陳笑艷，王經(jīng)琳，施曉雷

（1.南京醫(yī)科大學(xué) 鼓樓臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210005；2.東南大學(xué)醫(yī)院 普通外科，江蘇 南京 210008；3.南京鼓樓醫(yī)院 肝膽研究所，江蘇 南京 210008）

急性肝功能衰竭（acute liver failure，ALF）是由多種因素引起的突發(fā)和嚴(yán)重的肝損傷，伴有大量肝細(xì)胞壞死，進(jìn)而導(dǎo)致嚴(yán)重的肝性腦病、凝血功能障礙、黃疸和進(jìn)行性多器官功能衰竭。急、慢性肝功能衰竭患者病情險(xiǎn)、進(jìn)展急、預(yù)后差，內(nèi)科藥物治療病死率高達(dá)50%～80%[1]。目前肝移植是治療ALF最有效的方法，但其應(yīng)用受到了供體短缺、手術(shù)費(fèi)用高昂、術(shù)后需要長期服用免疫抑制劑等原因的限制，臨床上僅有極少患者可以及時(shí)進(jìn)行肝移植治療[2]。近年來，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）移植作為一種新興細(xì)胞移植療法，已成為治療ALF的研究熱點(diǎn)[3]?，F(xiàn)階段MSCs移植采用靜脈輸注的方式，但研究發(fā)現(xiàn)只有少量細(xì)胞募集到受損組織，并且細(xì)胞移植后的較低存活率顯著制約其治療效果[4]。膠原蛋白作為天然細(xì)胞外基質(zhì)，具有良好的生物相容性，因此是理想的生物材料。采用膠原凝膠作為生物支架材料，利用其友好的生物相容性和特有的拓?fù)淙S結(jié)構(gòu)，既可為細(xì)胞的靶向遞送提供載體，也可提供細(xì)胞生長所需的三維環(huán)境，進(jìn)而維持并提高M(jìn)SCs的功能與存活[5]。在本研究中，建立了由D-氨基半乳糖（D-Gal）誘導(dǎo)的小鼠急性肝衰竭模型，探究膠原凝膠對(duì)MSCs分化和增殖等生物學(xué)效應(yīng)的影響，通過檢測膠原凝膠復(fù)合MSCs移植治療小鼠急性肝衰竭中取得的療效，為膠原凝膠復(fù)合MSCs應(yīng)用于臨床治療急性肝功能衰竭提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

C57BL/6小鼠，SPF級(jí)，雄性，6～8周齡，由南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證SYXK（蘇）2014-0052。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 實(shí)驗(yàn)試劑：胎牛血清（美國Gibco公司）、LDMEM培養(yǎng)基（美國Hyclone公司）、胰酶（美國Gibco公司）、磷酸鹽緩沖液（PBS，美國Hyclone公司）、DGal（美國sigma公司）、膠原凝膠（中科院北京遺傳發(fā)育研究所）、RIPA全蛋白提取試劑盒（南京凱基生物公司）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本Takara公司）。GAPDH、AKT、p-AKT、Ki-67、PARP、cleaved-Caspase 3和PI3K一抗（美國Abcam公司）、羊抗兔二抗（美國Abcam公司）。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)儀器：低溫離心機(jī)（德國 Eppendorf 公司）、生物安全柜（美國Thermo公司）、精密電子天平（德國Heraeus公司）、顯微鏡（德國Leica公司）、流式細(xì)胞儀（美國Bee ton Dickinson公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 小鼠MSCs的分離、培養(yǎng)擴(kuò)增及鑒定：使用頸椎脫臼法處死4～6周齡的C57BL/6小鼠，無菌條件下剪取小鼠的股骨和脛骨，并清除周圍的軟組織，用PBS清洗后剪去股骨和脛骨的骨端，用L-DMEM培養(yǎng)基沖洗分離出小鼠骨髓，并置于4 ℃離心機(jī)，1 200 rpm離心5 min，棄去上清液，用L-DMEM吹打重懸，并接種到25 T的培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)基為90%的L-DMEM，10%胎牛血清，在含5% CO2的37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后換液去除未黏附細(xì)胞，每3天換液，用傳至3～6代的MSCs進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。流式細(xì)胞儀鑒定MSCs，抗體為CD29、CD34、CD44、CD45、CD90小鼠抗體（美國BD、Biosciences公司）。

1.3.2 掃描電鏡觀察：在超凈臺(tái)內(nèi)將膠原凝膠與MSCs（1×106/mL）等體積比充分混合，經(jīng)過戊二醛固定，乙醇脫水后，將其暴露在空氣中以逐漸蒸發(fā)脫水劑，直至脫水劑揮發(fā)干燥，并使用掃描電鏡觀察。

1.3.3 小鼠ALF模型構(gòu)建與分組：將105只雄性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為5組，每組21只：對(duì)照組、ALF組、ALF+膠原凝膠組、MSCs組和膠原凝膠-MSCs組。ALF組、ALF+膠原凝膠組、MSCs組和膠原凝膠-MSCs組中腹腔注射800 mg/kg D-Gal，12 h后分別于肝臟多點(diǎn)注射200 μL PBS、200 μL膠原凝膠、1×106MSCs和1×106膠原凝膠-MSCs，連續(xù)7 d觀察小鼠存活率。

1.3.4 肝功能檢測：采集小鼠第1～7 d的血液，使用全自動(dòng)生化分析儀檢測血谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）水平。

1.3.5 組織病理學(xué)檢查：取小鼠第1、3、7天肝臟，4%多聚甲醛固定后常規(guī)石蠟包埋、切片，行蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色及Ki-67、cleaved-Caspase3免疫組化檢測，光學(xué)顯微鏡觀察并采集圖像。

1.3.6 蛋白免疫印跡（Western blotting）檢測：使用RIPA全蛋白提取試劑盒在4 ℃下提取肝組織中的蛋白。通過BCA蛋白定量法測定蛋白濃度。等量的蛋白經(jīng)12% SDS-PAGE電泳分離，濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉2 h，一抗孵育過夜。在孵育二抗2 h后，用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑壓片曝光顯示免疫反應(yīng)條帶。

1.3.7 RT-qPCR檢測：Trizol法提取小鼠肝組織中RNA。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以β-actin作為內(nèi)參，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測肝組織中iNOS、IL-1β、IL-6、TNF-α、CCl2表達(dá)水平，引物序列見表1。

1.3.8 小動(dòng)物活體成像：ALF誘導(dǎo)12 h后，將經(jīng)熒光預(yù)處理的1×106MSCs、包含1×106MSCs的膠原凝膠復(fù)合MSCs肝臟多點(diǎn)注入ALF小鼠的肝臟，進(jìn)行小動(dòng)物活體成像檢測，并采集圖像。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 MSCs的培養(yǎng)和鑒定

小鼠骨髓來源的MSCs表現(xiàn)為紡錘狀、梭型，流式細(xì)胞顯示間質(zhì)標(biāo)志物CD29、CD44、CD90表達(dá)陽性，而造血標(biāo)志物CD34、CD45表達(dá)較少，這表明培養(yǎng)至第三代后的MSCs的純度較高（圖1A）。

2.2 膠原凝膠促進(jìn)MSCs肝臟定植

為了評(píng)價(jià)膠原凝膠是否能為MSCs生長提供三維環(huán)境，維持和提高M(jìn)SCs的功能與存活，我們將膠原凝膠與MSCs混合制備。在掃描電鏡下觀察，可見MSCs黏附于膠原凝膠構(gòu)建的三維空間中，表明膠原凝膠有良好的生物相容性，能為MSCs細(xì)胞生長提供三維環(huán)境，提供移植細(xì)胞所需的生存空間（圖1B）。接下來我們繼續(xù)探究膠原凝膠復(fù)合MSCs是否能夠更好的定植于ALF小鼠肝臟。小鼠腹腔注射DGal 12 h后，分別對(duì)ALF小鼠肝臟多點(diǎn)注射經(jīng)熒光處理后的MSCs和膠原凝膠復(fù)合MSCs，動(dòng)物活體成像可見幾乎所有信號(hào)均集中于肝臟，脾臟位置無信號(hào)，說明MSCs主要分布于肝臟，其他臟器無定植，移植膠原凝膠復(fù)合MSCs的信號(hào)強(qiáng)于單獨(dú)移植MSCs的ALF小鼠（圖1C）。因此，采用膠原凝膠復(fù)合MSCs能夠提高M(jìn)SCs在肝臟的定植。

表1 引物序列

圖1 膠原凝膠復(fù)合MSCs肝臟定植情況評(píng)估

2.3 膠原凝膠復(fù)合MSCs移植能有效減輕小鼠ALF

為確定膠原凝膠復(fù)合MSCs對(duì)ALF小鼠的療效，我們統(tǒng)計(jì)ALF小鼠生存率，結(jié)果顯示ALF組和ALF+膠原凝膠組小鼠3 d生存率不足15%，二者無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），MSCs組小鼠7 d生存率為43%，膠原凝膠-MSCs組小鼠生存率顯著高于MSCs組（7 d生存率76%）（P＜0.05）（ 圖2A）。各組ALF小鼠的血清ALT、AST均在第3天達(dá)到峰值，HE染色也顯示ALF組和ALF+膠原凝膠組第3天肝組織表現(xiàn)為大面積大結(jié)節(jié)、淋巴細(xì)胞嚴(yán)重浸潤、肝細(xì)胞壞死、全小葉出血、肝細(xì)胞胞漿腫大，表明D-Gal處理后第3天小鼠肝損傷程度最為嚴(yán)重（圖2C）。與ALF組和ALF+膠原凝膠組相比，MSCs治療組的ALT和AST水平在各時(shí)間點(diǎn)均顯著降低（P＜0.05），膠原凝膠-MSCs組下降更顯著（P＜0.05） （圖2B，由于對(duì)照組小鼠ALT和AST指標(biāo)正常，未在圖中列出）。HE染色也顯示膠原凝膠-MSCs組較MSCs組組織損傷改善更明顯，肝臟損傷程度減輕，中央靜脈周圍壞死程度減輕，淋巴細(xì)胞浸潤減少，肝小葉結(jié)構(gòu)未見明顯紊亂（圖2C）。因此，移植膠原凝膠復(fù)合MSCs可以有效改善ALF小鼠的肝臟損傷。因此，移植膠原凝膠復(fù)合MSCs對(duì)于ALF具有更好的治療效果。

2.4 膠原凝膠復(fù)合MSCs通過抑制細(xì)胞凋亡和促進(jìn)細(xì)胞增殖減輕肝損傷

ALF通常發(fā)生肝細(xì)胞凋亡和出血性壞死[6]。為了探究膠原凝膠復(fù)合MSCs如何緩解ALF，我們首先檢測肝細(xì)胞凋亡水平。cleaved-Caspase 3染色顯示，相比MSCs組，膠原凝膠-MSCs組細(xì)胞凋亡明顯減少（圖3A）。Western blotting顯示，在膠原凝膠-MSCs組中促凋亡蛋白Bax和PARP1顯著降低，而抗凋亡蛋白Bcl2表達(dá)更高（圖3B）。此外，我們檢測第3天各組小鼠肝臟中的炎性因子水平，結(jié)果也顯示移植膠原凝膠-MSCs較MSCs組能更顯著的降低IL-1β、IL-6、TNF-α、iNOS和CCl2等炎性因子水平（圖3C，由于對(duì)照組小鼠炎性指標(biāo)正常，未在圖中列出）。表明膠原凝膠-MSCs可顯著降低肝細(xì)胞凋亡和肝臟炎癥水平。肝臟損傷后肝細(xì)胞可重新獲得增殖能力，但在ALF中，肝細(xì)胞增殖能力無法代償肝臟損傷，因此促進(jìn)肝細(xì)胞再生也是緩解ALF的重要策略[7]。研究顯示膠原凝膠-MSCs組中Ki-67陽性的肝細(xì)胞數(shù)目明顯多于MSCs組（圖3D），相應(yīng)的增殖相關(guān)蛋白PCNA和cyclin D1的表達(dá)水平在膠原凝膠-MSCs組表達(dá)也更高（圖3B）。綜上所述，與MSCs組相比，膠原凝膠-MSCs可更好的通過抑制肝細(xì)胞凋亡和促進(jìn)肝細(xì)胞增殖減輕D-Gal誘導(dǎo)的肝損傷。

2.5 移植膠原凝膠復(fù)合MSCs調(diào)控PI3K/AKT信號(hào)通路改善肝細(xì)胞功能

研究表明PI3K/AKT信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在細(xì)胞的存活、抗凋亡和增殖中發(fā)揮重要的生物調(diào)節(jié)功能[8]。因此我們推測膠原凝膠復(fù)合MSCs是否通過調(diào)控PI3K/AKT信號(hào)通路來發(fā)揮肝臟保護(hù)作用。結(jié)果顯示，移植MSCs組和膠原凝膠復(fù)合MSCs組治療均可以激活PI3K/AKT信號(hào)通路，膠原凝膠復(fù)合MSCs組激活該通路效果顯著優(yōu)于單獨(dú)移植MSCs組（圖4）。因此，膠原凝膠復(fù)合MSCs促進(jìn)PI3K/AKT通路的激活，抑制D-Gal誘導(dǎo)的肝損傷的凋亡，改善肝細(xì)胞功能。

圖2 膠原凝膠-MSCs提高M(jìn)SCs對(duì)于ALF的治療效果

圖3 膠原凝膠-MSCs通過減輕肝臟損傷并促進(jìn)肝臟再生緩解ALF

3 討論

ALF是具有高死亡率的臨床重癥，表現(xiàn)為肝細(xì)胞功能迅速紊亂，并伴有不可控的全身炎癥反應(yīng)[1]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，MSCs移植是更簡單、侵入性更小的手術(shù)，因此基于細(xì)胞的治療已經(jīng)被提議作為ALF肝移植的一種切實(shí)可行的替代方案[3]。我們課題組前期的研究已經(jīng)明確MSCs對(duì)ALF的治療作用[9-10]，國內(nèi)其他相關(guān)研究也同樣證實(shí)了這一結(jié)論[11]。然而，隨著對(duì)MSCs研究的深入，MSCs低存活率和高凋亡率顯著降低了其治療效果，因此如何增加細(xì)胞定向遷移的數(shù)量，將足夠量的MSCs有效的遞送到受損組織，是干細(xì)胞移植的關(guān)鍵因素[12]。近年來，用生物材料承載干細(xì)胞可提升干細(xì)胞的治療效果已得到廣泛認(rèn)可[13-14]。膠原凝膠是一種水凝膠，具有水凝膠的特性，可以形成立體三維網(wǎng)狀支架，同時(shí)膠原蛋白是一種天然來源的高分子蛋白質(zhì)，它具有來源方便、無毒、低免疫原性和體內(nèi)可降解等優(yōu)勢[5]。膠原蛋白作為細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，具有良好的生物相容性，是一種理想的生物材料。它不僅提供細(xì)胞的靶向遞送的載體，同時(shí)對(duì)細(xì)胞黏附和組織三維重建提供支架作用，因此可以提高移植細(xì)胞的運(yùn)輸效率，并且可以提供移植細(xì)胞在體內(nèi)所需的生存空間，進(jìn)而可以增加移植細(xì)胞的存活率，并有助于在一定程度上改善單純的干細(xì)胞移植所存在的滯留率和存活率低而使治療效果受限的問題[5，15]。本實(shí)驗(yàn)表明，膠原凝膠本身對(duì)ALF無治療作用，但能明顯提高M(jìn)SCs在肝臟的定植率，同時(shí)通過對(duì)生存率和肝功能等的檢測，表明膠原凝膠能提高M(jìn)SCs對(duì)于ALF的治療效果。

圖4 膠原凝膠-MSCs激活肝臟內(nèi)PI3K/AKT通路

我們進(jìn)一步通過免疫組化，證實(shí)膠原凝膠復(fù)合MSCs可以顯著減輕肝細(xì)胞凋亡和肝臟損傷，肝臟內(nèi)TNF-α、IL-1β和IL-6等炎性因子的表達(dá)明顯降低。同時(shí)Ki-67組化和增殖相關(guān)蛋白的結(jié)果顯示膠原凝膠復(fù)合MSCs還可以提高損傷后肝細(xì)胞的增殖能力，進(jìn)而提高對(duì)于肝損傷的代償能力，促進(jìn)ALF肝臟的恢復(fù)。同時(shí)，我們證實(shí)PI3K/AKT通路在膠原凝膠復(fù)合MSCs緩解ALF中發(fā)揮重要作用。這項(xiàng)研究中，我們證明了移植膠原凝膠復(fù)合MSCs在治療D-Gal誘導(dǎo)的ALF方面表現(xiàn)出優(yōu)異的療效。這表明移植膠原凝膠復(fù)合MSCs可以作為優(yōu)化MSCs治療ALF的新方法。

基于實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們認(rèn)為，通過對(duì)MSCs進(jìn)行預(yù)處理，膠原支架和MSCs的結(jié)合可能是一種針對(duì)ALF的重要而有效的治療方法。本實(shí)驗(yàn)也存在一些不足，并未能深入探討膠原凝膠復(fù)合MSCs治療ALF的具體機(jī)制，后續(xù)將對(duì)其治療機(jī)制進(jìn)一步的探索與研究，并將研究結(jié)果用于臨床，為膠原凝膠復(fù)合MSCs移植治療急性肝衰竭的臨床應(yīng)用提供新的理論依據(jù)和參考。