潘 琦，劉婭琴，鄒國(guó)燕，周文宗，付子軾，劉長(zhǎng)娥，宋祥甫

（上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，上海201403）

日益加劇的水體富營(yíng)養(yǎng)化促使水域中的藻類大量繁殖，而藻類失控的暴發(fā)性生長(zhǎng)會(huì)引發(fā)水華的形成，大量消耗水體中的溶解氧，其直接后果便是造成水生動(dòng)物的窒息死亡，給水產(chǎn)養(yǎng)殖帶來(lái)不可估量的損失。藻類產(chǎn)生的藻毒素，其危害不僅僅是引起動(dòng)物的中毒，還可以通過(guò)食物鏈威脅人類的健康，甚至引發(fā)生態(tài)系統(tǒng)失衡，因此水環(huán)境的污染已經(jīng)成為當(dāng)今人類亟待解決的嚴(yán)峻問(wèn)題［1］。生態(tài)浮床利用水上種植技術(shù)，通過(guò)陸生植物根系的吸附和吸收作用，富集水中氮、磷等元素，降解和富集其他有害有毒污染物，并以收獲植物體的形式將其搬離水體，從而實(shí)現(xiàn)凈化水體、保護(hù)水生態(tài)環(huán)境的目的。實(shí)踐證明，生態(tài)浮床技術(shù)在治理富營(yíng)養(yǎng)化水體方面效果顯著［2-4］。

國(guó)內(nèi)外利用植物化感物質(zhì)抑制藻類的研究比較多，但多集中在水生植物對(duì)藻類的化感作用上［5-9］，大型陸生植物對(duì)藻類化感作用的研究較少。本研究利用生態(tài)浮床技術(shù)，以生長(zhǎng)速度快、凈化水質(zhì)能力強(qiáng)的陸生植物美人蕉和旱傘草為供試植物，在其生長(zhǎng)最為旺盛，同時(shí)也是水華最易暴發(fā)的6—8月進(jìn)行試驗(yàn)，研究夏季不同生長(zhǎng)時(shí)期兩種美人蕉和旱傘草生長(zhǎng)及其對(duì)藍(lán)藻水華的主要組成者銅綠微囊藻的影響，并利用GC-MS分析其根系分泌的化學(xué)物質(zhì)，為進(jìn)一步探討陸生植物對(duì)藻類的抑制機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 植物材料

旱傘草（CyperusalternifoliusL.）、美人蕉（CannaindicaL.）、黃花美人蕉（C.indicaL.var.flavaRoxb.）培育于上海市陸家浜河道，試驗(yàn)前洗凈植物根系，將其移植到大棚水泥池，采用Hoagland營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)1 d。

1.1.2 銅綠微囊藻

銅綠微囊藻（Microcystisaeruginosa）由中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所淡水藻種庫(kù)提供，藻類試驗(yàn)起始濃度約為2×105個(gè)/mL。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 植物種植水的制作

根據(jù)浮床植物美人蕉等的生長(zhǎng)特點(diǎn)及其對(duì)水體氮磷吸收的最佳時(shí)間段［10-11］，在溫室大棚內(nèi)進(jìn)行植物種植水的制作。6月15日開(kāi)始挑選大小和重量基本一致的旱傘草、美人蕉、黃花美人蕉，種植于大棚內(nèi)的水泥池。分4期（6月15日，7月3日，7月21日，8月10日）從每種植物中各取兩株，將其根系用蒸餾水洗凈，單株種植在盛有8 L 1/20 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液的塑料桶中培養(yǎng)，供后續(xù)試驗(yàn)用。每期各品種設(shè)2個(gè)重復(fù)，定期補(bǔ)充蒸餾水以消除植物蒸騰和水分蒸發(fā)對(duì)試驗(yàn)效果的影響。植株在塑料桶中培養(yǎng)72 h，收集該植物的種植水，進(jìn)行根系分泌物的抑藻試驗(yàn)?？紤]到后續(xù)三期植物根系生長(zhǎng)迅速，根系分泌物質(zhì)產(chǎn)生也較多，所以以第一期取樣時(shí)植物的根/水濃度比例［根系重量（g）/種植水體積（L）］作為旱傘草和美人蕉的標(biāo)準(zhǔn)根系單位濃度，對(duì)余下三期水樣進(jìn)行稀釋，使4期最終的種植水根系單位濃度一致，便于在同等條件下，對(duì)各期種植水的抑藻效果進(jìn)行比較。取樣完畢后，將每株植物的根系和地上部放置于烘箱內(nèi)，70°條件下烘干至恒重，冷卻后分別稱量干物重。

1.2.2 植物種植水抑藻效果試驗(yàn)

取種植水1 L，用WATERMAN濾膜（孔徑0.90μm）抽濾后，濾液加CB培養(yǎng)液100mL，在超凈工作臺(tái)上抽濾滅菌后，量取10 mL，倒入滅過(guò)菌的三角錐形瓶中，每種植物種植水設(shè)3次重復(fù)，空白對(duì)照僅添加10 mL CB培養(yǎng)液。

向各處理中添加100μL銅綠微囊藻，置于培養(yǎng)箱中，溫度為25℃，光照強(qiáng)度為3 000 lx，光暗比為12 h∶12 h，80 r/min震蕩培養(yǎng)，每5 d用血球計(jì)數(shù)板記錄藻類數(shù)量。同時(shí)，采用分光光度法［12］測(cè)定銅綠微囊藻葉綠素a的含量。種植水對(duì)藻類的抑制率（RI）：RI＝（1-N/N0）×100%。式中：N為種植水組藻密度；N0為對(duì)照組藻密度。

1.2.3 根系分泌物的收集濃縮

種植水經(jīng)濾膜抽濾后，濾液用濃鹽酸調(diào)節(jié)至pH 1.5，取150 mL進(jìn)行固相萃取。

使用Oasis HLB固相萃取柱，先用4 m甲醇活化柱子，再用4mL pH 1.5鹽酸清洗，種植水以3 mL/min的速度過(guò)柱后，用4 mL pH 1.5鹽酸洗柱。待水完全抽干后，用20 mL甲醇洗脫柱子上的提取物。無(wú)水硫酸鈉處理脫水，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至5 mL。

1.2.4 GC-MS處理分析

取濃縮后的根系分泌物2 mL，45℃下氮?dú)獯蹈?，加?00μL BSTFA和200μL正己烷，封管，120℃反應(yīng)30 min，取1.0μL反應(yīng)液進(jìn)行GC-MS分析。

GC-MS測(cè)定的條件為：檢測(cè)儀器Finnigan Voyager氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，色譜柱VF-5 ms，石英毛細(xì)管柱30 m×0.25 mm；柱溫80℃（保持2 min），以20℃/min的速率升至300℃（保持10 min），汽化溫度250℃；載氣流量 He（1.0 mL/min）；分流比20∶1；進(jìn)樣量1.0μL；質(zhì)譜檢測(cè)器：EI源，電子能量70 eV，源溫200℃。植物根系分泌物的定性根據(jù)質(zhì)譜圖與Wiley 7.0標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)照［13］。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 9.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 旱傘草和兩種美人蕉植物生長(zhǎng)情況的比較

如表1所示，第四期（8月10日）旱傘草、美人蕉和黃花美人蕉生物量干重分別是第一期（6月15日）6.9倍、4.6倍和5.3倍，根系分別為7.5倍、2.5倍和3.0倍。通過(guò)吸收水體氮磷，旱傘草和兩個(gè)品種的美人蕉生物量增加顯著。其中，旱傘草生長(zhǎng)迅速，生物量變化最大，黃花美人蕉其次，美人蕉最小。

表1 不同取樣時(shí)期各植物的生物量Table 1 Biomass of plants in each period

2.2 旱傘草和兩種美人蕉種植水對(duì)藻類生長(zhǎng)的影響

圖1顯示，旱傘草和美人蕉各期種植水對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)均有一定的抑制效果，說(shuō)明旱傘草和美人蕉根系分泌了某些抑制銅綠微囊藻生長(zhǎng)的物質(zhì)。第一期3種植物種植水對(duì)銅綠微囊藻的抑制作用較好，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延續(xù)，種植水中藻類數(shù)量增加緩慢，旱傘草和兩種美人蕉種植水對(duì)銅綠微囊藻的抑制效果差異不顯著。但在其后的第二、三、四期培養(yǎng)過(guò)程中，可以明顯看出旱傘草的抑藻效果弱于美人蕉，兩種美人蕉對(duì)銅綠微囊藻的抑藻效果差異較小。第四期藻類共培養(yǎng)試驗(yàn)中，旱傘草種植水對(duì)銅綠微囊藻的生長(zhǎng)抑制效果已十分微弱，美人蕉和黃花美人蕉則仍保持一定的抑藻效果。整個(gè)試驗(yàn)期間旱傘草生物量及根系生長(zhǎng)最迅速，其種植水抑藻效果卻低于美人蕉，美人蕉和黃花美人蕉生物量和根系生長(zhǎng)雖有差異，但兩種植物種植水對(duì)藻類抑藻效果差異不顯著?？梢?jiàn)植物種類不同，營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段其根系分泌物的抑藻效果也有差異。

圖1 銅綠微囊藻在3種植物種植水中培養(yǎng)20 d生長(zhǎng)曲線變化Fig.1 The grow th curves of M icrocystis aeruginosa w ith the roots exudates of three p lants in 20 days

葉綠素a是反映藻類能否正常生長(zhǎng)及光合作用的重要指標(biāo)之一。本試驗(yàn)中，對(duì)照組銅綠微囊藻的葉綠素a含量分別是旱傘草、美人蕉和黃花美人蕉種植水的1.47倍、1.98倍和2.53倍，差異顯著（P＜0.05）。由此推測(cè)，3種植物種植水是通過(guò)破壞藻類葉綠素a的合成來(lái)影響銅綠微囊藻正常生長(zhǎng)的。

2.3 植物不同生長(zhǎng)時(shí)期3種植物種植水對(duì)藻類生長(zhǎng)的影響

從圖2可以看出，第一期旱傘草種植水對(duì)銅綠微囊藻的化感作用最好，其抑制率最高達(dá)到了56.3%，并且種植水培養(yǎng)藻類時(shí)間越長(zhǎng)，抑藻效果越明顯。兩種美人蕉種植水相比，其對(duì)藻類的抑制效果無(wú)顯著差異，抑制率均在培養(yǎng)10—15 d達(dá)到最大值，第一期的抑制率最高，美人蕉達(dá)到了64.2%，黃花美人蕉為67.7%。上述結(jié)果表明，相同的單位根系濃度下，開(kāi)始時(shí)，旱傘草根系產(chǎn)生和釋放的對(duì)銅綠微囊藻具有抑制作用的化感物質(zhì)成分或含量相對(duì)較高，進(jìn)入生長(zhǎng)旺季，旱傘草植株質(zhì)量增加，根系分泌物的化感物質(zhì)成分或含量相對(duì)減少。而兩種美人蕉植株生物量增加，根系分泌物對(duì)銅綠微囊藻的化感作用則無(wú)顯著變化。綜上，旱傘草植株生物量增加，其根系種植水對(duì)銅綠微囊藻的化感作用顯著降低，而美人蕉生長(zhǎng)各期其種植水的化感作用無(wú)顯著變化。

圖2 不同生長(zhǎng)時(shí)間旱傘草和兩種美人蕉抑藻效果比較Fig.2 Inhibit ratios of the roots exudates of three plants on the algal grow th of M icrocystis aeruginosa

2.4 GC-MS測(cè)定分析

本研究以第一期旱傘草和美人蕉種植水中提取的根系分泌物為代表，用GC-MS對(duì)分泌物的化學(xué)成分進(jìn)行分析。結(jié)果表明，旱傘草根系分泌物檢測(cè)出11種化合物，美人蕉檢測(cè)出10種化合物（表2），兩種植物分泌物的化學(xué)成分多為脂肪酸和醇類化合物。與空白對(duì)照相比，3種植物的種植水中藻類葉綠素a含量下降顯著。由此推測(cè)，種植水對(duì)銅綠微囊藻的抑制作用，也是通過(guò)植物根系分泌的化合物破壞藻類葉綠素的合成來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

表2 GC-MS分析檢測(cè)旱傘草和美人蕉根系分泌物中所得化學(xué)物質(zhì)Table 2 Compounds of roots exudates Cyperus alternifolius and Canna indica tested by GC-MS

3 討論

本試驗(yàn)通過(guò)收集植物種植水獲得根系分泌物，并用無(wú)菌種植水添加藻種的方式進(jìn)行培養(yǎng)，避免了植物與藻類共培養(yǎng)而引發(fā)的光照競(jìng)爭(zhēng)、營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)及微生物干擾等因素，確保試驗(yàn)中銅綠微囊藻生長(zhǎng)變化只受植物根系分泌物影響。

化感物質(zhì)通過(guò)破壞藻類葉綠素、減少其同化產(chǎn)物的方式抑制藻類生長(zhǎng)，如粉綠狐尾藻可破壞胞藻的葉綠素a和藻膽蛋白的特征吸收峰，降低藻細(xì)胞對(duì)光的吸收能力［14］。水生植物可以通過(guò)減少藻類細(xì)胞葉綠素含量、降低光合速率、嚴(yán)重?fù)p傷藻類類囊體反應(yīng)來(lái)抑制藻類光合作用，如鳳眼蓮根系分泌物可使柵藻葉綠體解體，黑藻與銅綠微囊藻共培養(yǎng)時(shí)，微囊藻細(xì)胞葉綠素a含量顯著低于對(duì)照［15-16］。本試驗(yàn)中美人蕉和旱傘草種植水也對(duì)葉綠體a有較大的抑制作用，與鳳眼蓮、黑藻對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)的抑制效果一致。另有研究認(rèn)為，植物化感物質(zhì)對(duì)藻類的抑制作用主要體現(xiàn)在影響藻類光合作用、酶活性、細(xì)胞亞顯微結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)合成，改變核酸代謝以及破壞細(xì)胞膜等［17］。浮床美人蕉和旱傘草對(duì)藻類在生理生化方面的影響，還有待做進(jìn)一步深入的研究。

旱傘草和美人蕉種植水中都含有的棕櫚酸對(duì)小球藻和和斜生柵藻具有很好的抑制作用。戴樹(shù)桂等［18］研究表明，棕櫚酸對(duì)藻類的半抑制劑量為 8.2 mg/mL。Nakai等［19］從穗花狐尾藻（Myriophyllum spicatum）浸提液中，分離得到了包括棕櫚酸和硬脂酸在內(nèi)的多種脂肪酸類物質(zhì)，棕櫚酸等物質(zhì)對(duì)銅綠微囊藻具有抑制作用。張庭廷等［20］研究發(fā)現(xiàn)己酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸等脂肪酸對(duì)銅綠微囊藻、蛋白核小球藻及斜生柵藻均有抑制作用，乳酸、十五酸等也被證實(shí)具有抑藻活性［21-22］。倪利曉等［23］也認(rèn)為多種脂肪酸組合具有協(xié)同抑藻作用。陳國(guó)元等［24］發(fā)現(xiàn)黃菖蒲有機(jī)酸組份的存在影響藻類正常的光合作用。

水生植物如穗狀狐尾藻和蘆葦均對(duì)銅綠微囊藻具有化感作用，但穗狀狐尾藻產(chǎn)生的化感物質(zhì)為鞣花酸、五倍子酸和焦棓酸等［25］，蘆葦中起化感作用的物質(zhì)是2-甲基乙酰乙酸乙酯（EMA），兩種植物起化感作用的成分不同［26］。本試驗(yàn)檢測(cè)出的兩種植物大部分化合物相同，與前人研究結(jié)果不一致。由此推測(cè)，不同植物種類特別是陸生植物與水生植物的分泌物不同。本試驗(yàn)中，美人蕉和旱傘草分泌相同或相似的化合物，這可能是受環(huán)境影響，也有可能是均屬陸生植物所致。但由于植物種類不同，其根系分泌物也存在一定的差別，因此，種植水抑制銅綠微囊藻化感效果存在一定的差異。

與第一期比較，最后一期總生物量和根系生物量均成倍的增加。6—8月份是浮床美人蕉和旱傘草旺盛生長(zhǎng)階段，也是水華發(fā)生盛期［27-29］，將陸生植物通過(guò)生態(tài)浮床的方式種植于富營(yíng)養(yǎng)化水體中，既能吸收利用水體中多余的氮磷營(yíng)養(yǎng)元素，達(dá)到凈化水質(zhì)的目的，同時(shí)，植物根系分泌的化感物質(zhì)也可有效抑制藻類的繁衍和水華的暴發(fā)。本試驗(yàn)條件下，單位根系濃度美人蕉的抑藻效果比旱傘草顯著，但旱傘草生物量增長(zhǎng)高于美人蕉。因此，在將浮床植物應(yīng)用于富營(yíng)養(yǎng)化水體控制時(shí)，需根據(jù)不同需求來(lái)選擇植物種類和品種。本研究后續(xù)將開(kāi)展檢出的未知毒性化合物對(duì)藻類的抑制效果以及相關(guān)生理生化研究。

4 結(jié)論

1.旱傘草和美人蕉、黃花美人蕉種植水對(duì)銅綠微囊藻的生長(zhǎng)有較好抑制作用，其抑制率最高分別達(dá)到56.3%，64.2%和67.7%。第一期試驗(yàn)中對(duì)照組銅綠微囊藻葉綠素a含量分別是旱傘草、美人蕉和黃花美人蕉種植水的1.47倍、1.98倍和2.53倍。

2.試驗(yàn)第四期（8月10日）旱傘草、美人蕉和黃花美人蕉干物重分別是第一期（6月15日）的6.9倍、4.6倍和5.3倍，根系分別為7.5倍、2.5倍和3.0倍。隨著供試植物質(zhì)量的增加，在相同單位根系濃度種植水中，旱傘草對(duì)銅綠微囊藻的化感作用逐漸減弱，美人蕉則持續(xù)保持較好的抑制效果，兩種美人蕉間對(duì)藻類的抑制效果差異不顯著。

3.用GC-MS對(duì)旱傘草和美人蕉種植水提取物進(jìn)行分析，旱傘草根系分泌物中含有棕櫚酸等11種化合物，美人蕉根系分泌物中有棕櫚酸和硬脂酸等10種化合物。

致謝：感謝日本廣島大學(xué)大學(xué)中井智司（Nakai Satoshi）教授為本試驗(yàn)提供的技術(shù)支持和幫助。