唐仕娟，苗金貝，陳艷琳，邵 婭，路 康，王森山

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院 / 甘肅省農(nóng)作物病蟲害生物防治工程實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730070）

齊墩果酸(oleanolic acid)是一種五環(huán)三萜類化合物，三萜類化合物在植物界中分布廣泛，主要是以游離體和配糖體的形式存在于多種植物中，如齊墩果酸、女貞(Ligustrum lucidum Ait)、大籽雪膽(Hemsleya macrosperma)等[1-2]。因?yàn)辇R墩果酸高效低毒，提取材料易獲得[3-4]，所以對(duì)三萜類物質(zhì)的研究越來越多，從藥理學(xué)方面的研究[5]逐漸延伸到對(duì)植物的自身保護(hù)、生理調(diào)節(jié)、生存競(jìng)爭(zhēng)及協(xié)調(diào)與環(huán)境的關(guān)系等方面[6-7]。有研究表明，大多數(shù)三萜類物質(zhì)如齊墩果酸具有植物抗真菌、細(xì)菌和病毒的功能，有的甚至表現(xiàn)出了抗線蟲的效果[8]。此外還有一些三萜類化合物常作為反抗病原真菌的物質(zhì)載體[9]，如葫蘆素能防止葫蘆科植物免受鐮刀菌(Fusarium)和盾葉薯蔬灰霉病(Botrytis cinerea)等的為害[10]。豌豆蚜是一種世界性害蟲，主要取食牧草和豆科植物，通過口器刺吸植物汁液，使得植物體內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被吸收，影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育、開花結(jié)實(shí)等正常的生命活動(dòng)[11]。此外，由于豌豆蚜的孤雌繁殖能力、爆發(fā)力強(qiáng)極易對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成嚴(yán)重危害[12]。豌豆蚜具有紅色和綠色兩種生態(tài)型，綠色型在全國(guó)都有分布[13]，目前紅色型僅在我國(guó)西部地區(qū)發(fā)現(xiàn)，并且紅色型種群占的比例在不斷地增加[14-15]。豌豆蚜體色不同應(yīng)對(duì)天敵等外界環(huán)境因素脅迫的能力方面也不同[16-18]。生態(tài)學(xué)研究表明，捕食性天敵更容易捕食綠色植物上的紅色型豌豆蚜，而寄生性天敵更容易攻擊綠色型豌豆蚜[19-20]。紅色型豌豆蚜較綠色型對(duì)殺蟲劑吡蟲啉的敏感性更高[21]。豌豆蚜體色不同體內(nèi)主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量也有所差異。如紅色型豌豆蚜體內(nèi)含有的碳水化合物和脂類較多，而綠色型豌豆蚜體內(nèi)蛋白質(zhì)含量較高，因此處于惡劣的環(huán)境條件下時(shí)，紅色型個(gè)體則具有足夠的能量轉(zhuǎn)變?yōu)橛谐嵫翉脑械膼毫迎h(huán)境進(jìn)行遷飛逃避[16,22]。不同色型豌豆蚜間所表現(xiàn)出的生物學(xué)特性不同，這是豌豆蚜對(duì)整個(gè)生活史進(jìn)行權(quán)衡后所呈現(xiàn)的一些適應(yīng)性特征，這些適應(yīng)性特征有利于提高蚜蟲在逆境中的適合度[23]。

王小強(qiáng)和劉長(zhǎng)仲[24]對(duì)阿維菌素亞致死劑量下兩種色型豌豆蚜解毒酶活力進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，2種色型豌豆蚜體內(nèi)AChE、GSTs和MFO比活力變化不但受阿維菌素不同亞致死劑量的影響，而且表現(xiàn)出明顯的時(shí)間效應(yīng)。從基因組學(xué)的方向?qū)ν愣寡恋纳头只M(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，豌豆蚜的基因表達(dá)和體色多態(tài)性之間存在聯(lián)系[25]。在人工飼料中添加單寧酸處理兩種色型的豌豆蚜，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，單寧酸對(duì)綠色型的抑制作用要比紅色型的強(qiáng)[26]?；瘜W(xué)農(nóng)藥防治蚜蟲由來已久，由于長(zhǎng)期大量地使用，蚜蟲的抗藥性和耐藥性變得越來越強(qiáng)，農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)也遭到破壞，自然生態(tài)系統(tǒng)對(duì)蚜蟲的控制調(diào)節(jié)能力下降。同時(shí)蚜蟲的天敵也受到了影響，在田間的數(shù)量越來越少，導(dǎo)致對(duì)蚜蟲的防治難度加大。因此，綠色環(huán)保地控制蚜蟲，減少對(duì)農(nóng)作物的危害，維護(hù)大自然的生態(tài)平衡是一個(gè)有待解決的科學(xué)難題。由此產(chǎn)生的外界干擾比較多，不能通過取食植物的方式來判斷齊墩果酸對(duì)蚜蟲的影響作用。為保證齊墩果酸作為唯一的影響因素或者將外界影響因素降至最低，利用人工飼料飼喂豌豆蚜，測(cè)定飼喂后豌豆蚜的存活率、有翅蚜率、相對(duì)日均體重增長(zhǎng)率等，來明確齊墩果酸和豌豆蚜生長(zhǎng)發(fā)育和繁殖之間的關(guān)系，以期為齊墩果酸藥用走向?qū)嶋H生產(chǎn)提供依據(jù)，為進(jìn)一步分析齊墩果酸對(duì)蚜蟲的作用機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試蟲源

6月下旬在甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)苜蓿(Medicago sativa)試驗(yàn)田中 (32°11′42°57″ N，92°131′08°26′ E；海拔1 250 m)采集健壯的紅、綠兩種色型的豌豆蚜留待備用，試驗(yàn)田均為苜蓿種植基地。

1.1.2 試驗(yàn)儀器及試劑

儀器：梅特勒-托利多儀器有限公司產(chǎn)的AL104型電子分析天平、上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司生產(chǎn)的SPX-300-GB智能光照培養(yǎng)箱、Eppendorf型移液槍、養(yǎng)蟲籠。

主要試劑：齊墩果酸、氨基酸、礦物質(zhì)、維生素、蔗糖化合物、磷酸三鉀等均由天津凱信化工公司提供，均為分析純度。

1.1.3 含有齊墩果酸的豌豆蚜人工飼料的配置

豌豆蚜人工飼料的配制借鑒葉超[27]的豌豆蚜人工全純飼料配方進(jìn)行配制。按需要在配制飼料過程中加入齊墩果酸，處理組C1、C2、C3、C4、C5中齊墩果酸濃度分別為0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 mg·mL-1。對(duì)照組(CK)中不添加齊墩果酸。經(jīng)0.22 μm微孔細(xì)菌濾膜過濾滅菌后，分裝到無菌的試管中放在-20 ℃冰箱里備用，按照每次試驗(yàn)所需人工飼料量解凍利用，以防反復(fù)凍融導(dǎo)致人工飼料中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺失。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 豌豆蚜飼養(yǎng)方法

試驗(yàn)中使用直徑為2.5 cm、高為3 cm的養(yǎng)蟲籠喂養(yǎng)豌豆蚜。拉伸封口膜方方正正地覆在玻璃管的一端，使用移液槍在膜上滴入不同處理的液體飼料，一滴約為100 μL，然后快速地在上面再覆一層石蠟?zāi)?。值得注意的是要防止液體飼料漏出石蠟?zāi)?，形成雙層膜包被的半密封養(yǎng)蟲籠。石蠟?zāi)な褂们坝米贤鉄粽丈?.5 h，目的是滅菌消毒。然后，用小毛筆將蠶豆苗上初孵若蚜轉(zhuǎn)接至玻璃管內(nèi)的膜上，倒置一會(huì)以保證蚜蟲固定取食，再將玻璃管翻轉(zhuǎn)，使包有人工飼料的石蠟?zāi)ひ欢顺希愣寡晾每卺槾涛∈场?/p>

1.2.2 試驗(yàn)方法及飼養(yǎng)條件

根據(jù)1.1.4中飼料的配置，按照添加齊墩果酸的濃度設(shè)置6個(gè)處理，分別為C1(0.1 mg·mL-1)、C2(0.5 mg·mL-1)、C3(1.0 mg·mL-1)、C4(1.5 mg·mL-1)、C5(2.0 mg·mL-1)和 CK(不添加齊墩果酸)。每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，每重復(fù)單體飼養(yǎng)10頭若蚜，共30頭豌豆蚜，將豌豆蚜放到溫度為(24 ± 1) ℃，光周期為L(zhǎng)∶D(光照時(shí)間∶黑暗時(shí)間) = 12∶12，濕度為RH(相對(duì)濕度) = (70 ± 5)%的智能光照培養(yǎng)箱(SPX型)內(nèi)飼養(yǎng)。

每個(gè)養(yǎng)蟲籠里接入一頭豌豆蚜初孵若蟲，接蟲后，于第2天起開始記錄各處理豌豆蚜若蚜的生長(zhǎng)和產(chǎn)蚜情況，統(tǒng)計(jì)時(shí)間為20 d。每天早、晚各觀察一次，飼料如有變質(zhì)需及時(shí)更換。每接入一頭若蚜用1/1 000精度的精密電子天平(AL104)稱蟲體初重(W1)，待發(fā)育成無翅成蚜后再次稱重(W2)，每隔12 h 觀察并記錄豌豆蚜存活率，若蟲發(fā)育至成蟲時(shí)，每天記錄產(chǎn)的若蚜數(shù)（頭），最后記錄發(fā)育歷期(DD)，從而計(jì)算相對(duì)日均體重增長(zhǎng)率(RRGR)、平均產(chǎn)仔量和平均產(chǎn)仔率。

RRGR= (lnW2- lnW1)/DD。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用Excel和SPSS軟件對(duì)蚜蟲的存活數(shù)、體重、產(chǎn)蚜數(shù)和有翅蚜數(shù)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 齊墩果酸對(duì)綠色型豌豆蚜生長(zhǎng)發(fā)育及繁殖的影響

豌豆蚜人工飼料中齊墩果酸會(huì)嚴(yán)重影響綠色型豌豆蚜的存活和體重的增加，以及有翅型蚜蟲的產(chǎn)生(表1)。對(duì)于綠色型豌豆蚜的存活率而言，第6天和第12天時(shí)處理組和CK的存活率無顯著差異(P ＞ 0.05)；在第20天時(shí)，C4和C5處理存活率為0；C1、C2和C3間無顯著差異。在相同統(tǒng)計(jì)時(shí)間下，當(dāng)齊墩果酸濃度在0.1～2.0 mg·mL-1時(shí)，濃度越大，存活率越低。此外，處理組C1、C2、C3、C4、C5和CK的相對(duì)日均體重增長(zhǎng)率之間均存在顯著的差異(P ＜ 0.05)。處理組的有翅蚜率顯著高于CK，且有翅蚜率隨著齊墩果酸濃度的增加而呈現(xiàn)增大趨勢(shì)。

2.2 不同質(zhì)量濃度齊墩果酸對(duì)紅色型豌豆蚜生長(zhǎng)發(fā)育的影響

在3次統(tǒng)計(jì)時(shí)間下，各齊墩果酸濃度處理的紅色型豌豆蚜存活率均與CK間無顯著差異(P ＞ 0.05)(表2)，可見齊墩果酸處理對(duì)紅色型豌豆蚜的存活率沒有明顯的抑制作用。所有處理的相對(duì)日均體重增長(zhǎng)率間均無顯著差異(P ＞ 0.05)。有翅蚜率隨著濃度增大先升高后降低，在C3濃度時(shí)最大，C3翅蚜與CK間差異顯著(P ＜ 0.05)。

2.3 齊墩果酸對(duì)綠色型豌豆蚜平均產(chǎn)蚜量的影響

在齊墩果酸質(zhì)量濃度0.1～2.0 mg·mL-1內(nèi)，綠色型豌豆蚜最大產(chǎn)蚜量和平均產(chǎn)蚜量均隨著齊墩果酸濃度升高呈降低趨勢(shì)(圖1)。平均產(chǎn)蚜量在C1、C2、C3、C4和 C5濃度時(shí)，均顯著低于 CK (P ＜0.05)；C5時(shí)平均產(chǎn)蚜量最低，為 (2.6 ± 1.3)頭/單雌?？梢婟R墩果酸會(huì)影響綠色型豌豆蚜的繁殖。

表1 不同質(zhì)量濃度齊墩果酸對(duì)綠色型豌豆蚜生長(zhǎng)發(fā)育的影響Table 1 Effect of the different concentrations oleanolic acid on the growth and development of green pea aphid

表2 不同質(zhì)量濃度齊墩果酸對(duì)紅色型豌豆蚜生長(zhǎng)發(fā)育的影響Table 2 Effect of different concentrations oleanolic acid on the growth and development of red pea aphid

圖1 不同濃度齊墩果酸對(duì)綠色型豌豆蚜產(chǎn)蚜量的影響Figure 1 Effect of different concentrations oleanolic acid on green pea aphid fecundity

2.4 齊墩果酸對(duì)紅色型豌豆蚜產(chǎn)蚜量的影響

最適條件下飼養(yǎng)紅色型豌豆蚜，在齊墩果酸質(zhì)量濃度0.1～2.0 mg·mL-1范圍內(nèi)，紅色型豌豆蚜最大產(chǎn)蚜量和平均產(chǎn)蚜量均隨著齊墩果酸濃度升高基本呈降低趨勢(shì)，但差異較小(圖2)。平均產(chǎn)蚜量在C1、C2、C3、C4和C5處理時(shí)，均與CK間差異不顯著(P ＞ 0.05)，各處理也無顯著差異。比較可知(圖1、圖2)，齊墩果酸對(duì)綠豌豆蚜平均產(chǎn)蚜量的抑制作用明顯大于紅色型。

2.5 齊墩果酸對(duì)綠色型豌豆蚜產(chǎn)蚜率的影響

在齊墩果酸濃度0.1～2.0 mg·mL-1內(nèi)，各處理的綠色型豌豆蚜產(chǎn)蚜率均對(duì)低于CK，C3、C4和C5均與CK間差異顯著(P ＜ 0.05)，C2濃度的產(chǎn)蚜率有小幅的升高，C5時(shí)產(chǎn)蚜率最低(10.0%)，產(chǎn)蚜率的降低表明齊墩果酸對(duì)其繁殖力有一定的抑制效果 (圖 3)。

圖2 不同濃度齊墩果酸對(duì)紅色型豌豆蚜平均產(chǎn)蚜量的影響Figure 2 Effect of different concentrations oleanolic acid on red pea aphid fecundity

圖3 不同濃度齊墩果酸對(duì)綠色型豌豆蚜產(chǎn)蚜率的影響Figure 3 Effect of different concentrations Oleanolic acid on fecundity rate of green pea aphid

2.6 不同質(zhì)量濃度齊墩果酸對(duì)紅色型豌豆蚜產(chǎn)蚜率的影響

最適條件下飼養(yǎng)紅色型豌豆蚜，在齊墩果酸濃度0.1～2.0 mg·mL-1內(nèi)，隨著濃度的增大，紅色型豌豆蚜的產(chǎn)蚜率基本沒變化，與CK間均無顯著差異(P ＞ 0.05) (圖4)。產(chǎn)蚜率的變化進(jìn)一步說明了齊墩果酸對(duì)紅色型豌豆蚜成蚜的繁殖沒有明顯的抑制效果。

3 討論

圖4 不同濃度齊墩果酸對(duì)紅色型豌豆蚜產(chǎn)蚜率的影響Figure 4 Effect of different concentrations oleanolic acid on the fecundity rate of red pea aphid

在對(duì)紅綠兩種生態(tài)型的豌豆蚜進(jìn)行飼喂試驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)，齊墩果酸對(duì)綠色型豌豆蚜的生長(zhǎng)發(fā)育及繁殖具有一定的抑制作用，而對(duì)紅色型豌豆蚜則沒有。本研究發(fā)現(xiàn)，在一定范圍內(nèi)隨著齊墩果酸濃度的增大，綠色型豌豆蚜的生存能力和繁殖能力均減弱。蚜蟲取食是一個(gè)“邊探測(cè)邊決定”的過程，即，蚜蟲先對(duì)宿主植物表皮的細(xì)胞內(nèi)含物進(jìn)行“取樣”來確定到底這個(gè)植物適不適合取食。如果蚜蟲在攝入細(xì)胞內(nèi)含物后產(chǎn)生不適反應(yīng)則蚜蟲將放棄取食，進(jìn)而轉(zhuǎn)移去尋找下一類宿主[28-29]。因此，本研究認(rèn)為飼料中齊墩果酸的濃度越高，豌豆蚜取食后對(duì)生理層面受到的影響越嚴(yán)重，相對(duì)應(yīng)的豌豆蚜的繁殖率越低、有翅蚜的產(chǎn)生率越大。但是隨著齊墩果酸濃度增大，除了有翅蚜率外，紅色型豌豆蚜的各項(xiàng)指標(biāo)均卻沒有明顯變化。

研究表明，蚜蟲在為害植物的過程中，當(dāng)宿主死亡或蚜蟲種群密度過高，蚜蟲就會(huì)從無翅型轉(zhuǎn)為有翅型進(jìn)行遷徙重新尋找合適的宿主[30-31]。添加齊墩果酸的人工飼料喂養(yǎng)蚜蟲時(shí)所處的環(huán)境與自然生存環(huán)境相比是逆境環(huán)境，因此，豌豆蚜的有翅蚜比率不斷增加。植物表皮存在的屏障能阻擋蚜蟲取食，是因?yàn)橹参锉砥ぜ?xì)胞中含有對(duì)昆蟲有害的次級(jí)代謝物以及表皮細(xì)胞能夠釋放出驅(qū)除昆蟲的揮發(fā)物[32-33]。當(dāng)蚜蟲所處的環(huán)境中存在趨避作用的揮發(fā)性物質(zhì)時(shí)蚜蟲將不再取食。而在人工飼料中添加齊墩果酸后豌豆蚜依然有取食現(xiàn)象，說明齊墩果酸對(duì)蚜蟲的抑制作用是因?yàn)槠鋵?duì)豌豆蚜具有毒殺作用，并非起趨避作用。其次，豌豆蚜中的原生共生菌如Buchnera 共生菌也參與豌豆蚜的消化[34]，有研究表明，蚜蟲的生長(zhǎng)發(fā)育和繁殖能力會(huì)隨著原生共生菌的失去而變緩、降低甚至完全喪失[35]。豌豆蚜體內(nèi)除了原生共生菌還有次生共生菌，豌豆蚜品系不同體內(nèi)攜帶的次生共生菌也不同[36]。綠色型的豌豆蚜存活、繁殖能力下降而紅色型不受影響，是不是由于齊墩果酸抑制了綠色型豌豆蚜體內(nèi)的共生菌而紅色型沒有受到影響導(dǎo)致。

到目前為止，已經(jīng)初步明確植物次生代謝物質(zhì)的主要功能表現(xiàn)在自身防御和繁衍后代這兩個(gè)方面，它們具有重要的生態(tài)學(xué)意義[37]。張亞妮[38]從殼斗科(Fagaceae)Nothofagusz屬植物中分離出一個(gè)倍半萜化合物α-agarofuran，這種化合物對(duì)蚜蟲的引誘作用十分強(qiáng)烈，能夠引誘蚜蟲快速、準(zhǔn)確地尋找到適宜的寄主植物。川楝素是呋喃三萜類物質(zhì)中的活性物質(zhì)，其對(duì)菜青蟲、粘蟲、斜紋夜蛾和桔蚜等表現(xiàn)出拒食、毒殺功能和控制效果[39-40]。葫蘆素對(duì)害蟲的取食、產(chǎn)卵和生長(zhǎng)繁殖產(chǎn)生強(qiáng)烈的抑制效果[41-42]。本研究結(jié)果和王樹棟[43]的齊墩果酸對(duì)甜菜夜蛾生長(zhǎng)發(fā)育的試驗(yàn)結(jié)果有差異，其原因可能是甜菜夜蛾和豌豆蚜對(duì)齊墩果酸代謝能力不同所致。

綜上所述，齊墩果酸能顯著抑制綠色型豌豆蚜的存活繁殖，促使豌豆蚜有翅型的產(chǎn)生。齊墩果酸對(duì)紅色型和綠色型豌豆蚜的抑制效果存在差異是因?yàn)橥愣寡辽鷳B(tài)型不一致導(dǎo)致的代謝能力不同或者是因?yàn)榕c代謝相關(guān)的共生菌的種類不同造成的存活繁殖上的差異，其相關(guān)的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。