蔣寧寧 郭奉楊 史立群 徐輝

1.吉林大學藥學院再生醫(yī)學科學研究所，吉林 長春 130021 2.內(nèi)蒙古自治區(qū)鄂倫春自治旗阿里河社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心，內(nèi)蒙古 鄂倫春165450

骨質(zhì)疏松是一種以骨量低為特點的代謝性骨病變，而骨量的減少與骨重建過程聯(lián)系緊密[1]。在骨重建過程中，成骨細胞、破骨細胞分別負責骨形成和骨吸收，來穩(wěn)定骨骼的結(jié)構(gòu)[2]。骨細胞通過響應(yīng)機械應(yīng)力發(fā)送的信號來調(diào)節(jié)骨吸收或骨形成，在骨重建的作用是其主要功能。眾多研究發(fā)現(xiàn)，氟化物對成骨細胞、破骨細胞的分化起著重要作用[3-4]，成骨細胞的增殖速率決定著骨形成速率，破骨細胞的數(shù)量及活性決定了骨吸收速率，二者的動態(tài)平衡決定骨代謝的平衡[5]。研究證明，氟化物過量可引起骨組織細胞和骨基質(zhì)的礦化缺陷，導(dǎo)致骨代謝平衡失調(diào)，引發(fā)骨質(zhì)疏松等全身性的骨骼疾病[6-7]。迄今為止，不同劑量氟對骨細胞活性影響的研究報道很少，尤其是平行研究不同氟濃度下骨組織中3種主要細胞的活性變化還未見報道。因此，本研究探究不同氟濃度對3種細胞活性的影響，分析3種細胞染氟時間不同細胞活性的變化情況，進而為研究氟骨癥中的骨代謝提供重要依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 3種細胞的來源及誘導(dǎo)培養(yǎng)

1.1.1小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞系(bone marrow mesenchymal stemcells，BMSCs)分離和培養(yǎng)：6～8周齡的ICR小鼠購自吉林大學動物實驗中心。將小鼠麻醉、脫頸處死后投入裝有75%乙醇的燒杯內(nèi)消毒1～3 min。無菌條件下取出股骨和脛骨，去除骨膜及周圍組織，用無菌PBS反復(fù)沖洗骨髓腔，直到骨髓腔發(fā)白為止，收集沖洗下的細胞懸液1 200 r/min，離心5 min。將沉淀的細胞重懸，種于培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5% CO2及飽和濕度條件的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，48 h后更換培養(yǎng)液，漂洗去除未貼壁細胞。將細胞傳至第3代，經(jīng)流式細胞儀鑒定細胞表面抗原CD34和CD44表達陽性的細胞數(shù)占94.6%，確認培養(yǎng)的細胞為BMSCs。BMSCs用10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、50 mg/L維生素C、40 ng/mL地塞米松進行礦化誘導(dǎo)，使其成為成骨細胞。而成骨細胞需要經(jīng)過4 d后才能進入分化狀態(tài)，所以待細胞長至對數(shù)期以2×104個/mL的密度接種于3個96孔板，待細胞均貼壁后，按照空白對照、低氟濃度(0.1、0.5、1、2 mg/L)、中氟濃度(4、8 mg/L)、高氟濃度(16、32 mg/L)8個濃度染氟，在細胞培養(yǎng)1、2、4 d后在570 nm波長下使用賽默飛世爾Multiskan FC酶標儀檢測。

1.1.2小鼠單核巨噬細胞系RAW264.7：RAW264.7細胞株購自中國醫(yī)學科學院細胞庫。將RAW264.7細胞接種于含5%胎牛血清及1%雙抗的α-MEM培養(yǎng)液中，待細胞長至對數(shù)期以2×104個/mL的密度接種于3個96孔板，待細胞均貼壁后用25 ng/mL RANKL誘導(dǎo)3～5 d使其成為破骨細胞。分別加入不同濃度F-濃度(與上同)，置于37 ℃、5% CO2及飽和濕度條件的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。在細胞培養(yǎng)1、2、4 d后在570 nm波長使用賽默飛世爾Multiskan FC酶標儀檢測。

1.1.3骨細胞系IDG-SW3：IDG-SW3細胞由Indiana大學醫(yī)學院的Lynda F.Bonewald教授贈與。將IDG-SW3細胞接種在鋪有膠原基質(zhì)的培養(yǎng)瓶里，并在含有4 mmol/L β-甘油磷酸鈉、50 μg/mL維生素C的α-MEM培養(yǎng)液中進行礦化誘導(dǎo)，使其表達骨細胞標志硬化蛋白后，確認成為骨細胞。骨細胞作為成骨細胞的終末成熟細胞，在1～4 d觀察該種細胞的代謝改變。將細胞以2×104個/mL的密度接種于3個96孔板，待細胞均貼壁后，按實驗分組分別加入F-至終氟濃度(與上同)，置于37 ℃、5% CO2及飽和濕度條件的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。在細胞培養(yǎng)1、2、4 d后在570 nm波長下使用賽默飛世爾Multiskan FC酶標儀檢測。

1.2 試劑與儀器

α-MEM、DMEM、PBS(Hyclone公司，美國)，胎牛血清(天杭生物科技股份有限公司，中國)，β-甘油磷酸鈉、維生素C、Collagen Type I Rat Tail、MTT、氟化鈉(Sigma-Aldrich，美國)，二甲基亞砜DMSO(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責任公司，中國)，酶標儀(賽默飛世爾上海儀器有限公司，型號 Multiskan FC)。

1.3 MTT法檢測不同氟濃度對3種不同的細胞活性

細胞培養(yǎng)結(jié)束后，PBS洗3次去除細胞分化誘導(dǎo)液，待測孔每孔加入180 μL的DMEM和20 μL的 5 mg/mL的MTT溶液，37 ℃孵育4 h后小心吸出培養(yǎng)上清液，每孔加入150 μL DMSO，低速振蕩10 min，使用酶標儀測定各孔吸光度值，重復(fù)3次檢測。

1.4 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

如表1所示，3種細胞給予不同氟化物濃度處理1 d后，與對照組相比，高氟濃度對3種細胞均有抑制作用，其中32 mg/L組較16 mg/L組抑制作用更為顯著。當3種細胞暴露于32 mg/L時，與對照組相比，骨細胞活性下降了22.6%，而破骨細胞和成骨細胞活性分別下降了94.1%和94.6%，呈現(xiàn)出明顯的抑制作用。由此可以看出，高氟濃度16 mg/L、32 mg/L對3種細胞有顯著的毒性抑制作用。

組別 IDG-SW3 cellsRAW264.7 cellsBMSCs cells空白對照0.354±0.0300.443±0.0790.444±0.0570.1 mg/L0.371±0.0180.410±0.0930.385±0.0720.5 mg/L0.347±0.0190.408±0.0430.446±0.1111 mg/L0.327±0.0300.431±0.0990.426±0.0292 mg/L0.329±0.0220.442±0.0550.421±0.0854 mg/L0.341±0.0220.423±0.0820.477±0.1788 mg/L0.340±0.0250.417±0.0600.392±0.073??16 mg/L0.338±0.0220.224±0.052??0.171±0.059??32 mg/L0.274±0.016??0.026±0.010??0.025±0.010??

注：與對照組相比較，**P<0.01。

隨著投氟時間增加到2 d，如表2所示，低氟濃度提高骨細胞活性，尤其是0.5 mg/L和1 mg/L促進作用明顯。與對照組相比，細胞活性均增加了8%。中氟濃度8 mg/L抑制破骨細胞和成骨細胞的活性，細胞活性分別下降了26.7%和29.7%。而高氟濃度16 mg/L和32 mg/L對破骨細胞和成骨細胞活性的抑制作用更加明顯，就16 mg/L而言，兩種細胞活性均下降了91.7%，而骨細胞活性則下降了5.3%。結(jié)果說明骨細胞對高劑量的氟耐受力明顯比破骨細胞和成骨細胞強。

組別IDG-SW3 cellsRAW264.7 cellsBMSCs cells空白對照0.547±0.0380.833±0.0950.496±0.0590.1 mg/L0.579±0.0250.832±0.1100.490±0.0400.5 mg/L0.591±0.037?0.776±0.1170.531±0.0621 mg/L0.591±0.039?0.801±0.1000.502±0.0972 mg/L0.528±0.0340.772±0.0680.492±0.0834 mg/L0.539±0.0380.756±0.0780.462±0.0768 mg/L0.560±0.0210.611±0.111??0.299±0.073??16 mg/L0.518±0.0250.069±0.020??0.041±0.022??32 mg/L0.240±0.030??0.017±0.002??0.011±0.003??

注：與對照組相比較，*P<0.05，**P<0.01。

投氟時間增加到4 d時，如表3所示，低氟濃度對骨細胞和破骨細胞活性促進作用較明顯，當這兩種細胞暴露于0.1 mg/L時，與對照組相比，骨細胞活性增加了8.8%，破骨細胞活性增加了16%。骨細胞的活性在0.1～2 mg/L氟處理下顯著增高，1～4 mg/L氟處理下的破骨細胞的活性也明顯比對照組高。然而，成骨細胞只有在0.1 mg/L和0.5 mg/L作用下細胞活性輕度提高了，隨著氟濃度增加成骨細胞活性也隨之下降。當3種細胞暴露于16 mg/L 4 d后，與對照組相比，骨細胞活性下降了8.6%，而破骨細胞和成骨細胞活性則分別下降了90.8%和97.2%。3種細胞染氟4 d的活性充分顯示了低劑量氟對破骨細胞和骨細胞的刺激作用，而高劑量氟對破骨細胞和成骨細胞的顯著抑制作用。

組別IDG-SW3 cellsRAW264.7 cellsBMSCs cells空白對照0.697±0.0450.655±0.1220.643±0.0810.1 mg/L0.758±0.036?0.760±0.1420.693±0.0840.5 mg/L0.740±0.029?0.662±0.1030.653±0.0811 mg/L0.700±0.0460.845±0.085?0.552±0.0922 mg/L0.630±0.048?0.796±0.117?0.592±0.0734 mg/L0.649±0.0630.807±0.121?0.591±0.1008 mg/L0.700±0.0350.611±0.0430.295±0.124??16 mg/L0.637±0.054?0.060±0.009??0.018±0.005??32 mg/L0.085±0.036??0.007±0.003??0.012±0.005??

注：與對照組相比較，*P<0.05，**P<0.01。

3 討論

氟骨癥是指長期攝入過量氟化物引起氟中毒的一種慢性侵襲的全身性骨病。在氟骨癥發(fā)病過程中成骨細胞和破骨細胞表現(xiàn)出不同程度的活躍[8]，成骨細胞活性增強/破骨細胞活性減弱可能是骨硬化發(fā)生的原因。方瑤瑤等[9]發(fā)現(xiàn)BMSCs向成骨細胞分化，可以增強成骨細胞活性，有利于骨形成。在本實驗中，低濃度增強了成骨細胞的活性，成骨細胞在0.1 mg/L濃度下暴露4 d后，細胞活性提高了7.8%，提示了長期小劑量的氟可以刺激成骨細胞活性[10]。高氟濃度降低了BMSCs誘導(dǎo)的成骨細胞活性和破骨細胞活性，從而證明了大劑量的氟能夠?qū)е鹿琴|(zhì)疏松或骨硬化[10]。通過成骨細胞和破骨細胞活性可以預(yù)測骨丟失情況，本研究旨在分析3種細胞染氟后的活性變化，實驗結(jié)果表明，氟化物對所有類型的細胞都有負面影響，但破骨細胞對低劑量和高劑量氟化物作用敏感。

近年來，越來越多的研究人員報告了氟化物對成骨細胞和破骨細胞的活性影響[3]，進而研究兩種細胞在骨代謝過程中的作用，但骨細胞在氟中毒中的作用研究較少。本研究采用IDG-SW3細胞經(jīng)礦化誘導(dǎo)使其分化為骨細胞，采用MTT法分析骨細胞的活性。研究數(shù)據(jù)表明，低劑量的氟提高骨細胞活性，氟暴露于0.5 mg/L濃度下2 d和4 d后細胞活性均有顯著性。中劑量中8 mg/L氟化物處理僅提高了骨細胞的活性，對成骨細胞和破骨細胞活性表現(xiàn)出抑制作用，高劑量中16 mg/L的氟化物使骨細胞活性下降了不到10%，但幾乎抑制了90%以上的破骨細胞和成骨細胞，這表明骨細胞不僅可以對低量氟刺激作用敏感，而且累積氟毒性具有很強的耐受性。

綜上所述，本研究通過骨組織中3種主要類型細胞染氟實驗研究，驗證了氟化物對3種細胞活性的雙重作用，即低氟濃度對破骨細胞和骨細胞的促進作用，高濃度氟對破骨細胞和成骨細胞的抑制作用。綜合3種細胞活性來看，氟對成骨細胞的刺激作用范圍最窄，而抑制作用顯著，破骨細胞對氟劑量的變化最敏感，而骨細胞對氟化物蓄積毒性的耐受性最強。本實驗結(jié)果為進一步研究慢性氟骨癥骨病變提供了重要線索和依據(jù)。