢(%)=發(fā)芽初次計數(shù)的正常種苗數(shù)/供試種子數(shù)

發(fā)芽率(%)=發(fā)芽終期全部正常種苗數(shù)/供試種子數(shù)

平均發(fā)芽時間=∑nt/∑n

式中：n為在時間t時，新萌發(fā)的種子數(shù)，t為發(fā)芽時間。

發(fā)芽指數(shù)=∑(Gt/Dt)

式中：Gt為第t天的發(fā)芽數(shù)，Dt為發(fā)芽天數(shù)(d)。

活力指數(shù)=∑(Gt/Dt)×WF

式中：WF為苗重(g)。

1.2.3酶活性測定 選取0.1 g無芒雀麥種子，加入6 mL預冷的50 mmol·L-1pH 7.0的磷酸緩沖液(含0.1 mmol·L-1EDTA和1% pvp)和少量石英砂置于預冷的研缽中研磨至勻漿，然后將勻漿倒入離心管中混勻。所得勻漿在4 ℃ 8000 r·min-1下離心10 min，上清液為粗酶提取液。將粗酶液分裝進行超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過氧化物酶(peroxidase，POD)和過氧化氫酶(catalase，CAT)活性的測定。采用氮藍四唑(nitroblue tetrazolium，NBT)法測定SOD活性[20]；采用愈創(chuàng)木酚顯色法測定POD活性[21]；采用紫外吸收法測定CAT活性[22]。采用考馬斯亮藍法測定蛋白含量，試劑盒購自蘇州科銘生物技術有限公司。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 22.0對老化種子的發(fā)芽、幼苗生長和酶活性指標進行方差分析，并在GraphPad Prism 7軟件中作圖。在PAST 3.15軟件[23]中對5組試驗(AsA、GSH、MT、WT和CK)測定的4個種子發(fā)芽指標(發(fā)芽率、發(fā)芽勢、平均發(fā)芽時間和發(fā)芽指數(shù))和4個幼苗生長指標(葉長、根長、幼苗重和活力指數(shù))進行了歐式距離計算和基于非加權組平均法(unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA)的聚類分析，采用bootstrap重復1000次。對4組引發(fā)處理(AsA、GSH、MT和WT)的8個發(fā)芽和幼苗生長指標進行主成分分析，以特征值大于1提取主成分。

2 結果與分析

2.1 抗氧化劑引發(fā)對老化種子發(fā)芽的影響

圖1 抗氧化劑引發(fā)對無芒雀麥老化種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢的影響Fig.1 Effects of different antioxidants priming on germination percentage and germination potential of aged seeds of smooth bromegrass 同一指標中不同小寫字母代表處理間差異顯著(P<0.05)，下同。Means designated by different lowercase letters indicate different significantly between treatments at 0.05 level, the same below.

圖2 抗氧化劑引發(fā)對無芒雀麥老化種子平均發(fā)芽時間、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)的影響Fig.2 Effects of different antioxidants priming on mean germination time, germination index and vigor index of smooth bromegrass aged seeds

無芒雀麥老化種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢分別為67%和23%，說明老化處理后種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢均有所降低，而且發(fā)芽勢降低程度遠大于發(fā)芽率(圖1)。經(jīng)過水和抗氧化劑引發(fā)后，無芒雀麥種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)均高于CK，平均發(fā)芽時間短于CK(圖1和圖2)。與CK相比，發(fā)芽率在水引發(fā)處理(WT)下提升了8.00%，但未達到顯著水平(P>0.05)；在各抗氧化劑處理下則均有顯著提升(P<0.05)，平均提升15.17%，其中GSH提升效果最佳為17.00%，為水引發(fā)提升效果的兩倍多。經(jīng)過引發(fā)的種子與CK相比，發(fā)芽勢的提升效果比發(fā)芽率更好。經(jīng)過引發(fā)(WT、AsA、GSH和MT)后發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)均顯著提升(P<0.05)，分別平均提升41.75%和14.36%(圖1和圖2)。雖然各引發(fā)處理之間沒有顯著差異(P>0.05)，但抗氧化劑引發(fā)的效果均比水引發(fā)好，其中GSH引發(fā)對發(fā)芽勢提升效果最好(44.50%)，而AsA對發(fā)芽指數(shù)的提升效果最好(16.10%)。抗氧化劑引發(fā)處理后種子活力指數(shù)也顯著(P<0.05)高于CK和水引發(fā)處理，且AsA引發(fā)處理的活力指數(shù)顯著(P<0.05)高于MT引發(fā)，但GSH引發(fā)處理與AsA和MT引發(fā)處理之間沒有顯著差異(P>0.05，圖2)。此外，經(jīng)過引發(fā)處理后，老化種子的平均發(fā)芽時間與CK相比均有顯著的縮短(P<0.05)，但引發(fā)處理之間沒有顯著差異(P>0.05)?？寡趸瘎┮l(fā)后老化種子第7天的發(fā)芽率高于水引發(fā)處理，而達到50%發(fā)芽率所需時間比水引發(fā)稍長(圖1和圖2)，說明抗氧化劑對老化種子的生理效應需要一定的作用時間。

2.2 抗氧化劑引發(fā)對無芒雀麥幼苗生長的影響

圖3 抗氧化劑引發(fā)對無芒雀麥老化種子幼苗生長的影響Fig.3 Effects of different antioxidants priming on seedling growth characteristics of smooth bromegrass aged seeds

無芒雀麥老化種子的幼苗生長測定結果表明(圖3)，經(jīng)WT、AsA、GSH和MT引發(fā)后，無芒雀麥種苗的葉片和根均顯著(P<0.05)長于CK，幼苗重量也顯著(P<0.05)高于CK。與WT處理相比，葉長在抗氧化劑引發(fā)下平均提高了7.70%，但僅GSH處理具有顯著差異(P<0.05)，其余各抗氧化劑處理之間差異不顯著(P>0.05)；根長在抗氧化劑引發(fā)處理下同樣有所提升，平均提升15.36%，GSH引發(fā)處理的提升效果最佳為20.09%，顯著(P<0.05)高于WT和AsA處理；苗重經(jīng)抗氧化劑引發(fā)處理后均顯著高于WT處理，在3種抗氧化劑中提升效果最佳的為AsA處理，提升32.11%，其次為MT和GSH處理(圖3)。

2.3 抗氧化劑引發(fā)對無芒雀麥老化種子酶活性的影響

經(jīng)過抗氧化劑引發(fā)處理后，無芒雀麥老化種子抗氧化酶的活性變化呈現(xiàn)出不同的變化規(guī)律(圖4)。引發(fā)后老化種子的SOD活性降低，且只有GSH引發(fā)后SOD活性顯著(P<0.05)下降，其余各處理(WT、AsA和MT)之間及其與CK之間均無顯著差異(P>0.05)，表明GSH引發(fā)顯著(P<0.05)降低老化種子的SOD活性。POD活性在抗氧化劑引發(fā)處理后與CK和WT處理相比均顯著(P<0.05)升高，但MT、AsA和GSH引發(fā)處理之間沒有顯著(P>0.05)差異。此外，用AsA和GSH引發(fā)后老化種子的CAT活性與CK和WT相比顯著(P<0.05)升高，而且AsA、GSH和MT引發(fā)處理間CAT活性差異顯著(P<0.05)，且MT引發(fā)處理CAT酶活性最低。

圖4 抗氧化劑引發(fā)對無芒雀麥老化種子酶活性的影響Fig.4 Effects of different antioxidants priming on antioxidase activity in smooth bromegrass aged seeds

2.4 聚類和主成分分析

各試驗組之間的歐氏距離范圍介于4.74～51.79，平均值為23.70，其中GSH和MT之間的距離最小，GSH和CK之間的距離最大，說明GSH對老化種子的生理影響最大，而與MT的作用相當(表2)。聚類分析結果顯示(圖5)，在閾值為23.78處被分為兩組，CK(Cluster Ⅰ)和引發(fā)處理(Cluster Ⅱ & Ⅲ)，而且可以看出水引發(fā)(Cluster Ⅱ)和抗氧化劑引發(fā)(Cluster Ⅲ)也可以明顯的分開，并且具有較高的自展支持率(100%)。

表2 基于種子發(fā)芽和幼苗生長指標的歐氏距離分析Table 2 Euclidean distance of control and 4 treatments based on 8 indexes of seed germination and seedling growth

圖5 基于種子發(fā)芽和幼苗生長指標的聚類分析Fig.5 Dendiagram of the control and 4 treatments revealed by UPGMA cluster analysis of Euclidean distance based on 8 indexes

主成分分析發(fā)現(xiàn)(表3)，特征值大于1的只有主成分1為3.9968，其貢獻率高達99.92%，說明主成分1能代表8個指標幾乎所有的信息，對其影響最大的指標是發(fā)芽率和發(fā)芽勢。由此可見，發(fā)芽勢和發(fā)芽率在諸多指標中可以更好地反映不同抗氧化劑引發(fā)對老化種子作用的差異。

3 討論

種子內(nèi)的ROS積累與清除之間動態(tài)的失衡是種子老化的主要因素，其中ROS的清除主要通過增強抗氧化物酶活性和增加非酶促抗氧化劑的含量來實現(xiàn)[7]。CAT、POD和SOD是植物抗氧化酶體系中非常重要的3種防御酶類，其中SOD被認為是植物細胞清除ROS的第一道防線，主要催化O2-的歧化反應生成H2O2和O2；CAT可以高效催化H2O2轉化為H2O和O2，該途徑為種子中H2O2清除的重要途徑；POD則是以H2O2為電子受體催化底物氧化的酶。此外，AsA、GSH和MT等抗氧化劑均不同程度地參與了自由基攻擊的防御，其中AsA和GSH不僅可以單獨與ROS反應，還可以間接通過AsA-GSH循環(huán)來清除自由基。因此，這些酶和抗氧化劑在種子活力研究中扮演著非常重要的角色，往往高活力的種子具有相對較高的SOD、CAT、POD活性，而與之相伴的是較高的種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢、活力指數(shù)和抗逆性等[24]。這樣的結果在非生物脅迫或外源處理正常種子中普遍存在，但利用抗氧化劑引發(fā)處理老化種子的研究報道幾乎很少。

表3 不同引發(fā)處理后種子發(fā)芽和幼苗生長相關指標的主成分分析Table 3 Principal component analysis of 8 indexes related to seed germination and seedling growth after priming treatments

本研究通過抗氧化劑AsA、GSH和MT引發(fā)試驗來探討抗氧化劑、抗氧化物酶以及老化種子發(fā)芽和幼苗生長之間的關系。供試的無芒雀麥種子在10%含水量45 ℃條件下老化16 d后種子的發(fā)芽率達到66%，說明該種子批的活力已經(jīng)處于中等水平，而燕麥(Avenasativa)種子在同等條件下老化16 d后其活力仍然處于相對較高的水平，且以往研究發(fā)現(xiàn)籽粒小的種質(zhì)更耐老化[25]，這可能與種子收獲條件和物種自身抗氧化機制差異有關。王彥榮等[26]利用聚乙二醇對紫花苜蓿(Medicagosativa)和沙打旺(Astragalusadsurgens)種子進行引發(fā)，發(fā)現(xiàn)其對中等質(zhì)量的種子具有更好的引發(fā)作用。本試驗利用水、AsA、GSH和MT對老化的無芒雀麥種子進行引發(fā)，發(fā)現(xiàn)水對無芒雀麥老化種子的發(fā)芽有明顯的促進作用，但種子發(fā)芽率顯示水引發(fā)修復后種子仍然處于中等活力，而經(jīng)過抗氧化劑引發(fā)處理的老化種子發(fā)芽率均達到高活力水平(發(fā)芽率≥80%)，說明抗氧化劑對老化種子修復作用的水平更高。Brilhante等[27]研究人工加速老化的豇豆(Vignaunguiculata)種子發(fā)現(xiàn)，AsA直接處理能減輕電解質(zhì)滲透率和脂質(zhì)過氧化程度，并增加種子的發(fā)芽率，而老化前用AsA處理則不能。但Yan等[28]發(fā)現(xiàn)利用適宜濃度的AsA提前引發(fā)也可以減小種子在老化過程中發(fā)芽率的降低。Tommasi等[29]發(fā)現(xiàn)在老化的種子中GSH的含量發(fā)生下降，而Draganic等[30]外源添加GSH后老化種子的發(fā)芽率提升。MT在種子老化方面的研究幾乎很少，但其對鹽脅迫和高溫脅迫下種子的發(fā)芽率有明顯提升[14]。一般認為，水分引發(fā)主要是通過種子緩慢吸水，使損傷的細胞膜有充分時間進行修復和重組，降低種子內(nèi)有機物質(zhì)的外滲來提高種子活力[31]。抗氧化劑引發(fā)效果更佳可能是抗氧化劑如AsA、GSH和MT等在細胞膜被修復前浸入被損傷的細胞內(nèi)部，參與了種子內(nèi)部的代謝活動，與種子自身的修復系統(tǒng)共同對ROS造成的損傷進行修復，并促進了種子的萌發(fā)[7]。以往的研究還發(fā)現(xiàn)AsA能夠調(diào)節(jié)種子萌發(fā)過程中脫落酸(abscisic acid，ABA)和赤霉素(gibberellin，GA)的拮抗作用，進而提高發(fā)芽率[32]。本研究中分析的CAT和POD的活性在抗氧化劑的作用下基本都有顯著的提升，這與老化處理或脅迫處理下抗氧化劑對老芒麥(Elymussibiricus)[28]、黃瓜(Cucumissativus)[14]和榆樹(Ulmuspumila)[33]等的影響基本一致。SOD的活性在引發(fā)后并沒有得到提升，反而有所降低，與老芒麥[28]和黃瓜[14]的研究結果不同，這可能與無芒雀麥種子老化的過程中積累的ROS種類有關，比如SOD主要參與清除的ROS(如O2-)沒有過度積累，而是一些其他的ROS(如H2O2等)積累造成了無芒雀麥種子的老化損傷，使得抗氧化劑引發(fā)沒能引起SOD活性的升高，但這種推測還需要在以后試驗中通過測定ROS的產(chǎn)生來進一步驗證。綜合以往的研究和本研究的結果，抗氧化劑對種子修復和促進發(fā)芽的活動可能主要包括細胞膜系統(tǒng)的修復，胚根的突出，抗氧化相關酶活性的改變以及內(nèi)源激素的調(diào)節(jié)[18]，而且抗氧化劑對種子的修復過程遠比水分對種子的修復復雜，需要更長時間才能達到比水引發(fā)更好地效果。此外，抗氧化劑處理的無芒雀麥老化種子發(fā)芽后，還表現(xiàn)出比水引發(fā)更長的幼苗、根長以及更高的幼苗重，說明抗氧化劑在促進發(fā)芽后，還活化了水解酶，動員了種子貯藏組織中貯藏物質(zhì)的水解，為幼苗生長提供營養(yǎng)。

種子發(fā)芽和幼苗生長相關指標是衡量不同狀態(tài)下種子活力情況的直觀表現(xiàn)。通過對不同試驗組進行聚類，發(fā)現(xiàn)可以將抗氧化劑引發(fā)和未使用抗氧化劑的試驗區(qū)分開來，說明在發(fā)芽和幼苗生長情況方面抗氧化劑整體作用明顯。其中GSH引發(fā)與未引發(fā)的種子之間歐氏距離最大，與MT引發(fā)的種子之間的距離最近，說明GSH引發(fā)對無芒雀麥老化種子的作用在4種引發(fā)處理中最有效果，而與MT引發(fā)處理在發(fā)芽和幼苗生長情況方面差異不大。此外，主成分分析結果顯示，發(fā)芽率和發(fā)芽勢在諸多指標中可以更好地反映引發(fā)劑引發(fā)對老化種子在發(fā)芽和幼苗生長上的響應。

4 結論

綜上所述，適宜濃度的AsA、GSH和MT溶液引發(fā)對無芒雀麥老化種子的發(fā)芽和幼苗的生長具有明顯的促進作用，表現(xiàn)為提升了老化種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)，縮短了平均發(fā)芽時間，并增加了幼苗的重量以及根長和葉長，其中GSH溶液引發(fā)的整體效果最佳。3種抗氧化劑在引發(fā)處理中的作用不盡相同，它們都顯著提高了老化種子的活力指數(shù)、苗重和POD活性(P<0.05)，其中AsA和GSH還顯著提高了CAT活性(P<0.05)，而且GSH還顯著提高了根長(P<0.05)。此外，3種抗氧化劑對老化種子中SOD的活性均沒有顯著影響(P>0.05)。說明不同的抗氧化劑在修復老化種子時，對抗氧化酶的作用具有選擇性，可能與不同物種或老化條件下產(chǎn)生的ROS種類有關。而且抗氧化劑引發(fā)對老化種子修復的可能更為復雜，需要較長的時間來達到更好的作用效果。