穆成 王春花

質(zhì)譜是一種常用的定性和定量分析技術(shù)，通過將分析物轉(zhuǎn)化為氣態(tài)離子物質(zhì)，測量其質(zhì)荷比而得到質(zhì)譜圖，它可用于識別樣品的元素和核素，測量樣品純度，確定分子量，幫助識別物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)。1919年，英國科學(xué)家弗朗西斯·阿斯頓制成了世界上第一臺質(zhì)譜儀。此后，質(zhì)譜被廣泛應(yīng)用于幾乎所有科學(xué)研究領(lǐng)域，包括物理、化學(xué)、生物和醫(yī)學(xué)科學(xué)，成為研究分子世界的重要工具[1]。早期的質(zhì)譜，由于電離技術(shù)的限制，只能檢測耐熱的非生物分子。20世紀(jì)80年代電子噴霧電離和基質(zhì)輔助激光解吸電離的發(fā)展增加了質(zhì)譜對蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子的適用性。這兩者都基于“軟電離”方法，其離子形成過程不會導(dǎo)致樣品完整性的顯著損失。與電子噴霧電離質(zhì)譜相比，基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)具有一定的優(yōu)勢。MALDI-TOF MS產(chǎn)生單電荷離子，與電子噴霧電離質(zhì)譜相比，數(shù)據(jù)易于解釋。另外，電子噴霧電離質(zhì)譜分析需要事先通過色譜分離，而MALDI-TOF MS無需此步驟[2]。因此，具備高通量、高速度、自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)的MALDI-TOF MS成為大規(guī)模生物大分子研究工作的重要選擇。

隨著MALDI-TOF MS技術(shù)在癌癥[3]、心血管疾病[4]、肝臟相關(guān)疾病[5]等臨床領(lǐng)域研究取得顯著進(jìn)展，其在結(jié)核病研究領(lǐng)域的作用也日益凸顯。目前，結(jié)核病仍是全球重大傳染病之一，2017年，全球范圍內(nèi)WHO估算約有1000萬例新發(fā)結(jié)核病患者[6]。對于結(jié)核病，其發(fā)病機(jī)理、早期診斷、耐藥機(jī)制、細(xì)菌與宿主的相互關(guān)系、疫苗研發(fā)等方面還需要進(jìn)行大量的研究。MALDI-TOF MS可使人們對疾病發(fā)病得到更清晰的理解，為疾病的治療提供更有價(jià)值的信息。筆者針對MALDI-TOF MS在結(jié)核病基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用中的新進(jìn)展進(jìn)行綜述，以加強(qiáng)對MALDI-TOF MS在結(jié)核病研究領(lǐng)域的認(rèn)識。

一、MALDI-TOF MS與分枝桿菌菌種鑒定

目前，已知的分枝桿菌有190余種，其中最重要的是結(jié)核分枝桿菌。此外，非結(jié)核分枝桿菌引起的疾病也逐漸增多。臨床上對不同病原菌的治療方案不盡相同，因此快速準(zhǔn)確的分枝桿菌鑒定對選擇化療藥物、改善患者預(yù)后非常重要。然而，傳統(tǒng)的鑒定方法耗時(shí)長，鑒定效果差。近年來，核酸雜交、測序等方法已運(yùn)用于菌種鑒定，但操作復(fù)雜，成本較高。MALDI-TOF MS為分枝桿菌菌種鑒定提供了新的手段。Cao等[7]對國內(nèi)外19項(xiàng)MALDI-TOF MS分枝桿菌菌種鑒定研究進(jìn)行了Meta分析，涉及2593株分離株，MALDI-TOF MS鑒定結(jié)核分枝桿菌的符合率為92%(95%CI：87%～96%)，鑒定牛分枝桿菌的符合率為68%(95%CI：27%～100%)。李松等[8]收集55株非結(jié)核分枝桿菌菌株，利用rpoB進(jìn)行管家基因測序，并對測序結(jié)果進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析；同時(shí)利用MALDI-TOF MS對菌株進(jìn)行鑒定，并對蛋白指紋圖譜進(jìn)行聚類分析。結(jié)果顯示，MALDI-TOF MS對55株非結(jié)核分枝桿菌鑒定到屬的水平為89.1%，鑒定到種的水平為78.2%，鑒定水平良好。由于對近緣菌株的分辨率有限，以及標(biāo)準(zhǔn)菌株質(zhì)譜圖庫尚不能覆蓋所有分枝桿菌，MALDI-TOF MS的菌種鑒定結(jié)果可能與測序結(jié)果不一致，但通過自建臨床菌株質(zhì)譜圖庫，增加質(zhì)譜圖庫范圍，可以提高M(jìn)ALDI-TOF MS菌種鑒定的準(zhǔn)確性。有研究比較了MALDI-TOF MS、核酸雜交和MPT64免疫層析試驗(yàn)3種方法鑒定結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌的效果，以核酸雜交試驗(yàn)結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，MALDI-TOF MS鑒定的符合率為88%，鑒定時(shí)間需要45 min，檢測成本為3歐元/次，而使用核酸雜交需要6～7 h，檢測成本為30歐元/次[9]。以上研究表明，在分枝桿菌菌種鑒定中，MALDI-TOF MS速度快、成本低，具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值，但MALDI-TOF MS進(jìn)行菌種鑒定只能以純培養(yǎng)物為對象，不能直接對痰標(biāo)本進(jìn)行檢測，其在檢測敏感度上還有待進(jìn)一步提高。

二、MALDI-TOF MS與結(jié)核分枝桿菌耐藥性的研究

目前已知，結(jié)核分枝桿菌對抗結(jié)核藥物產(chǎn)生耐藥的原因包括耐藥相關(guān)基因突變、藥物外排泵的存在、外膜蛋白缺失等。盡管人們對結(jié)核分枝桿菌產(chǎn)生耐藥的機(jī)制有一定的了解，但是在結(jié)核分枝桿菌耐藥機(jī)制研究方面仍需要進(jìn)行大量工作。MALDI-TOF MS聯(lián)合二維凝膠電泳開展比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究，為闡明結(jié)核分枝桿菌耐藥背后的分子機(jī)制提供了新的手段。其原理是，培養(yǎng)敏感或耐藥菌株后裂解細(xì)菌，在合適的緩沖系統(tǒng)中提取細(xì)菌蛋白質(zhì)，將蛋白質(zhì)提取物進(jìn)行二維凝膠電泳。最后，將分離的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)在凝膠中消化，并將所得肽進(jìn)行MALDI-TOF MS分析。印度學(xué)者Singh等[10]通過二維凝膠電泳和MALDI-TOF MS分析，對接受抗結(jié)核藥物治療的同一例患者依次分離出的結(jié)核分枝桿菌菌株進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)研究，4株菌株經(jīng)過基因分型鑒定為同一基因型，排除再感染的可能。接受治療前分離的1株菌株藥物敏感性試驗(yàn)(簡稱“藥敏試驗(yàn)”)結(jié)果為，對4種一線藥物敏感；接受治療后分離的3株菌株藥敏試驗(yàn)結(jié)果為，對異煙肼和利福平耐藥，并且產(chǎn)生了katG、inhA和rpoB基因突變。蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，27個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)的強(qiáng)度在異煙肼和利福平抗性分離株中始終過表達(dá)，在耐藥性發(fā)展過程中發(fā)現(xiàn)的過表達(dá)最顯著和最有研究前景的蛋白質(zhì)是GarA(Rv1827)、wag31(Rv2145c)、Rv1437和Rv2970c。Lata等[11]通過二維凝膠電泳，MALDI-TOF MS和生物信息學(xué)工具評估結(jié)核分枝桿菌在氧氟沙星和莫西沙星等二線抗結(jié)核藥物作用下的蛋白質(zhì)組變化。結(jié)果顯示，在藥物存在下，結(jié)核分枝桿菌一些抗藥性蛋白質(zhì)即Rv3867和Rv3224過表達(dá)。經(jīng)過分析，這些是參與鐵代謝的蛋白質(zhì)，其在對二線藥物的抗性中起關(guān)鍵作用。Sharma等[12]還通過二維凝膠電泳結(jié)合MALDI-TOF MS分析了對氨基糖苷類(阿米卡星、卡那霉素)耐藥和敏感的結(jié)核分枝桿菌臨床分離株的比較蛋白質(zhì)組學(xué)。該研究確定了12種蛋白質(zhì)靶標(biāo)，這些靶標(biāo)在氨基糖苷類耐藥和敏感臨床分離株中存在表達(dá)差異。目前，MALDI-TOF MS主要用于篩選結(jié)核分枝桿菌耐藥相關(guān)蛋白，隨著研究的深入，未來可能發(fā)現(xiàn)某種結(jié)核分枝桿菌耐藥標(biāo)志性蛋白，為臨床檢測耐藥提供了新思路。

三、MALDI-TOF MS與血清標(biāo)志物的篩選

目前，臨床上結(jié)核病的診斷方法有多種，但是鮮有改善結(jié)核病診斷的新技術(shù)，使得結(jié)核病診斷方法陳舊。機(jī)體感染結(jié)核分枝桿菌后，通過固有免疫和獲得性免疫抵御病原菌，在相互作用過程中可能會引起宿主機(jī)體的病理生理改變，可以通過檢測這種變化，尋找肺結(jié)核的早期診斷方法。血清具有易獲得、非侵入性、對疾病的反應(yīng)快速等優(yōu)點(diǎn)，是疾病生物學(xué)標(biāo)志物的理想來源。Li等[13]收集了包括活動(dòng)性肺結(jié)核患者、肺炎患者和正常健康者在內(nèi)的336份人血清樣本。使用相對和絕對定量的同位素標(biāo)記(isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ)技術(shù)結(jié)合MALDI-TOF MS，鑒定差異表達(dá)蛋白，使用生物信息學(xué)方法分析數(shù)據(jù)。結(jié)果與對照組相比，在活動(dòng)性肺結(jié)核患者中識別出26種差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，包括16種過表達(dá)的蛋白質(zhì)和10種下調(diào)的蛋白質(zhì)，通過免疫組化、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)和Western blotting檢查，發(fā)現(xiàn)活動(dòng)性肺結(jié)核患者性激素結(jié)合球蛋白較對照組明顯升高，提示iTRAQ結(jié)合MALDI-TOF MS技術(shù)可有效篩選活動(dòng)性肺結(jié)核患者血清中差異表達(dá)的蛋白質(zhì)。性激素結(jié)合球蛋白被認(rèn)為是活動(dòng)性肺結(jié)核患者可能的新型血清生物標(biāo)志物。陳汐濛等[14]使用MALDI-TOF MS研究骨關(guān)節(jié)結(jié)核血清鑒別標(biāo)志物，收集臨床已確診的骨關(guān)節(jié)結(jié)核、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者和健康成年人體檢血清標(biāo)本，利用MALDI-TOF MS進(jìn)行質(zhì)譜檢測后使用相關(guān)軟件進(jìn)行血清多肽指紋圖譜數(shù)據(jù)分析，篩選差異較為明顯的蛋白質(zhì)多肽峰以建立診斷模型。結(jié)果顯示，通過軟件分析成功建立了以質(zhì)荷比2943.9、5929.6、7615.4、9033.8為差異蛋白多肽的骨關(guān)節(jié)結(jié)核與健康成年人診斷模型，以質(zhì)荷比4195.6、5847.6、5929.6、7748.6為差異蛋白多肽的骨關(guān)節(jié)結(jié)核與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的診斷模型。經(jīng)過驗(yàn)證，兩種模型的敏感度分別為95.00%和97.50%，特異度分別為85.71%和88.46%，準(zhǔn)確率分別為89.58%和92.39%，表明通過MALDI-TOF MS檢測血清蛋白多肽標(biāo)志物對于輔助診斷骨關(guān)節(jié)結(jié)核具有一定的參考價(jià)值。MALDI-TOF MS是研究蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子的有力工具，利用其篩選結(jié)核病相關(guān)的血清標(biāo)志物，建立輔助診斷模型，具有重要的臨床價(jià)值，但目前相關(guān)的文獻(xiàn)較少，還需進(jìn)一步深入研究。

四、MALDI-TOF MS與結(jié)核病易感基因多態(tài)性檢測

單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNP)是指在基因組上單個(gè)核苷酸的變異形成的遺傳標(biāo)記，包括置換、顛換、缺失和插入。其數(shù)量眾多，多態(tài)性豐富。一般而言，SNP是指變異頻率大于1%的單核苷酸變異。在人類基因組中，大概每1000個(gè)堿基就有一個(gè)SNP，人類基因組上的SNP 總量大概是3×106個(gè)。其中有些SNP可能與疾病的發(fā)生有關(guān)。研究表明，在結(jié)核分枝桿菌感染過程中，宿主遺傳易感基因SNP對炎癥因子的調(diào)控是結(jié)核病易感的重要機(jī)制[15]。SNP基因分型的常見方法有TaqMan探針法、SNaPshot法、MALDI-TOF MS、高分辨率熔解曲線(HRM)等技術(shù)平臺。周瑩等[16]使用MALDI-TOF MS探討Sp110基因rs11679983位點(diǎn)SNP與中國南方漢族人群肺結(jié)核的關(guān)聯(lián)性。結(jié)果顯示，肺結(jié)核患者中AG基因型和A等位基因頻率高于健康對照人群，表明Sp110基因rs11679983位點(diǎn)SNP與中國南方漢族人群肺結(jié)核相關(guān)，AG基因型和A 等位基因可能增加肺結(jié)核的易感性。汪文斐等[17]對比分析MALDI-TOF MS和TaqMan探針篩選與結(jié)核病易感性相關(guān)SNP。結(jié)果顯示，MALDI-TOF MS分型成功率為99.7%(698/700)，TaqMan探針技術(shù)為98.4%(689/700)，發(fā)現(xiàn)了IL-22基因rs2227473位點(diǎn)等位基因G可能與肺結(jié)核發(fā)病相關(guān)。俄羅斯學(xué)者Bragina等[18]使用MALDI-TOF MS對8個(gè)候選基因(CD79A、HCST、CXCR4、CD4、CD80、CP、PACRG和CD69)的SNP與結(jié)核病易感性進(jìn)行分析。結(jié)果表明，CD80基因rs1880661和PACRG基因rs10945890的SNP與俄羅斯人群中原發(fā)或繼發(fā)肺結(jié)核易感性相關(guān)。MALDI-TOF MS適合大規(guī)模樣本、多個(gè)SNP位點(diǎn)分型，每個(gè)載樣靶可一次加樣384個(gè)樣本，檢測1個(gè)樣本僅需幾秒鐘，并且能實(shí)現(xiàn)從點(diǎn)樣到分型均自動(dòng)化，具有快速、直接、準(zhǔn)確、高通量等優(yōu)點(diǎn)，是目前測定SNP最準(zhǔn)確的平臺之一，該方法憑借其科學(xué)性和準(zhǔn)確性已經(jīng)成為該領(lǐng)域的新標(biāo)準(zhǔn)。

五、MALDI-TOF MS與抗結(jié)核藥物代謝研究

使用MALDI-TOF MS對樣品進(jìn)行掃描，再配合專門的質(zhì)譜成像軟件，就可以實(shí)現(xiàn)MALDI-TOF MS成像(MALDI MSI)。1997年德國學(xué)者Caprioli等[19]首先提出MALDI-TOF MS成像概念，其后幾十年，該技術(shù)逐漸成熟，目前已廣泛應(yīng)用于生物標(biāo)志物的鑒定、定位和跟蹤，對闡明疾病生化途徑、病理機(jī)制等至關(guān)重要[20]。其原理是：在激光束的作用下直接對組織切片進(jìn)行掃描，組織切片中被解吸出的分子化合物被質(zhì)譜儀識別，獲得樣品上每個(gè)點(diǎn)的質(zhì)荷比信息，然后將所有質(zhì)譜數(shù)據(jù)經(jīng)平均化處理，在專門的質(zhì)譜成像軟件中獲得代表該區(qū)域內(nèi)化合物分布情況的完整影像。使用MALDI MSI技術(shù)，可以研究抗結(jié)核藥物在動(dòng)物組織中的分布。Prideaux等[21]分別使用液相微臨界表面取樣探針(LMJ-SSP)技術(shù)和MALDI MSI來評估結(jié)核感染兔的肺組織切片中左氧氟沙星的空間分布。在正常肺、肉芽腫組織和干酪樣壞死區(qū)，給藥后6 h左氧氟沙星水平達(dá)到高峰，藥物積聚在肉芽腫組織區(qū)域，含量高于干酪樣壞死區(qū)，MALDI MSI相較LMJ-SSP能提供更多細(xì)節(jié)。Prentice等[22]使用MALDI MSI技術(shù)實(shí)現(xiàn)新西蘭白兔肝組織中利福平的定性和定量分布分析。MALDI MSI技術(shù)為體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究提供了新的技術(shù)手段，在動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)中可以研究不同藥物的給藥方案在體內(nèi)的分布特點(diǎn)、作用效果及代謝時(shí)間，評估抗結(jié)核藥物的療效，以便優(yōu)化其使用。此外，MALDI-TOF MS還可以用于監(jiān)測結(jié)核病患者血漿中的乙胺丁醇、吡嗪酰胺、利福平、鏈霉素等藥物濃度[23]，以確定每例患者的最佳劑量方案，降低藥物不良反應(yīng)發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，縮短結(jié)核病的治療時(shí)間，改善耐藥結(jié)核病的治療效果，防止結(jié)核分枝桿菌耐藥性的產(chǎn)生。

六、展望

MALDI-TOF MS已經(jīng)成為生物大分子檢測領(lǐng)域的成熟技術(shù)，具有操作簡便、檢測快速等優(yōu)點(diǎn)，其在結(jié)核病領(lǐng)域的應(yīng)用也日益廣泛。但MALDI-TOF MS的發(fā)展同時(shí)也面臨一些挑戰(zhàn)，例如儀器的制造成本高，敏感度欠佳等。在研究樣品中結(jié)核相關(guān)生物分子的含量通常極低，因此，為了敏感地檢測這些生物分子，提高樣品的生物分子濃度是MALDI-TOF MS分析的先決條件。近年一些研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用基于納米材料的平臺預(yù)濃縮目標(biāo)分析物，有助于使用MALDI-TOF MS檢測低豐度物質(zhì)，提高檢測結(jié)核相關(guān)生物標(biāo)記物的分辨率和敏感度[24-25]?？梢灶A(yù)見，隨著新技術(shù)的不斷涌現(xiàn)和發(fā)展，MALDI-TOF MS將成為結(jié)核病研究領(lǐng)域的重要工具。