沈 誠，趙樹林，袁 燁

隨著年齡的增加，動(dòng)脈粥樣硬化的形成，各種代謝性疾病如糖尿病、終末期腎病發(fā)生、動(dòng)脈血管鈣化的發(fā)生率也伴隨著增加。研究表明，血管鈣化是與心血管疾病密切相關(guān)的病理改變，可明顯增加各種心血管事件的發(fā)生，是心血管疾病致殘、致死的主要原因［1］。血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cell，VSMCs）在某種因素的作用下由肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變?yōu)槌晒羌?xì)胞表型，合成、分泌骨基質(zhì)等骨相關(guān)蛋白參與鈣化，是血管鈣化的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)［2］。染料木黃酮（Genistein），是與雌激素作用類似而無副作用的異黃酮類化合物，與雌激素受體結(jié)合而發(fā)揮其生物學(xué)作用。研究發(fā)現(xiàn)Genistein可以降低人體多種雌激素依賴型疾病的發(fā)病率，在預(yù)防腫瘤、心血管疾病、骨質(zhì)疏松等方面有重要作用［3］。然而，Genistein對(duì)VSMCs鈣化的研究較少，且機(jī)制尚不明確。本文利用體外培養(yǎng) VSMCs，研究 Genistein對(duì)VSMCs鈣化的影響及護(hù)骨素（osteoprotegerin，OPG）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）等相關(guān)因子的變化，期望為抑制血管鈣化提供新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料 SPFBALB／c 小鼠，4 周齡，若干，購于第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。茜素紅、Genistein、羊抗兔IgG、羊抗小鼠IgG二抗購自Sigma公司；蛋白裂解液、BCA蛋白定量試劑盒購自Pierce；小鼠OPG、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（alpha smooth muscle actin，a-SMA）、ALP、骨橋蛋白（osteopontin，OPN）抗體購自Santacruz；聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）引物自上海生工；DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶購自Gibco；sybrgreen I、逆轉(zhuǎn)錄RT試劑、熒光定量PCR試劑購自Western Biotechnology。

1.2 小鼠VSMCs的分離與純化及模型構(gòu)建 根據(jù)文獻(xiàn)方法［4］，獲取實(shí)驗(yàn)鼠胸主動(dòng)脈，去除血管外的結(jié)締組織。采用貼塊法獲取原代VSMCs。0.25%胰蛋白酶消化、傳代后用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。采用免疫組化a-SMA染色進(jìn)行VSMCs鑒定。實(shí)驗(yàn)采用第5～10代細(xì)胞。取匯合狀態(tài)的VSMCs，在含胎牛血清的培養(yǎng)基中 10 mmol／L β-甘油磷酸鹽，每?jī)商鞊Q液一次，以制備鈣化的VSMCs［5］。

1.3 細(xì)胞分組 VSMCs鈣化培養(yǎng)同時(shí)加入相應(yīng)濃度的Genistein處理細(xì)胞，共21 d。分為①對(duì)照組；②鈣化組；③鈣化+Genistein 10 μmol／L 處理組；④鈣化 +Genistein 30 μmol／L 處理 組；⑤ 鈣 化 +Genistein 50 μmol／L處理組。在預(yù)實(shí)驗(yàn)中筆者發(fā)現(xiàn)不同濃度Genistein對(duì)正常VSMCs的影響非常小，因此設(shè)立對(duì)照組時(shí)筆者僅選用30 μmol／L作為代表。

1.4 茜素紅染色 培養(yǎng)細(xì)胞在2.5%戊二醛中固定20 min后，PBS洗滌三次，加入2%茜素紅孵育10 min，丙酮脫水，二甲苯透明。磷酸鈣鹽沉積染成橘紅色。

1.5 熒光相對(duì)定量PCR檢測(cè) 先用試劑盒提取RNA，隨后用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reversetranscripition-polymerase chain reaction，RT-PCR）試劑盒進(jìn)行RT-PCR。熒光定量PCR擴(kuò)增條件的設(shè)置：94℃4 min、94℃20 s、60℃30 s、72℃30 s循環(huán) 35 次，72℃檢測(cè)信號(hào)。引物序列見表1。設(shè)置磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehydes phosphate dehydrogenase，GAPDH）基因?yàn)閮?nèi)參對(duì)照，以 2（-⊿Ct）法分析相關(guān)基因表達(dá)水平。

表1 熒光相對(duì)定量PCR引物序列

1.6 Western Blot檢測(cè) 提取各組細(xì)胞的總蛋白，BCA法測(cè)蛋白濃度。SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉1 h后，加入一抗（OPG、a-SMA、ALP、OPN），4℃孵育過夜；洗膜后加入二抗，室溫孵育2 h，洗膜，曝光顯影。用UVP凝膠圖象處理系統(tǒng)Labworks 4.6軟件分析目的條帶的灰度值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0軟件，計(jì)量資料以±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 原代VSMCs的培養(yǎng)及鑒定 培養(yǎng)的細(xì)胞呈多邊形或梭形，細(xì)胞質(zhì)豐富，細(xì)胞核居中（圖1A）。為了證實(shí)所得細(xì)胞為VSMCs，采用SMC特有的a-SMA進(jìn)行免疫組化染色，鏡下可見培養(yǎng)細(xì)胞的胞漿內(nèi)有大量棕色顆粒，排除是其他內(nèi)皮細(xì)胞或成纖維細(xì)胞。細(xì)胞染色率超過95%，符合實(shí)驗(yàn)要求（圖1B）。

圖1 VSMCs的培養(yǎng)及鑒定

2.2 不同濃度Genistein對(duì)VSMCs鈣化的影響 培養(yǎng)2周后，不同組別間VSMCs鈣鹽沉積茜素紅染色區(qū)別明顯（橘紅色范圍）。第2組顯示VSMCs鈣化明顯，隨著Genistein干預(yù)，濃度增高后VSMCs鈣化逐漸減少，以 Genistein 50 μmol／L 組最為顯著（圖 2）。

圖2 各組VSMCs鈣鹽沉積茜素紅染色結(jié)果

2.3 不同濃度Genistein抑制VSMCs鈣化后OPG、a-SMA、ALP、OPN mRNA及蛋白表達(dá) 與對(duì)照組比較，鈣化組OPG基因表達(dá)顯著減低，經(jīng)過Genistein處理后，隨著Genistein濃度增加，OPG表達(dá)逐步增高（P＜0.05）。a-SMA基因的變化規(guī)律與OPG類似。然而，ALP和OPN基因在對(duì)照組表達(dá)最弱，在鈣化組表達(dá)最高，隨著Genistein濃度增加，ALP和OPN 基因表達(dá)逐步減弱（圖3）（P＜0.05）。

圖3 各組間 OPG、a-SMA、ALP、OPN mRNA和蛋白表達(dá)水平

3 討 論

動(dòng)脈血管的異位鈣化與多種老年疾病的發(fā)生密切相關(guān)，是一種常見病理狀態(tài)，涉及的發(fā)生發(fā)展過程相當(dāng)復(fù)雜，與骨或軟骨的礦化過程類似。在此過程中，VSMCs在外界因素的刺激下轉(zhuǎn)變?yōu)槌晒羌?xì)胞表型從而直接參與鈣化的發(fā)生。研究表明［6］，在動(dòng)脈粥樣硬化病變過程中位于動(dòng)脈內(nèi)膜下的VSMCs及巨噬細(xì)胞可分泌骨骼特征性蛋白，促進(jìn)斑塊的形成。同樣在血管中膜鈣化過程中，VSMCs大量分泌的OPG、MGP等非膠原蛋白呈動(dòng)態(tài)變化，提示其與血管鈣化關(guān)聯(lián)緊密。

雌激素對(duì)心血管系統(tǒng)具有保護(hù)作用，筆者證實(shí)雌激素與冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病關(guān)系密切［7］。VSMCs內(nèi)含有豐富的雌激素受體，既往研究表明，雌激素能夠與VSMCs上的受體結(jié)合快速舒張血管，同時(shí)抑制 VSMCs增生，發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用［8］。Genistein與雌激素作用類似，可以降低人體多種雌激素依賴型疾病的發(fā)病率，在預(yù)防腫瘤、心血管疾病、骨質(zhì)疏松等方面有重要作用［9］。近年眾多研究表明Genistein對(duì)腫瘤細(xì)胞，成骨細(xì)胞具有調(diào)控作用，能否作用于VSMCs尚不明確。在本研究發(fā)現(xiàn)，鈣化組 VSMCs茜素紅染色顯著增強(qiáng)，予以Genistein處理后鈣化結(jié)節(jié)染色明顯減輕，提示Genistein能夠發(fā)揮抑制VSMCs向成骨細(xì)胞分化的作用，并具有劑量依賴性。這一結(jié)果證實(shí)Genistein具有與雌激素類似的心血管疾病預(yù)防保護(hù)作用。然而Genistein與VSMCs上的雌激素受體結(jié)合后，通過何種通路減輕鈣化有待進(jìn)一步研究。

OPG是由Simonet對(duì)大鼠小腸進(jìn)行cDNA測(cè)試時(shí)所發(fā)現(xiàn)的一種分泌型蛋白，可抑制破骨細(xì)胞分化，增高骨密度。在骨組織，OPG主要由成骨細(xì)胞產(chǎn)生；在血管系統(tǒng)，主要由內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞產(chǎn)生，在血管鈣化過程中對(duì)內(nèi)皮和平滑肌細(xì)胞發(fā)揮復(fù)雜的自分泌和旁分泌作用，而對(duì)血管起保護(hù)作用［10］。筆者的前瞻性流行病學(xué)研究結(jié)果顯示：血清中OPG含量與冠心病的發(fā)病率密切相關(guān)［11］。 研究顯示［12］，Genistein通過OPG／RANKL／RANK系統(tǒng)對(duì)骨代謝予以調(diào)節(jié)，可直接或間接刺激成骨細(xì)胞表達(dá)OPG，抑制RANKL分泌，從而抑制破骨細(xì)胞分化，減少骨丟失。然而目前在VSMCs鈣化過程中，Genistein是否能調(diào)控OPG表達(dá)尚未見報(bào)道。在本研究中，VSMCs鈣化組與對(duì)照組比較OPG表達(dá)顯著降低，Genistein處理組明顯能增加VSMCs中OPG mRNA水平和OPG蛋白分泌，并且隨著Genistein濃度的提高，促進(jìn)OPG分泌作用更加顯著，提示OPG可能是Genistein抑制VSMCs鈣化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，Genistein與雌激素受體結(jié)合后通過 OPG／RANKL／RANK系統(tǒng)來影響 VSMCs鈣化的進(jìn)程。

動(dòng)脈鈣化的過程與骨骼的礦化過程類似，都屬于主動(dòng)調(diào)節(jié)，因此影響骨骼礦化的因素同樣可能作用于血管鈣化。本實(shí)驗(yàn)中，筆者發(fā)現(xiàn)除了OPG基因外，ALP、OPN基因也與VSMCs鈣化有聯(lián)系。VSMCs鈣化組與對(duì)照組比較ALP、OPN表達(dá)顯著升高，經(jīng)過Genistein處理后，ALP、OPN表達(dá)明顯減弱，與OPG變化一致也呈現(xiàn)劑量依賴性。ALP、OPN均為成骨細(xì)胞分化特征性基因，它們的表達(dá)水平與VSMCs鈣化程度密切相關(guān)。既往研究表明，正常VSMCs只能合成少量ALP及OPN，在動(dòng)脈粥樣硬化過程中ALP及OPN表達(dá)升高，鈣化發(fā)生后兩者表達(dá)會(huì)進(jìn)一步增加。因此筆者相信，動(dòng)脈鈣化是局部多種因素在基因和分子水平相互作用的結(jié)果，可能存在多個(gè)分子交織的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，除了OPG基因外，還有多種與骨代謝相關(guān)基因共同參與了VSMCs鈣化過程。

綜上所述，Genistein具有緩解VSMCs鈣化的作用，OPG信號(hào)通路與此作用密切相關(guān)，ALP、OPN等骨代謝相關(guān)基因也參與其中。這一結(jié)果有望為抑制血管鈣化提供新的途徑。