(1.山東大學(xué)(威海)海洋學(xué)院， 山東 威海 264209)

鰻草(大葉藻，ZosteramarinaL.)是北半球溫帶海草的代表種[1]，鰻草海草場(chǎng)在近海生物多樣性的維持、水體自凈和“藍(lán)碳”儲(chǔ)存中發(fā)揮著重要的作用[2-3]。然而近一個(gè)世紀(jì)來，該種群在全球范圍內(nèi)嚴(yán)重退化[4]，其保護(hù)和修復(fù)研究已成為海洋生態(tài)系統(tǒng)恢復(fù)的主要內(nèi)容[5]。種子是鰻草生活史中的重要環(huán)節(jié)，實(shí)生苗對(duì)于其種群擴(kuò)張及修復(fù)等有重要的作用[6]，溫度是影響其種子萌發(fā)的重要因素[7]。中國(guó)對(duì)鰻草的研究?jī)H有十幾年歷史，對(duì)其種子萌發(fā)特性的研究也較少。本研究以威海雙島灣鰻草種子為研究對(duì)象，探究野外環(huán)境鰻草種子的萌發(fā)時(shí)間和萌發(fā)溫度以及室內(nèi)低溫保存時(shí)長(zhǎng)和萌發(fā)溫度對(duì)其萌發(fā)率和初始發(fā)時(shí)間等萌發(fā)參數(shù)的影響，以期為中國(guó)的鰻草研究以及該種群的區(qū)域保護(hù)和恢復(fù)提供參考。

1 材料與方法

1.1 種子收集

于2013年7月中旬在山東省威海市雙島灣海域(37°20.3′N，122°33.2′E)采集鰻草種子。將種子即將成熟散落的鰻草花枝裝入20目的篩絹網(wǎng)兜中，扎緊網(wǎng)兜口后直接懸于該海域，于8月下旬收集自然脫落于網(wǎng)袋中的種子，部分種子就地用于野外萌發(fā)試驗(yàn)，剩余的就地清洗后裝于天然海水中帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行室內(nèi)種子萌發(fā)實(shí)驗(yàn)。

1.2 種子萌發(fā)

1.2.1野外種子萌發(fā)

2013年8月下旬，挑選健康、飽滿、成熟的種子，分別種植于漏底的塑料花盆內(nèi)(直徑12 cm)，花盆埋于威海雙島灣東側(cè)潮間帶底泥中。每個(gè)花盆50粒種子，共27盆，花盆外部用20目的篩絹網(wǎng)扎好，以防種子漏出，種子種植深度為2 cm。至2014年5月間每間隔30 d取出3盆進(jìn)行發(fā)芽檢驗(yàn)，并測(cè)量實(shí)生苗的枝長(zhǎng)、葉片數(shù)、葉寬、根數(shù)和根長(zhǎng)。實(shí)驗(yàn)期間用HOBO水溫測(cè)定儀(美國(guó)Onset公司生產(chǎn))測(cè)定水溫。

1.2.2室內(nèi)種子萌發(fā)

對(duì)帶回實(shí)驗(yàn)室的種子立即進(jìn)行挑選，選出健康、飽滿、成熟的種子，進(jìn)行如下萌發(fā)實(shí)驗(yàn)：先將種子在5 ℃天然海水(鹽度約為33‰，以下同)環(huán)境中黑暗靜置保存30 d、60 d和90 d后，轉(zhuǎn)至不同溫度梯度(5 ℃、15 ℃和25 ℃)的天然海水中進(jìn)行萌發(fā)實(shí)驗(yàn)。

萌發(fā)前對(duì)供試種子做如下消毒處理：用滅菌海水沖洗3～5次；70% 乙醇浸泡15 s，滅菌海水沖洗3次；20%過氧化氫浸泡20 min，滅菌海水再反復(fù)沖洗3～5次。每個(gè)處理設(shè)5次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)30粒消毒種子，種子置于含有50 mL海水的100 mL三角瓶中，于光照培養(yǎng)箱(上海博訊 SPX-250 B-G型)中進(jìn)行黑暗靜置培養(yǎng)，5 ℃處理在冰箱中進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)期間，每天觀察種子萌發(fā)情況，每2 d換水1次，實(shí)驗(yàn)共持續(xù)30 d。當(dāng)種皮開裂、露出下胚軸和子葉時(shí)即視為發(fā)芽[8]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

室內(nèi)實(shí)驗(yàn)通過每日觀察種子萌發(fā)情況來計(jì)量種子最終萌發(fā)率、初始萌發(fā)時(shí)間和萌發(fā)高峰時(shí)間。累計(jì)萌發(fā)率(%)=(實(shí)驗(yàn)期間累計(jì)正常發(fā)芽種子粒數(shù)/供試種子總數(shù))×100%；初始萌發(fā)時(shí)間為第一粒種子萌發(fā)所經(jīng)歷的天數(shù)，萌發(fā)高峰時(shí)間為種子累計(jì)萌發(fā)率達(dá)到高峰時(shí)的對(duì)應(yīng)天數(shù)。野外實(shí)驗(yàn)每30 d統(tǒng)計(jì)種子萌發(fā)量，并計(jì)算種子萌發(fā)率。

統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)在SPSS 17.0軟件中進(jìn)行。以單因素方差分析法對(duì)自然海域不同月份間種子萌發(fā)率進(jìn)行組間差異分析，以雙因素方差分析法對(duì)室內(nèi)低溫保存時(shí)長(zhǎng)和萌發(fā)溫度對(duì)種子萌發(fā)率的影響進(jìn)行分析；若兩因素交互作用顯著，則對(duì)每一保存時(shí)長(zhǎng)下不同萌發(fā)溫度間和同一萌發(fā)溫度下不同保存時(shí)長(zhǎng)間分別進(jìn)行單因素方差分析。單因素方差齊性時(shí)，采用LSD檢驗(yàn)比較分析組間差異；方差不齊時(shí)，采用Dunnett’s T 3進(jìn)行組間差異的多重比較。以p<0.05作為差異顯著水平，p<0.001為差異極顯著水平。數(shù)據(jù)整理和繪圖在Excel 2013軟件中完成，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié) 果

2.1 自然海域鰻草種子萌發(fā)特征

埋于雙島灣海域的鰻草種子在2013年9月至2014年1月期間無萌發(fā)跡象，種子從2月末開始萌發(fā)， 2月、3月、4月和5月的種子累積萌發(fā)率分別為2.1%、6.8%、14.2%和20.6%，不同月份間萌發(fā)率差異顯著，兩兩比較后，僅4月和5月間差異不顯著(圖1)。實(shí)驗(yàn)期間海域日均水溫從8月13日的最高溫(27.7 ℃)降至2月10日的最低溫(-1.5 ℃)，隨后又逐漸升高至實(shí)驗(yàn)結(jié)束期的17.3 ℃(5月27日)，期間日均溫低于5 ℃的累計(jì)日數(shù)為64 d。實(shí)驗(yàn)期間雙島灣鰻草種子的萌發(fā)溫度范圍為4～17 ℃，2月下旬首次觀察到種子發(fā)芽時(shí)水溫為4.1 ℃，此時(shí)海域日均水溫<5 ℃、5～10 ℃、10～15 ℃、15～20 ℃和>20 ℃的累計(jì)日數(shù)分別為53 d、30 d、25 d、22 d和71 d(圖2)。可見，鰻草種子萌發(fā)前的確經(jīng)歷過一個(gè)較長(zhǎng)的高溫期和低溫期。

實(shí)生苗在2月和3月水溫較低(4～6 ℃)時(shí)僅有子葉，無真葉和根發(fā)出，枝長(zhǎng)分別為1.3 cm和1.6 cm；4月底有根和真葉發(fā)出，且枝長(zhǎng)顯著增加，達(dá)4.2 cm；5月底時(shí)真葉數(shù)增至2.3片，枝長(zhǎng)和根長(zhǎng)快速增加，分別達(dá)10.4 cm和5.4 cm，但葉片數(shù)、葉寬和根數(shù)并無顯著增加。4—5月期間實(shí)生苗開始快速生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)的水溫為6～17 ℃(表1)。

圖1 雙島灣海域鰻草種子的累積萌發(fā)率

圖2 雙島灣2013年8月至2014年5月日均水溫

表1 雙島灣鰻草實(shí)生苗生長(zhǎng)發(fā)育形態(tài)特征(n=4-30)

時(shí)間枝長(zhǎng)/cm葉片數(shù)葉寬/cm根數(shù)根長(zhǎng)/cm2月1.3±0.1a----3月1.6±0.2a----4月4.2±1.4b1.1±0.70.11±0.12.0±0.12.6±0.2a5月10.4±0.5c2.3±0.30.14±0.93.9±0.25.4±0.6b

2.2 溫度對(duì)鰻草種子萌發(fā)的影響

5 ℃低溫保存30 d的種子僅在25 ℃條件下有萌發(fā)，但萌發(fā)率極低，僅為1.2%；低溫保存60 d和90 d后的種子在5 ℃、15 ℃和25 ℃條件下的萌發(fā)率分別為3.1%、8.7%、6.7%和8.3%、18.5%和13.6%(圖3)。雙因素方差分析表明，不同低溫保存時(shí)長(zhǎng)和萌發(fā)溫度條件下的種子萌發(fā)率差異極顯著(p<0.001)，兩因素的交互作用也極顯著(p<0.001)。多重比較后發(fā)現(xiàn)，同一萌發(fā)溫度下不同低溫保存時(shí)長(zhǎng)之間均差異顯著(p<0.05)，即低溫保存時(shí)間越長(zhǎng)，其萌發(fā)率越高；除了低溫保存60 d后于15 ℃和25 ℃培養(yǎng)萌發(fā)率無明顯差別外，同一保存時(shí)長(zhǎng)后不同萌發(fā)溫度的種子萌發(fā)率也差異顯著(p<0.05)，以萌發(fā)溫度15 ℃條件下萌發(fā)率最高(圖3)?？梢?，相較于萌發(fā)溫度5 ℃，其余2個(gè)萌發(fā)溫度均可有效提升種子的萌發(fā)率，但低溫保存時(shí)間較短的30 d 種子萌發(fā)率最低，而保存90 d后15 ℃條件下的萌發(fā)率最高。進(jìn)一步證明較長(zhǎng)時(shí)間的低溫保存可有效促進(jìn)鰻草種子萌發(fā)，相較于5 ℃和25 ℃，15 ℃是其種子萌發(fā)的適宜溫度。

注：大寫字母代表組間差異顯著 (p<0.05), 小寫字母代表組內(nèi)差異顯著 (p<0.05)。圖3 5 ℃保存30 d、60 d和90 d后在3個(gè)溫度條件下 鰻草種子的萌發(fā)率

鰻草種子的初始萌發(fā)時(shí)間和萌發(fā)高峰時(shí)間隨低溫保存時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著變短，低溫保存30 d后，25 ℃條件下的初始萌發(fā)時(shí)間和萌發(fā)高峰時(shí)間均為25.1 d；保存60 d后3個(gè)溫度條件下的兩指標(biāo)均大于15 d；而保存90 d后3個(gè)溫度條件下的初始萌發(fā)時(shí)間和萌發(fā)高峰時(shí)間則均小于3 d和8 d(表2)。

表2 萌發(fā)溫度和低溫保存時(shí)長(zhǎng)對(duì)鰻草種子的初始萌發(fā)時(shí)間和萌發(fā)高峰時(shí)間的影響

萌發(fā)溫度/℃保存時(shí)長(zhǎng)/d初始萌發(fā)時(shí)間/d萌發(fā)高峰時(shí)間/d530--1530--253025.1±1.7a25.1±1.6a56018.5±3.3a20.5±1.9a156021.7±3.4a26.4±2.8a256015.5±0.3b19.4±4.4b5902.3±0.3c7.9±0.6c15902.6±0.2c4.2±0.5c25901.9±0.3c4.6±0.5c

3 討 論

溫度是影響植物種子萌發(fā)的主要生態(tài)因子之一，許多學(xué)者對(duì)鰻草種子萌發(fā)進(jìn)行了野外調(diào)查和室內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究，重點(diǎn)關(guān)注了其初始萌發(fā)溫度、萌發(fā)季節(jié)、萌發(fā)溫度范圍和最適萌發(fā)溫度等(表3)。多數(shù)自然海域的鰻草種子于秋季開始萌發(fā)，萌發(fā)期一般跨越秋末、冬、春三季，萌發(fā)期可長(zhǎng)達(dá)2～8個(gè)月，月萌發(fā)溫度從0～20 ℃不等(表3)。加拿大Nova Scotia、韓國(guó)Jindong Bay、美國(guó)Chesapeake bay、美國(guó)Long Island和墨西哥Gulf of California 5個(gè)海域的鰻草種子初始萌發(fā)的時(shí)間(水溫)分別為：10月(11 ℃)、11月(15 ℃)、9月末10月初(約18 ℃)、9月末(15 ℃)和10月(約20 ℃)，它們的種子萌發(fā)溫度范圍(時(shí)間)分別為0～10 ℃(10—1月和4—5月)、5～15 ℃(11—3月)、3～18 ℃(10—5月)、10～13 ℃(9月末—5月)和16～20 ℃(11—12月)(表3)；相較于以上這些海域，本研究地威海雙島灣和鄰近的榮成天鵝湖的鰻草種子休眠期長(zhǎng)達(dá)近7個(gè)月，萌發(fā)期較短(2月底—5月)，初始萌發(fā)溫度較低，僅為4 ℃。表3數(shù)據(jù)顯示，鰻草種子萌發(fā)對(duì)高溫和低溫都有明顯的規(guī)避現(xiàn)象，除北極圈附近外，其它海域的種子都存在夏季高溫休眠期，以度過7—8月的25 ℃左右高溫逆境，在一些冬季水溫較低的海域，如中國(guó)黃海的威海雙島灣和榮成天鵝湖以及加拿大Nova Scotia海域，冬季最低水溫低于0 ℃，鰻草種子除高溫休眠外，還有冬季低溫休眠現(xiàn)象，而水溫未降到0 ℃以下的海域鰻草種子則無冬季休眠現(xiàn)象。

表3 全球不同海域鰻草種子的萌發(fā)期和萌發(fā)溫度差異

種子來源緯度 (°N)年水溫范圍/℃ 種子成熟月份(水溫℃)水域萌發(fā)月份萌發(fā)溫度/℃最大萌發(fā)率溫度/℃文獻(xiàn)來源Gulf of California, 墨西哥2915.0～32.44 (21)11—1216～20—[9]Ise Bay, 日本348.1～28.0[10]———10.0[7]Ago Bay,日本348.6～27.7[11]6 (20～23)[11]——15.0[12]Jindong Bay, 韓國(guó)354.5～28.05—611—35～15—[13]天鵝湖, 中國(guó)37-1.0～26.872—55～15—[14]雙島灣, 中國(guó)37-1.5～27.76—72—54～1715.0本研究Chesapeake bay, 美國(guó)373.0～25.05—6 (22～24)10—53～185.0～10.0[15]Long Island, 美國(guó)411.0～21.0[16]79—1210～1311.5[8]Nova Scotia, 加拿大44-1.5～23.06—710—1和 4—50～10—[17]Grevelingen, 荷蘭514.0～21.0[18]———10.0[19]

雖然初始萌發(fā)溫度各海域并不一致，但最適萌發(fā)溫度卻較為相近，均在10～15 ℃范圍內(nèi)。本研究與Xu等[20]和Pan等[21]的研究都證實(shí)，相較于5 ℃和25 ℃，15 ℃左右是中國(guó)黃海鰻草種子萌發(fā)的適宜溫度；本研究結(jié)果與之相符。此外日本的Ise Bay和Ago Bay海域，鰻草種子萌發(fā)的適宜溫度分別是10 ℃和15 ℃[6-7]，美國(guó)Long Island和荷蘭Grevelingen分別為11.5 ℃和10 ℃[8-19](表3)。10～15 ℃也是Setchell 經(jīng)過長(zhǎng)期多海域觀測(cè)指出的鰻草最佳營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)的溫度范圍[22]，可見，鰻草種子的適宜萌發(fā)水溫與其實(shí)生苗生長(zhǎng)的水溫相同。

鰻草在北半球分布廣泛，從北極圈附近的挪威海岸等海域到亞熱帶邊緣的墨西哥加利福尼亞灣，南北跨度約5 000 km，生存海域水溫差異較大，所以不同海域的鰻草種子萌發(fā)對(duì)水溫的季節(jié)變化有著不同的適應(yīng)策略(表3)，表現(xiàn)在以種子休眠來規(guī)避低溫和高溫逆境對(duì)實(shí)生苗生長(zhǎng)的傷害。不同海域種子初始萌發(fā)水溫和萌發(fā)溫度范圍要求不同、最適萌發(fā)溫度也略有差異，充分說明不同海域的鰻草種群在長(zhǎng)期適應(yīng)各自生存海域的水溫環(huán)境和季節(jié)變化中形成了獨(dú)特的表現(xiàn)型、甚至基因型，乃至在常年處于10 ℃以下低溫的格陵蘭島形成了成熟種子未萌發(fā)的適應(yīng)特性[23]。不論何種形式的休眠，都是植物在長(zhǎng)期的進(jìn)化中，對(duì)于相對(duì)穩(wěn)定的季節(jié)變化所形成的主動(dòng)適應(yīng)[24-25]。鰻草種子通過休眠，避開不利環(huán)境的迫害，在適宜溫度條件下萌發(fā)，隨后產(chǎn)生的幼苗在適宜溫度下生長(zhǎng)發(fā)育，也是其種群適應(yīng)逆境和保護(hù)物種延續(xù)的一種策略。有關(guān)鰻草種子休眠的機(jī)制還不太清楚，不同種群、不同生活史表現(xiàn)型(或不同基因型)的鰻草種子均可作為探究該種種子休眠機(jī)制的最佳材料。

本研究結(jié)果表明，低溫(5 ℃)保存可促進(jìn)鰻草種子的萌發(fā)，支持了Tanner等[26]和Morita等[6]認(rèn)為的鰻草種子低溫保存刺激可有效打破鰻草種子休眠的觀點(diǎn)，他們分別對(duì)美國(guó)Chesapeake和Ago海域的鰻草種子進(jìn)行了4 ℃條件下32 d和7 ℃條件下28 d的低溫處理，大大提升了種子的萌發(fā)率，其中Ago海域春化處理組的種子萌發(fā)率可達(dá)83%(未春化處理組僅40%)。本海域種子自然條件萌發(fā)前經(jīng)歷64 d的低溫，且室內(nèi)萌發(fā)更是低溫保存時(shí)間越長(zhǎng)，萌發(fā)率越高?？梢?，不同海域的鰻草種子可能存在不同的春化溫度和春化時(shí)長(zhǎng)，但有關(guān)其低溫春化的溫度和時(shí)長(zhǎng)卻尚不明確，值得進(jìn)一步研究。