張珊珊 康洪梅 楊文忠

(云南省林業(yè)科學(xué)院，云南省森林植物培育與開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/國家林業(yè)局云南珍稀瀕特森林植物保護(hù)和繁育國家林業(yè)局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650201)

云南藍(lán)果樹是典型的極小種群野生植物[1]。目前，對(duì)云南藍(lán)果樹開展了一系列的瀕危機(jī)理研究，在系統(tǒng)分類、形態(tài)修訂、種子萌發(fā)特性、抗逆生理及生殖生物學(xué)等方面做了大量研究工作[2～6]，探索并實(shí)踐了云南藍(lán)果樹就地保護(hù)、近地保護(hù)、遷地保護(hù)、種苗繁育和回歸引種等系列的保護(hù)措施[7～8]。然而，這些實(shí)踐究竟保護(hù)了多少遺傳資源，基于遺傳管理的保護(hù)措施是否科學(xué)有效是目前亟需解決的問題。要想解決這個(gè)問題，首先要弄清楚云南藍(lán)果樹野生植株的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)如何。

群體遺傳學(xué)是研究群體的遺傳結(jié)構(gòu)及其變化規(guī)律的遺傳學(xué)分支學(xué)科[9]。在群體遺傳學(xué)的研究中，遺傳多樣性的高低是一個(gè)重要的指標(biāo)，反映了物種應(yīng)對(duì)棲息地變化的適應(yīng)性和改變能力，而遺傳多樣性在群體間的分布，即遺傳結(jié)構(gòu)是受許多因素作用的，另外還與物種自身的生物學(xué)特征和進(jìn)化史有著密切關(guān)系[10～11]。因此，我們?cè)诒Ｗo(hù)遺傳資源時(shí)需要先了解居群的遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳背景，進(jìn)而再制定合理的保護(hù)政策[12～14]。

目前最先進(jìn)的第二代DNA測(cè)序技術(shù)可通過產(chǎn)生大量的分子標(biāo)記數(shù)據(jù)進(jìn)行成株的群體遺傳多樣性分析，建立詳細(xì)的遺傳檔案[15]?；诿盖械暮?jiǎn)化基因組測(cè)序(RAD-Seq，Restriction-site Associated DNA Sequence)是對(duì)與限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)相關(guān)的DNA進(jìn)行高通量測(cè)序，可大幅降低基因組的復(fù)雜度，降低建庫和測(cè)序成本，操作簡(jiǎn)便，同時(shí)不受參考基因組的限制，可快速鑒定出高密度的SNP位點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)遺傳進(jìn)化分析及重要性狀候選基因的預(yù)測(cè)[15～17]。RAD-Seq可以檢測(cè)基因組上未知變異點(diǎn)中新的SNP，發(fā)掘新的和稀有的變異，對(duì)解決群體遺傳學(xué)[18]、遺傳圖譜構(gòu)建[19]、功能基因挖掘[20]、群體進(jìn)化[21]等問題，具有重大的科研和產(chǎn)業(yè)價(jià)值。

因此，本研究采用基于二代測(cè)序技術(shù)的RAD-seq方法對(duì)云南藍(lán)果樹開展成株的群體遺傳分析，為每個(gè)成株建立詳細(xì)的遺傳檔案，用SNP位點(diǎn)刻畫其遺傳特征，完成系統(tǒng)進(jìn)化樹、群體結(jié)構(gòu)、PCA分析，從基因組水平揭示不同個(gè)體之間的遺傳分化關(guān)系，進(jìn)而為遺傳資源的保護(hù)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

對(duì)云南藍(lán)果樹分布區(qū)域現(xiàn)有的24個(gè)天然植株進(jìn)行野外取樣，在詳細(xì)記錄植株編號(hào)的同時(shí)，采集新鮮嫩葉利用液氮快速冷凍并拍照，帶回實(shí)驗(yàn)室放入-85℃冰箱備用。

1.2 DNA提取與質(zhì)量控制

采用Sigma試劑盒提取云南藍(lán)果樹的基因組DNA。用1%瓊脂糖電泳和分光光度計(jì)Nano Drop 2000C(Thermo Scientific，USA)檢測(cè)所提樣品的DNA質(zhì)量,以保證提取的DNA光吸收值A(chǔ)260/280介于1.7～2.1、樣品濃度>30 μg·L-1、單個(gè)樣品總量>1 μg。

1.3 文庫構(gòu)建

文庫構(gòu)建方法流程如下：(1)稀釋基因組DNA樣品；(2)根據(jù)選定的酶切方案(EcoRⅠ)，對(duì)檢測(cè)合格的各樣品基因組DNA分別配制酶切反應(yīng)體系，在Thermomixer上適溫反應(yīng)一定時(shí)間酶切基因組DNA；(3)配制P1 index adapter連接反應(yīng)體系，在Thermomixer中適溫反應(yīng)一定時(shí)間使P1 index adapter與酶切產(chǎn)物連接；(4)將P1連接產(chǎn)物按照適當(dāng)?shù)谋壤M(jìn)行pooling；(5)配制打斷體系，使用打斷儀對(duì)pooling產(chǎn)物進(jìn)行打斷，再使用試劑盒對(duì)打斷產(chǎn)物進(jìn)行純化；(6)用瓊脂凝膠電泳對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行片段選擇；(7)配制末端修復(fù)反應(yīng)體系，在Thermomixer中適溫反應(yīng)一定時(shí)間對(duì)片段選擇后的產(chǎn)物進(jìn)行末端修復(fù)反應(yīng)，反應(yīng)后用試劑盒進(jìn)行純化；(8)配制加“A”反應(yīng)體系，在Thermomixer中適溫反應(yīng)一定時(shí)間對(duì)片段選擇后的產(chǎn)物進(jìn)行加“A”反應(yīng)，反應(yīng)后用試劑盒進(jìn)行純化；(9)配制P2 adapter連接反應(yīng)體系，在Thermomixer中適溫反應(yīng)一定時(shí)間使P2 adapter與加“A”后產(chǎn)物連接，再使用試劑盒對(duì)連接產(chǎn)物進(jìn)行純化；(10)配制PCR反應(yīng)體系對(duì)上一步的連接產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠回收純化，并溶解于適量EB solution中，至此文庫制備完成；(11)構(gòu)建好的文庫進(jìn)行質(zhì)量和產(chǎn)量的檢測(cè)，合格后用Illumina HiSeqTM平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序策略為Illumina PE150，周期大約為6～8周。

1.4 高通量測(cè)序分析

1.4.1 原始數(shù)據(jù)質(zhì)控和過濾

Illumina HiseqTM平臺(tái)測(cè)序得到的原始圖像數(shù)據(jù)經(jīng)過Base Calling轉(zhuǎn)化為序列數(shù)據(jù)，得到最原始的測(cè)序數(shù)據(jù)文件。在Illumina HiseqTM測(cè)序數(shù)據(jù)(Raw Data)下機(jī)之后，利用Fastp軟件對(duì)下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制，過濾其中低質(zhì)量的數(shù)據(jù)，獲得高質(zhì)量的數(shù)據(jù)(Clean Data)。

1.4.2 SNP檢測(cè)與位點(diǎn)開發(fā)

利用Stacks v1.42軟件進(jìn)行變異檢測(cè)，獲得高質(zhì)量的SNP位點(diǎn)，然后分別進(jìn)行個(gè)體聚類和群體聚類，利用Stacks v1.42軟件鑒別SNPs位點(diǎn)，再對(duì)每個(gè)個(gè)體的SNP進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，篩選出每個(gè)個(gè)體特有的SNP組合。Stacks v1.42軟件的分析流程如下：

process_radtags(reads)→ustacks(stacks)→cstacks(catalog)→sstacks(allele)→populations(SNPs)。

1.4.3 群體的遺傳分析

利用Stacks v1.42軟件鑒定群體SNP，按照樣品最低測(cè)序深度>2，樣品缺失率<0.5，MAF>0.05過濾得到有效的SNP位點(diǎn)，進(jìn)行群體分析：(1)通過RAxML軟件(Stamatakis,2006)的maximum likelihood算法構(gòu)建群體進(jìn)化樹，基于進(jìn)化樹分析結(jié)果，利用populations(Stacks v1.42)分析有效等位基因數(shù)目(Private)、平均觀測(cè)雜合度(Ho)、平均期望雜合度(He)、核苷酸多樣性(π)和平均近交系數(shù)(FIS)這6個(gè)遺傳多樣性指數(shù)開展遺傳進(jìn)化的初步分析；(2)通過ADMIXTURE(Alexander et al.,2009)軟件，分析樣品的群體結(jié)構(gòu)，通過假設(shè)分群數(shù)(K值)(2-19)，進(jìn)行聚類，最后根據(jù)CV error(Cross validation error)最低點(diǎn)對(duì)應(yīng)的K值來確定最佳分群數(shù)；(3)通過GCTA軟件進(jìn)行主成分分析(Principal components analysis，PCA)，得到樣品的主成分聚類情況，進(jìn)而輔助進(jìn)化分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 RAD-seq測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)控和過濾

RAD-seq測(cè)序reads為基因組DNA的酶切片段，其堿基含量分布檢查一般用于檢測(cè)有無AT、GC分離現(xiàn)象。鑒于序列的隨機(jī)性和堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則，理論上每個(gè)測(cè)序循環(huán)上的GC含量相等、AT含量相等，且在整個(gè)測(cè)序過程基本穩(wěn)定不變，呈水平線。N為測(cè)序儀無法判斷的堿基類型。本項(xiàng)目中樣品B的測(cè)序堿基含量分布如圖1所示，序列的起始位置與測(cè)序的引物接頭相連，因此A、C、G、T在起始端會(huì)有所波動(dòng)，后面會(huì)趨于穩(wěn)定。模糊堿基N所占比例越低，說明未知堿基數(shù)越少，測(cè)序樣本受系統(tǒng)AT偏好影響越小。虛線左側(cè)為Read1的統(tǒng)計(jì)，虛線右側(cè)為Read2的統(tǒng)計(jì)結(jié)果。結(jié)果表明，該樣品的文庫構(gòu)建質(zhì)量和測(cè)序質(zhì)量均可滿足后續(xù)分析。

圖1 樣品B的堿基組成分布圖 橫坐標(biāo)是Reads堿基坐標(biāo)，坐標(biāo)表示Reads上從5′到3′端依次堿基的排列；縱坐標(biāo)是所有Reads在該測(cè)序位置A、C、G、T、N堿基分別占的百分比，不同堿基用不同顏色表示。Fig.1 Distribution diagram of base content The base coordinate of Reads are on the X-axis,representing the sequence of bases on Reads from 5′ to 3′; Percentages of all Reads at A,C,G,T,N bases in this sequence are on the Y-axis. Different bases are expressed in different colors.

對(duì)質(zhì)量剪切后的Clean Data分別進(jìn)行測(cè)序Reads數(shù)、總堿基數(shù)、GC含量和Q30比例的統(tǒng)計(jì)，共獲得高質(zhì)量的Reads數(shù)440243175，過濾后得到Clean data 129.26 G，平均每個(gè)樣品5.39 G，平均GC含量為38.42%，堿基質(zhì)量Q30比例達(dá)到93.67%。由于所測(cè)序列的Q30數(shù)據(jù)較高，表明堿基出錯(cuò)率很低，GC分布正常，數(shù)據(jù)量達(dá)到分析要求，建庫測(cè)序成功。詳細(xì)結(jié)果見表1。

表1 云南藍(lán)果樹基因組DNA測(cè)序數(shù)據(jù)

2.2 SNP檢測(cè)與位點(diǎn)開發(fā)

SNP檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所有樣品酶切片段數(shù)量為341136～1282834，平均值為672131；酶切片段平均深度為12.32～70.45X，平均值為28.11X(表2)，表明SNP位點(diǎn)檢測(cè)成功。

依據(jù)材料方法部分給出的SNP檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，我們對(duì)樣本進(jìn)行了過濾，在經(jīng)過填補(bǔ)和質(zhì)控后，共計(jì)得到98498個(gè)SNP位點(diǎn)，每個(gè)樣品檢測(cè)到2029～12470個(gè)SNP位點(diǎn)，平均獲得4104個(gè)SNP位點(diǎn)(表3)。根據(jù)樣品最低測(cè)序深度>2，樣品缺失率<0.5、次要基因型頻率(MAF)>0.05的選擇標(biāo)準(zhǔn)，從這些SNP中篩選出6309個(gè)有效SNP，用于群體遺傳分析。樣本中SNP位點(diǎn)的雜合率為31.32%～81.13%，平均雜合率為63.87%；樣本中SNP位點(diǎn)的純合率為18.87%～68.68%，平均純合率為36.13%。由此可以看出，云南藍(lán)果樹的24個(gè)樣本間SNP雜合率存在較大差異，表明它們的基因組高度雜合。另外，每個(gè)樣品的轉(zhuǎn)換與顛換的比值(Ti/Tv)為1.74～2.40，平均值為2.02。云南藍(lán)果樹轉(zhuǎn)換與顛換的比值均大于1，說明云南藍(lán)果樹的變異更多的是發(fā)生在嘌呤與嘌呤或者嘧啶與嘧啶之間的轉(zhuǎn)換。

表2 云南藍(lán)果樹的SNP檢測(cè)結(jié)果

2.3 遺傳分析

基于過濾得到的6 309個(gè)SNP標(biāo)記，對(duì)24個(gè)云南藍(lán)果樹植株樣本完成了系統(tǒng)進(jìn)化樹、群體結(jié)構(gòu)和主成分分析，從基因組水平揭示了群體的遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳譜系。

表3 云南藍(lán)果樹的SNP信息統(tǒng)計(jì)

圖2 云南藍(lán)果樹的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree of N.yunnanensis

2.3.1 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

基于開發(fā)出的SNP位點(diǎn)，采用最大似然法對(duì)24個(gè)樣本構(gòu)建了進(jìn)化樹(圖2)。從進(jìn)化樹可以看出，24株云南藍(lán)果樹被聚成了3大類。第Ⅰ類包括16株，占總株數(shù)的66.7%；第Ⅱ類包括6株，占總株數(shù)的25%；第Ⅲ類包括2株，占總株數(shù)的8.3%。經(jīng)計(jì)算，這24株云南藍(lán)果樹的Private為1 578，Ho為0.309 4，He為0.321 2，π為0.334 9，F(xiàn)IS為0.096 0。表4表明，系統(tǒng)進(jìn)化樹劃分的3大類的Private為21～578，平均值為275.33；Ho為0.177 3～0.277 5，平均值為0.220 2；He為0.126 4～0.335 6，平均值為0.243 1；π為0.224 6～0.346 3，平均值為0.298 7；FIS為0.028 3～0.285 2，平均值為0.182 3，意味著每個(gè)分類之間的近交程度較低。其中，第Ⅰ類中表征遺傳多樣性的參數(shù)值都高于其他兩類(Ⅱ和Ⅲ)，其遺傳多樣性更豐富，應(yīng)列為重點(diǎn)保護(hù)對(duì)象。

表4 云南藍(lán)果樹不同分類的遺傳多樣性分析

圖3 云南藍(lán)果樹樣品的structure結(jié)構(gòu)圖Fig.3 Individual cluster values(K) of N.yunnanensis with structure analysis

圖4 不同K值所對(duì)應(yīng)的交叉驗(yàn)證錯(cuò)誤率Fig.4 The admixture validation error rate corresponding to the different K values

圖5 云南藍(lán)果樹的PCA聚類圖Fig.5 Principal coordinates analysis(PCA) plot generated by GCTA of N.yunnanensis

2.3.2 群體結(jié)構(gòu)分析

基于開發(fā)出的6309個(gè)SNP標(biāo)記，通過ADMIXTURE(Alexander et al.,2009)軟件，分析樣品的群體結(jié)構(gòu)，分別假設(shè)分群數(shù)(K值)為2～19，進(jìn)行聚類(圖3)。根據(jù)聚類結(jié)果，把擁有最低交叉驗(yàn)證錯(cuò)誤率(CVerror)的分群數(shù)定義為最優(yōu)分群(圖4)。結(jié)果顯示，分群數(shù)為19時(shí)，CVerror值最小，表明樣本之間遺傳差異比較大，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。但其曲線一直呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，沒有最低值，不能說明k=19是最佳分組，可能所有樣本的基因都是混合的，祖先也是混合的。

2.3.3 主成分分析

基于個(gè)體間SNP的差異情況，對(duì)24個(gè)云南藍(lán)果樹樣本進(jìn)行主成分聚類分析(圖5)。結(jié)果顯示，PCA分析也沒有產(chǎn)生任何明顯的分組，這與群體結(jié)構(gòu)分析的結(jié)果一致(圖3)。這些結(jié)果進(jìn)一步支持了云南藍(lán)果樹現(xiàn)存植株之間遺傳多樣性差異較大的假設(shè)。

3 討論

基于二代測(cè)序的簡(jiǎn)化基因組測(cè)序技術(shù)目前已作為主流方法應(yīng)用于很多物種SNP標(biāo)記的開發(fā)[21～24]。云南藍(lán)果樹作為云南特有的極小種群植物，曾采用SSR標(biāo)記和ISSR標(biāo)記研究其遺傳多樣性水平[25～26]，但是這些標(biāo)記存在通量小、準(zhǔn)確性較低、耗時(shí)耗力、成本高等局限性[27～28]，而且難以篩選出多態(tài)性足夠高的遺傳標(biāo)記。而基于RAD-seq技術(shù)開發(fā)的SNP標(biāo)記作為現(xiàn)在分子遺傳學(xué)中最重要的分子標(biāo)記，是反映生物內(nèi)DNA序列變異程度的重要參數(shù)，并經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析可獲得核苷酸多樣性信息[29]，具有數(shù)量多且分布豐富代表性高、遺傳穩(wěn)定性好、檢測(cè)快速、不受基因組序列的限制等特點(diǎn)[22,30～31]。目前，云南藍(lán)果樹尚未獲得足夠的核酸序列數(shù)據(jù)，甚至也沒有藍(lán)果樹科內(nèi)近緣物種的可參考基因組序列，RAD-seq是一種比較理想的研究技術(shù)。從本試驗(yàn)所測(cè)得24個(gè)個(gè)體的有效reads數(shù)看，數(shù)據(jù)量基本均勻，未出現(xiàn)個(gè)體數(shù)據(jù)量差異極大的現(xiàn)象，基本滿足后續(xù)分析的數(shù)據(jù)量要求。經(jīng)過預(yù)試驗(yàn)，我們選擇EcoRⅠ進(jìn)行限制性酶切。對(duì)云南藍(lán)果樹進(jìn)行基因組測(cè)序分析，共得到129.26 G的Clean data，Q30比例達(dá)到93.67%。由于所測(cè)序列的Q30數(shù)據(jù)較高，表明堿基出錯(cuò)率很低，GC分布正常，表明數(shù)據(jù)量達(dá)到預(yù)期目標(biāo)，文庫構(gòu)建質(zhì)量較好，測(cè)序成功，可以進(jìn)行后續(xù)分析。本次研究中我們共獲得SNP位點(diǎn)53 120個(gè)，通過樣品最低測(cè)序深度>2，樣品缺失率<0.5、次要基因型頻率(MAF)>0.05篩選以后，得到有效SNP位點(diǎn)6 309。因此，本研究嘗試應(yīng)用簡(jiǎn)化基因組技術(shù)RAD-seq對(duì)云南藍(lán)果樹開發(fā)SNP位點(diǎn)，取得了成功，為云南藍(lán)果樹的群體遺傳分析奠定了基礎(chǔ)。

評(píng)估一個(gè)物種的遺傳變異程度是遺傳資源保護(hù)的基礎(chǔ)和重要內(nèi)容[32]。基于SNP位點(diǎn)的核苷酸多樣性(π)、觀測(cè)雜合度(Ho)、期望雜合度(He)和近交系數(shù)等參數(shù)常被用來表征群體的遺傳多樣性大小[24]。核苷酸多樣性(π)是反映生物體內(nèi)基因組DNA序列變異程度的重要參數(shù)，通過對(duì)基因組DNA的測(cè)序開發(fā)SNP位點(diǎn)，經(jīng)過計(jì)算獲得核苷酸多樣性信息[29]。尤其對(duì)于雙等位基因SNP位點(diǎn)來說，π值可以全面地測(cè)定一個(gè)群體的遺傳多樣性[33～35]。由于進(jìn)化速率的不同，同一個(gè)物種中不同的DNA片段也可能具有不同的π值[36]。Shi等人選擇了36個(gè)單拷貝核基因來推斷人參屬的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，并評(píng)估同一直系同源物在二倍體和四倍體物種中是否表現(xiàn)出異質(zhì)進(jìn)化率[37]。目前通過對(duì)SNP的分析發(fā)現(xiàn)，很多植物的π值都低于0.1[24,29]。本研究基于開發(fā)出的SNP位點(diǎn)，測(cè)得24株云南藍(lán)果樹的核苷酸多樣性(π)、平均觀測(cè)雜合度(Ho)和期望雜合度(He)分別為0.334 9、0.309 4和0.321 2。系統(tǒng)進(jìn)化樹劃分為3大類，這3大類的π值為0.224 6～0.346 3，平均為0.298 7；平均觀測(cè)雜合度(Ho)為0.177 3～0.277 5，平均值為0.220 2；平均期望雜合度(He)為0.126 4～0.335 6，平均值為0.243 1。綜上所述，云南藍(lán)果樹現(xiàn)存植株不管是整體還是各個(gè)分支的π、Ho和He值均較高，意味著云南藍(lán)果樹現(xiàn)存植株在SNP水平上的遺傳多樣性較豐富，保護(hù)其遺傳資源具有重要意義。為了檢驗(yàn)每個(gè)群體內(nèi)是否存在隱藏的種群結(jié)構(gòu)，近交系數(shù)(FIS)被用來衡量群體內(nèi)雜合子的存在情況[33,38～39]。云南藍(lán)果樹3個(gè)分類群體的FIS為0.028 3～0.285 2，平均值為0.182 3，較高的近交水平暗示了云南藍(lán)果樹可能存在近交衰退的風(fēng)險(xiǎn)，進(jìn)一步表明云南藍(lán)果樹早期幼苗在旱季全部死亡的原因，除了氣候變化加劇了土壤水分短缺和自毒效應(yīng)等環(huán)境因素外，也可能是由于近交衰退導(dǎo)致云南藍(lán)果樹適應(yīng)能力較差的結(jié)果。因此，下一步工作急需通過開發(fā)云南藍(lán)果樹親子鑒定遺傳分析技術(shù)，確定種群內(nèi)外植株間的親緣關(guān)系，降低近交衰退的風(fēng)險(xiǎn)。

云南藍(lán)果樹的群體遺傳分析可為評(píng)價(jià)和指導(dǎo)云南藍(lán)果樹拯救保護(hù)工程中遺傳資源的保護(hù)提供理論依據(jù)。為了保證新建種群個(gè)體間的遺傳距離保持最大，遺傳資源保護(hù)最豐富，就應(yīng)構(gòu)建一個(gè)包括所有有效樣本的樣本集。由系統(tǒng)發(fā)育樹可知，24株云南藍(lán)果樹被分為3大類，其中，M和L之間、I和H之間、U和Q之間、T和R之間、J和K之間、G和C之間、W和N之間都分別被認(rèn)為遺傳關(guān)系較近。因此，24株云南藍(lán)果數(shù)最終被聚成了16個(gè)有效分支1～16(Ⅰ分類中具有11個(gè)有效分支；Ⅱ分類具有4個(gè)有效分支；Ⅲ分類只有1個(gè)有效分支)。從每個(gè)有效分支中選取1個(gè)樣本作為有效樣本，共得到16個(gè)有效樣本。無論是對(duì)現(xiàn)存天然種群進(jìn)行恢復(fù)，還是通過近地和遷地保護(hù)重建種群，都應(yīng)構(gòu)建一個(gè)包括所有有效樣本1個(gè)備份以上的樣本集，并且樣本集里所屬每個(gè)分類的遺傳多樣性保證為系統(tǒng)進(jìn)化樹中每個(gè)分類遺傳多樣性理論值的90%以上，使得遺傳資源保護(hù)科學(xué)化；綜合考慮環(huán)境壓力和資金投入因素，可最終確定每個(gè)有效樣本的備份數(shù)及恢復(fù)重建種群的規(guī)模。在野外恢復(fù)或重建種群時(shí)，確保相鄰或相近的植株屬于不同有效樣本，并結(jié)合現(xiàn)存種群密度(特別是不同有效樣本間的距離)，使新建種群個(gè)體間的遺傳距離保持最大。結(jié)合恢復(fù)或重建種群規(guī)模及其個(gè)體間的空間布局，通過ArcGIS在衛(wèi)星影像圖上模擬，確定保護(hù)小區(qū)面積、重建種群所需生境面積。