■趙亞星 敖長金 包志碧 范澤軍 杜紅喜

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特010018）

反芻動物主要通過瘤胃微生物和自身分泌的酶對飼料進(jìn)行消化。瘤胃微生物可消化飼料中50%的粗纖維和70%～85%的可消化干物質(zhì)，產(chǎn)生揮發(fā)性脂肪酸、CO2、乳酸及甲烷，并產(chǎn)生微生物蛋白和B 族維生素供反芻動物機(jī)體利用[1]。因此，通過促進(jìn)或抑制某些瘤胃微生物，可使得消化代謝的損失降到最低，提高其飼料利用率和生產(chǎn)性能。植物提取物作為瘤胃調(diào)控劑具有天然無危害的特點，因此成為當(dāng)下研究的熱點。李大彪等[2]研究指出在山羊和綿羊飼糧中添加單寧能夠降低瘤胃總細(xì)菌和總厭氧真菌的含量，且山羊瘤胃內(nèi)總細(xì)菌和總厭氧真菌含量下降程度顯著高于綿羊。王夢竹等[3]研究發(fā)現(xiàn)不同劑量的苜蓿黃酮對纖維素酶活性影響不同,當(dāng)添加4%時,木聚糖酶、纖維二糖酶等纖維素酶活性最高。苑文珠[4]的研究結(jié)果表明在飼糧中添加茶皂素可顯著降低原蟲，并改善湖羊的生產(chǎn)性能。

沙蔥，又名蒙古韭，屬被子植物門，百合科，蔥屬。是一種含有較高粗蛋白和代謝能，較低中性洗滌纖維的優(yōu)質(zhì)牧草，為牛羊等反芻動物喜食，主要分布在內(nèi)蒙古中西部地區(qū)[5]。沙蔥的葉和花具有藥理作用，既能開胃、消食、降血壓，又能提高免疫力，抗菌抗病毒[6]。沙蔥能夠改善羊肉風(fēng)味[7]，改善肉品質(zhì)[8]，提高動物抗氧化能力及免疫力[9]。

目前沙蔥作為植物添加劑的研究熱點之一，其研究主要集中于沙蔥及其提取物對肉羊生產(chǎn)性能和肉品質(zhì)的影響等方面，關(guān)于沙蔥水溶性提取物和脂溶性提取物對瘤胃微生物以及瘤胃消化酶活性研究較少。因此，本試驗通過在肉羊飼糧中添加沙蔥及其提取物，研究其對肉羊瘤胃微生物和消化酶活性的影響，以期在瘤胃微生物層面上揭示沙蔥及其提取物改變羊肉品質(zhì)的作用機(jī)理，并為沙蔥及其提取物在肉羊?qū)嶋H生產(chǎn)中提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與飼糧

1.1.1 試驗動物

選取24只，體況良好，體重（37.1±0.5）kg相近的杜寒雜交F1 代（小尾寒羊×杜泊羊）進(jìn)行試驗。試驗期內(nèi)每天6：00和18：00飼喂2次，自由飲水。基礎(chǔ)飼糧組成和營養(yǎng)成分見表1。

1.1.2 沙蔥提取物的制備

沙蔥提取物的制備：將沙蔥粉脫脂后與75%的乙醇按照料液比為1:30 混合，超聲微波處理20 min，得到黃色粉末的脂溶性提取物。脂溶性提取物的得率為2.8 g/10 g 沙蔥粉。將沙蔥粉脫脂后與蒸餾水按照料液比為1:20 混合，放于65 ℃烘箱，得到紅褐色粉末的水溶性提取物。水溶性提取物的得率為3.4 g/10 g沙蔥粉。

本次試驗開始前已知沙蔥水溶性提取物中主要活性物質(zhì)為有機(jī)酸及其衍生物（α-羥基異丁酸、2-羥基丁酸）、植物激素（N6-異戊烯腺嘌呤）、羥基肉桂酰衍生物（對羥基苯丙酸）。沙蔥脂溶性提取物中主要是氨基酸衍生物[S-（5-腺苷）-L-高半胱氨酸]，脂質(zhì)-甘油磷脂（溶血磷脂酰膽堿)、脂質(zhì)-甘油脂(單酰甘油脂)[10]。

1.1.3 基礎(chǔ)飼糧

1.2 試驗設(shè)計

本試驗采用單因素隨機(jī)分組設(shè)計，每組羊按照同質(zhì)性原則隨機(jī)分為4組，每組6只羊。試驗期共75 d，其中預(yù)試期15 d，正式試驗期60 d。對照組（CON Group）飼喂基礎(chǔ)飼糧，沙蔥組（AMR Group）在基礎(chǔ)飼糧中添加10 g/(d·只)沙蔥粉，水溶組（AWE Group）在基礎(chǔ)飼糧中添加3.4 g/(d·只)沙蔥水溶性提取物，脂溶組（AFE Group）在基礎(chǔ)飼糧中添加2.8 g/(d·只)沙蔥脂溶性提取物。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平（干物質(zhì)基礎(chǔ)）

1.3 測定指標(biāo)

1.3.1 瘤胃液的采集與測定

在正飼期內(nèi)，每隔30 d各組隨機(jī)選取4只羊在晨飼后2 h 采集瘤胃液。裝保溫瓶后帶回實驗室，經(jīng)四層無菌無酶紗布過濾后，放入液氮罐種待測。

1.3.2 瘤胃微生物的定量

1.3.2.1 總DNA的提取

采用珠磨硯法提取瘤胃微生物總DNA，本方法須注意的是玻璃珠的用量和細(xì)胞的破碎程度以及蛋白質(zhì)的去除[11]。

1.3.2.2 瘤胃微生物引物的設(shè)計與合成

1.3.2.3 目的片段的擴(kuò)增

25 μl 的反應(yīng)體系：模板2 μl，上游引物1 μl，下游引物1 μl，DNA連接酶12.5 μl，dd水8.5 μl。

反應(yīng)參數(shù)：94 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，退火40 s，72 ℃延伸1 min,36個循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖電泳檢測后，用膠回收試劑盒（Axygen Biosciences）將目的片段進(jìn)行回收。

1.3.2.4 PCR產(chǎn)物的克隆

根據(jù)pGM-T 克隆試劑盒說明，將PCR 產(chǎn)物與pGM-T載體進(jìn)行連接。

10 μl 的反應(yīng)體系：目的PCR 片段7 μl，T4DNA ligase 1 μl，10×T4DNA Ligation Buffer 1 μl，pGM-T Vector 1 μl。使用Top10感受態(tài)細(xì)胞。

1.3.2.5 陽性質(zhì)粒的篩選與鑒定

將過夜的菌液做PCR 檢驗，配置25 μl 的體系：模板（菌液）2 μl，上游引物1 μl，下游引物1 μl，Mix 12.5 μl。

表2 瘤胃微生物的引物序列及參數(shù)

PCR反應(yīng)的產(chǎn)物經(jīng)過電泳后，所得的條帶與目的條帶大小一致，故為陽性克隆菌液，委托華大基因科技服務(wù)有限公司進(jìn)行測序。驗證正確的菌液后，根據(jù)質(zhì)粒小提試劑盒的說明書提取質(zhì)粒。

1.3.2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

提取質(zhì)粒后用酶標(biāo)儀測定質(zhì)粒的濃度，根據(jù)公式計算出陽性質(zhì)粒的拷貝數(shù)（計算公式：質(zhì)粒拷貝數(shù)（個/μl）=[6.02×1023（個/mol）×DNA 濃度（ng/μl）]/{DNA長度（bp）×660[g/(mol·bp)]}[13]。

將已知拷貝數(shù)的質(zhì)粒以10倍濃度梯度連續(xù)稀釋5 個梯度，每梯度設(shè)3 個重復(fù)，無酶水作對照，進(jìn)行實時熒光定量PCR，最終得到與質(zhì)?？截悢?shù)和循環(huán)閾值（Ct）對應(yīng)的線性關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2.7 瘤胃微生物實時定量PCR檢測

參照熒光染料SYBR PreMix Plus 說明書建立25 μl的體系，將樣品統(tǒng)一稀釋到10 ng/μl。將實時熒光定量PCR得到的Ct值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到總細(xì)菌，總厭氧真菌和原蟲的數(shù)量。計算公式如下：

總細(xì)菌、總厭氧真菌和原蟲數(shù)量（個/g）=（MQ×C×VD）/（S×V）[14]

式中：MQ——根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線Ct計算得到的總細(xì)菌，總厭氧真菌和原蟲數(shù)量（個）；

C——每個樣品基因組DNA濃度（ng/μl）；

VD——提取DNA 時最后溶解DNA 的ddH2O 的體積（μl）；

S——用于實時定量PCR的DNA的量（ng）；

V——提取粗DNA時瘤胃內(nèi)容物樣品用量（g）。

總細(xì)菌，總厭氧真菌和原蟲數(shù)量最終用拷貝數(shù)的常用對數(shù)[1g（個/ml）]表示。

1.3.3 纖維素酶活性的測定

按照Agarwal 等[15]的方法對瘤胃液濾紙酶、羧甲基纖維素酶、木聚糖酶、纖維二糖酶、淀粉酶和蛋白酶的活力進(jìn)行測定。濾紙酶活力指1 g酶水解反應(yīng)中每分鐘生成1 μmol 葡萄糖的酶量。羧甲基纖維素酶活力指一定條件下每分鐘從1 g 羧甲基纖維素鈉中降解1 μmol 還原糖所需的酶量。木聚糖酶活力指一定條件下每分鐘催化分解1g 木聚糖產(chǎn)生1 μmol 木糖所需的酶量。纖維二糖酶活力定義為1 g酶水解反應(yīng)中每分鐘生成1μmol還原糖所需的酶量。淀粉酶活力指每分鐘水解1ml淀粉生成1μmol還原糖所需的酶量。蛋白酶活力指1 ml 液體酶一定條件下每分鐘水解酪素產(chǎn)生1 μg酪氨酸所需的酶量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

利用Excel 整理數(shù)據(jù)，SPSS 17.0 軟件的one-way ANOVE 對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，用Duncan's 法對平均值進(jìn)行多重比較。P＜0.05 為差異顯著判定標(biāo)準(zhǔn)，P＞0.05為差異不顯著判定標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 瘤胃微生物標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒PCR檢測

對目標(biāo)片段進(jìn)行膠回收進(jìn)行克隆，將挑取得單克隆菌液落于液體培養(yǎng)基中過夜。提取質(zhì)粒，PCR檢測是否為目的片段，然后送檢測。

2.2 陽性克隆驗證

測序結(jié)果表明陽性克隆片段與總細(xì)菌的同源性為98%。與厭氧真菌的同源性為99%，與原蟲的同源性為97%，且含有完整的引物序列，這說明構(gòu)建了含有目的片段的質(zhì)粒，能夠制作標(biāo)準(zhǔn)品。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

總細(xì)菌數(shù)量（y1）、總厭氧真菌數(shù)量（y2）、原蟲數(shù)量（y3）、牛鏈球菌（y4）、棲普雷沃氏菌（y5）根據(jù)Ct(x)的標(biāo)準(zhǔn)曲線公式如下：

y1=-3.10Lg(x)+43.10；R2=0.998；y2=-3.23Lg(x)+43.45，R2=0.960；y3=-3.34Lg(x)+43.36；R2=0.989；y4=-3.792Lg(x)+66.79，R2=0.924；y5=-3.816Lg(x)+57.63，R2=0.937。

2.4 沙蔥及其提取物對瘤胃微生物區(qū)系的影響

由表3可知，與對照組相比，在30 d和60 d時，試驗組的細(xì)菌含量顯著提高（P＜0.05）。在60 d時，水溶組的總厭氧真菌含量顯著高于（P＜0.05）其他組。在60 d時，沙蔥組的原蟲含量顯著（P＜0.05）降低。各處理組的牛鏈球菌和棲普雷沃氏菌含量沒有顯著變化（P＞0.05）。

2.5 沙蔥及其提取物對肉羊瘤胃液消化酶活性的影響

由表4可知，與對照組相比，在30 d和60 d時，沙蔥及其提取物組木聚糖酶活性和脂肪酶活性顯著（P＜0.05）提高，在60 d時，沙蔥及其提取物組濾紙纖維素酶活性顯著（P＜0.05）提高。在60 d 時，沙蔥水溶組β-葡萄糖苷酶活性顯著（P＜0.05）提高。在30 d時，沙蔥及其提取物組淀粉酶活性顯著提高。60 d時，脂提組、水提組淀粉酶活性顯著（P＜0.05）提高。

3 討論

3.1 沙蔥及其提取物對瘤胃微生物區(qū)系的影響

在反芻動物的瘤胃中棲息著數(shù)目龐大、種類復(fù)雜的各種微生物，主要包括細(xì)菌、原蟲和厭氧真菌。反芻動物主要依賴瘤胃內(nèi)的微生物能夠有效的消化和利用飼料中的各種營養(yǎng)物質(zhì)。細(xì)菌是瘤胃內(nèi)數(shù)量最多，功能最復(fù)雜的一類微生物，也是瘤胃內(nèi)最主要的消化營養(yǎng)物質(zhì)的微生物[16]。瘤胃內(nèi)的白色瘤胃球菌、黃色瘤胃球菌和產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌是主要的纖維分解菌，可產(chǎn)生大量的纖維素酶和半纖維素酶，在纖維降解過程中發(fā)揮重要的作用[17]。本試驗研究發(fā)現(xiàn)在肉羊飼糧中添加沙蔥及其提取物后顯著提高了肉羊瘤胃內(nèi)總細(xì)菌含量，可能原因是添加沙蔥及其提取物抑制了原蟲的數(shù)量從而影響其對細(xì)菌的吞噬能力，因此，瘤胃內(nèi)細(xì)菌大量增殖，利于改善纖維物質(zhì)在瘤胃內(nèi)的發(fā)酵和降解而提高其消化利用率。

表3 沙蔥及其提取物對肉羊瘤胃微生物區(qū)系的影響[lg(個/ml)]

表4 沙蔥及其提取物對肉羊瘤胃液消化酶活性的影響

瘤胃中各類微生物之間的協(xié)同作用下反芻動物得以分解利用飼料中的纖維物質(zhì)，其中細(xì)菌和真菌在降解纖維物質(zhì)過程中發(fā)揮了80%的作用[18]。反芻動物瘤胃內(nèi)厭氧真菌的數(shù)量及種類均少于細(xì)菌，但其可對粗飼料的纖維組織結(jié)構(gòu)進(jìn)行破壞，打開細(xì)菌進(jìn)入纖維的通道，因此在瘤胃內(nèi)纖維消化過程中占據(jù)主導(dǎo)地位[19]。據(jù)Joblin 報道，瘤胃液真菌產(chǎn)生的纖維素酶的活性高于瘤胃纖維素分解菌產(chǎn)生的酶[20]。厭氧真菌可釋放降解纖維的關(guān)鍵酶，并產(chǎn)生酯酶及木質(zhì)素酶，因此對維護(hù)瘤胃功能方面起著重要作用[21]。張霞[22]研究發(fā)現(xiàn)在綿羊飼糧中添加沙蔥水溶性提取物后顯著提高了真菌的數(shù)量，與本試驗結(jié)果一致，可能原因是沙蔥水溶性提取物提高了真菌生長所需要的氮源銨根離子和氨基酸濃度，從而使真菌數(shù)量增加。

原蟲是瘤胃內(nèi)微生物的重要組成部分，主要通過物理作用破壞纖維結(jié)構(gòu)，同時可分泌纖維素降解酶[23]。Coleman等[24]研究表明內(nèi)毛蟲等個體較大的原蟲能夠吞噬和消化纖維素，并利用纖維素的降解產(chǎn)物合成其細(xì)胞內(nèi)的多糖。瘤胃微生物種類和數(shù)量主要受動物品種、日糧結(jié)構(gòu)、環(huán)境、日糧添加物等因素的影響。趙春艷[25]研究指出，在綿羊飼糧中添加沙蔥能夠有效抑制原蟲數(shù)量，從而使細(xì)菌合成MCP 的量增加。趙國芬[26]通過在綿羊飼糧中添加4%沙蔥發(fā)現(xiàn)纖毛蟲的數(shù)量顯著減少。本試驗研究發(fā)現(xiàn)在肉羊飼糧中添加沙蔥可顯著降低瘤胃原蟲數(shù)量，與上述研究結(jié)果一致，可能原因是添加沙蔥破壞了原蟲的生活環(huán)境或者直接作用于原蟲，從而導(dǎo)致原蟲數(shù)量降低。

3.2 沙蔥及其提取物對瘤胃內(nèi)纖維素酶活性的影響

反芻動物瘤胃內(nèi)纖維類物質(zhì)主要依靠瘤胃內(nèi)微生物分泌的各種酶進(jìn)行分解和消化，進(jìn)而被宿主動物所利用，因此反芻動物瘤胃微生物對飼料的利用效率較大程度上取決于瘤胃微生物酶的活性。瘤胃微生物產(chǎn)生的纖維素酶包括內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶及β-葡萄糖苷酶，在這3 種酶的協(xié)同作用下才能降解纖維的結(jié)晶結(jié)構(gòu)，上述酶的活性可以更準(zhǔn)確的反映出瘤胃內(nèi)微生物對纖維物質(zhì)的利用和合成MCP的能力[27]。

羧甲基纖維素酶是一種內(nèi)切葡聚糖酶，可將纖維素分解為葡萄糖和纖維二糖，所有纖維素分解菌均能產(chǎn)生此酶。張霞[22]研究發(fā)現(xiàn)，在綿羊飼糧中添加沙蔥和沙蔥提取物顯著提高了羧甲基纖維素酶的活性，本試驗也得出類似的結(jié)果，在肉羊飼糧中添加沙蔥及其提取物能顯著提高肉羊瘤胃內(nèi)羧甲基纖維素酶活性，這表明添加沙蔥及其提取物可加快飼料纖維物質(zhì)的降解速度，提高纖維的初始消化率。木聚糖酶主要由瘤胃內(nèi)黃色瘤胃球菌和白色瘤胃球菌產(chǎn)生，是一組能夠水解木聚糖的多酶復(fù)合體，包括內(nèi)切β-1，4木聚糖酶、外切β-1，4木聚糖酶和β-木糖苷酶。β-葡萄糖苷酶又稱為二糖水解酶，可水解纖維二糖，芳基-β-葡萄糖苷酸而產(chǎn)生葡萄糖等終產(chǎn)物。濾紙纖維素酶活性是內(nèi)外切葡聚糖酶和葡萄糖甘酶協(xié)同作用的結(jié)果，是瘤胃總纖維素酶活的衡量指標(biāo)。微晶纖維素酶是表明纖維酶解效率的重要指標(biāo)，其活性可反映瘤胃內(nèi)多種酶活性。果膠酶可將植物中果膠分解為β-半乳糖醛酸，其本質(zhì)是聚半乳糖醛酸水解酶。本試驗研究結(jié)果顯示，在肉羊日糧中添加沙蔥及其提取物能顯著提高木聚糖酶活性，這與前人研究結(jié)果一致[22],可能原因是飼糧中添加沙蔥及其提取物提高了瘤胃內(nèi)TVFA的濃度，TVFA釋放的能量充足，微生物分解飼糧產(chǎn)生的NH3-N 與能量的供應(yīng)水平最適宜微生物的生長繁殖，MCP 濃度的增加又進(jìn)一步改善瘤胃發(fā)酵，所以纖維分解菌分泌的酶活性提高。

3.3 沙蔥及其提取物對瘤胃內(nèi)淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶活性的影響

提高消化酶活性可加快營養(yǎng)物質(zhì)的降解速率，為反芻動物提供更多的可吸收和利用的營養(yǎng)物質(zhì)，進(jìn)而提高反芻動物的營養(yǎng)物質(zhì)消化率、飼料利用率和生產(chǎn)性能。瘤胃微生物分泌的淀粉酶可將瘤胃內(nèi)大部分淀粉水解為麥芽糖，降解所得的麥芽糖轉(zhuǎn)化為VFA為機(jī)體提供能量[28]，其活性的高低直接決定著飼料中可溶性碳水化合物的分解程度[29]。瘤胃內(nèi)牛鏈球菌、丁酸梭菌及嗜淀粉瘤胃桿菌是主要的淀粉分解菌，能夠分泌較強(qiáng)活性的淀粉酶[30]。有研究表明瘤胃內(nèi)大部分內(nèi)毛蟲和瘤胃厭氧真菌也具有分解淀粉的能力[31]。本試驗研究發(fā)現(xiàn)，添加沙蔥及其提取物可顯著提高肉羊瘤胃內(nèi)淀粉酶活性，可能是由于沙蔥及其提取物通過促進(jìn)瘤胃纖維分解菌的生長[10]，提高了粗飼料的消化率，進(jìn)而使各種碳水化合物顯著增加，提高了淀粉酶的活性。

瘤胃液中含有少量的脂肪酶，能夠參與飼料中脂類物質(zhì)的消化和代謝，外源脂肪需經(jīng)過脂肪酶的消化分解后才能透過細(xì)胞膜，體內(nèi)脂肪的儲存、動用和細(xì)胞內(nèi)的脂類代謝都需要脂肪酶的參與。脂肪酶先將脂肪水解為甘油和脂肪酸，水解產(chǎn)物再進(jìn)入小腸黏膜細(xì)胞被進(jìn)一步消化利用[32]。本試驗研究發(fā)現(xiàn)在肉羊飼糧中添加沙蔥及其提取物顯著提高了瘤胃液脂肪酶活性，這與趙春艷[25]和趙國芬[26]的研究結(jié)果一致。

瘤胃內(nèi)降解蛋白質(zhì)的微生物較多，但真菌和原蟲對蛋白質(zhì)的降解能力較弱，溶纖維丁酸弧菌、棲普雷沃氏菌和嗜淀粉擬桿菌的數(shù)量多且活性強(qiáng)，對瘤胃內(nèi)蛋白質(zhì)降解具有重要作用[33]。姜衛(wèi)紅[34]通過一系列的研究指出蛋白酶在瘤胃內(nèi)pH 值為7.0 時活性最高。本試驗研究發(fā)現(xiàn)在肉羊飼糧中添加沙蔥及其提取物，瘤胃內(nèi)蛋白酶活性沒有顯著變化，原因可能是蛋白酶的活性較穩(wěn)定，不易變化[30，33，35]。

4 結(jié)論

①飼糧中添加沙蔥及其提取物能夠促進(jìn)肉羊瘤胃總細(xì)菌和總厭氧真菌的生長，同時降低瘤胃原蟲的數(shù)量。

②飼糧中添加沙蔥及其提取物能夠促進(jìn)瘤胃內(nèi)纖維素酶、淀粉酶、脂肪酶的分泌和活性的提高。

③沙蔥及其提取物能夠影響瘤胃微生物區(qū)系，且提高瘤胃液相關(guān)消化酶的活性。