尹麗麗, 李 珊, 周傳靜, 程 志, 鄭 紅, 劉艷明

(山東省食品藥品檢驗研究院, 山東 濟南 250101)

核苷酸是由含氮的堿基、環(huán)狀核糖或脫氧核糖、磷酸3種分子連接而成,堿基與糖通過糖苷鍵連接成核苷,核苷與磷酸以酯鍵連接,組成核苷酸。目前,嬰幼兒配方乳粉中添加的核苷酸的形式主要有5種:胞嘧啶核苷酸(CMP)、尿嘧啶核苷酸(UMP)、腺嘌呤核苷酸(AMP)、鳥嘌呤核苷酸(GMP)和次黃嘌呤核苷酸(IMP)。核苷酸是嬰兒生長發(fā)育必需的營養(yǎng)素,特別是在新生兒維持機體免疫系統(tǒng)功能、促進腸道成熟、肝臟的生長發(fā)育和代謝、脂質代謝等方面發(fā)揮重要作用[1-3]。當內源性核苷酸不能滿足人體需要時,補充外源性核苷酸非常必要[4,5]。由于牛乳、羊乳中核苷酸質量濃度和人乳中差距較大,所以部分代乳品中逐漸添加核苷酸以達到與人乳更加接近的目的。我國國家標準GB 14880-2012食品營養(yǎng)強化劑使用標準中規(guī)定了核苷酸在嬰幼兒配方食品中的添加量為0.12～0.58 g/kg(以核苷酸總量計)。由于羊奶中含有200多種營養(yǎng)物質和生物活性因子[6],營養(yǎng)價值高,比牛奶更容易消化吸收,所以越來越受歡迎,但也為檢測帶來了挑戰(zhàn)。

目前,嬰幼兒乳粉中核苷酸檢測的儀器方法主要有毛細管電泳法[7]、離子色譜法[8]、液相色譜-串聯(lián)質譜法[9-12]、液相色譜法[13-23]。毛細管電泳法靈敏度低、重現(xiàn)性差;離子色譜法易受其他寡核苷酸的干擾。液相色譜-串聯(lián)質譜雖然靈敏度高,去除干擾能力強,但質譜檢測器價格昂貴、操作復雜,同時因奶源及添加營養(yǎng)成分的復雜及多樣性,受基質影響比較大,需要用基質加標[9]或內標法定量,然而多數(shù)配方奶粉都添加了核苷酸,空白基質不易獲得,此外內標價格昂貴,成本較高。液相色譜-離子對色譜法[15,16]用離子對試劑作為流動相,因離子對試劑和固定相結合產(chǎn)生不可逆吸附,進而影響固定相活性位點,故可能對色譜柱造成不可逆的傷害。嬰幼兒乳粉中核苷酸檢測的前處理主要有沉淀蛋白質[18]、固相萃取[20-22]和快速溶劑萃取[13]等方式。沉淀法只能選擇性去除部分蛋白質,抗干擾能力差;趙貞等[20,21]選用的固相萃取方式上樣即接液或未經(jīng)淋洗步驟,凈化效果弱。快速溶劑萃取法具有全封閉式萃取-無污染、自動化程度高的優(yōu)點,但同時存在必須配備自動化萃取儀的缺陷,方法的適用性和推廣性差。

羊奶中蛋白質、脂肪結構與母乳十分相似,是公認的最接近人奶的奶品,被稱為“奶中之王”,關注度也越來越高。但由于羊奶中除了本身含有允許添加的核苷酸外,還富含多種非蛋白氮、更多的不飽和脂肪酸等200多種營養(yǎng)素和生物活性物質,給羊奶粉中核苷酸檢測帶來較大挑戰(zhàn)[24,25]。目前,未查到針對羊奶粉中核苷酸的測定及分析的相關文獻。本文針對小分子干擾多的羊奶粉,通過對多種方法比較,優(yōu)化了提取、凈化和色譜條件,建立了適用于牛奶粉和羊奶粉中核苷酸檢測的液相色譜法,方法適用性強、抗干擾能力佳、凈化效果好,結果準確度高,為嬰幼兒配方乳粉的質量監(jiān)控和研究提供了參考和依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Waters 2695高效液相色譜儀(配二級管陣列檢測器)、Atlantis T3色譜柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)、ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm)、HLB固相萃取柱(20 mL/1 000 mg)購自美國Waters公司;Gemini C18色譜柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)購自美國Phenomenex公司;AB204-S型電子天平購自瑞士Mettler Toledo公司。SAX固相萃取柱(6 mL/1 000 mg)購自德國MACHEREY NAGEL公司。

甲醇(色譜純)購自德國Merck公司;磷酸(色譜純)、磷酸二氫鉀(KH2PO4,優(yōu)級純)、氫氧化鉀(分析純)、鹽酸(分析純)、氫氧化鈉(分析純)、氯化鈉(NaCl,分析純)、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA,分析純)、溴化鉀(分析純)購自國藥集團化學試劑有限公司;CMP(純度≥99%)、UMP(純度≥99%)、IMP(純度≥99%)、GMP(純度≥98%)、AMP(純度≥98%)購自美國Sigma公司;奶粉質控樣品NIST SRM 1849a購自美國國家標準技術研究所。

1.2 標準溶液的配制

準確稱取5種核苷酸標準物質各10 mg,用水溶解并定容至10 mL,配制成質量濃度為1 g/L的標準物質母液。分別量取標準物質母液(25、50、100、250和500 μL)至50 mL容量瓶中,用0.5 mol/L pH 3.0磷酸二氫鉀溶液定容至刻度,配制成質量濃度為0.5、1、2、5和10 mg/L的標準工作液。

1.3 樣品處理過程

1.3.1等電點沉淀法(方法一)

準確稱取1 g樣品于50 mL離心管中,加入30 mL溫水溶解,渦旋,超聲10 min,用1 mol/L鹽酸調節(jié)樣品的pH值至1.7±0.1,靜置1 min,再用1 mol/L氫氧化鈉溶液調節(jié)樣品的pH值至4.5±0.1。定容至50 mL,混勻后經(jīng)濾紙過濾,待凈化。

1.3.2等電點沉淀&HLB柱凈化法(方法二)

移取2 mL 1.3.1節(jié)待凈化液過HLB柱(經(jīng)4 mL甲醇、10 mL水活化),加入4 mL水淋洗,用4 mL甲醇洗脫,收集洗脫液,過0.22 μm水相濾膜待上機測定。上樣、淋洗、洗脫步驟流速應控制在2 mL/min。

1.3.3等電點沉淀&SAX柱凈化法(方法三)

移取4 mL 1.3.1節(jié)待凈化液過SAX柱(經(jīng)4 mL甲醇、10 mL水活化),加入4 mL溴化鉀淋洗液(0.3 mol/L),用4 mL 0.5 mol/L pH 3.0磷酸二氫鉀洗脫液,收集洗脫液并定容至4 mL,過0.22 μm水相濾膜待上機測定。上樣、淋洗、洗脫步驟流速應控制在2 mL/min[21]。

1.3.4NaCl& EDTA沉淀&SAX柱凈化法(方法四)

準確稱取1 g樣品于50 mL離心管中,加入30 mL提取液(1 mol/L NaCl和5 mmol/L EDTA),渦旋,超聲10 min,用水定容至50 mL,待凈化。移取4 mL處理液過SAX柱(經(jīng)4 mL甲醇、10 mL水活化),用4 mL溴化鉀(0.3 mol/L)淋洗,用4 mL 0.5 mol/L pH 3.0磷酸二氫鉀洗脫,收集洗脫液并定容至4 mL,過0.22 μm水相濾膜待上機測定。上樣、淋洗、洗脫步驟流速應控制在2 mL/min。

1.4 高效液相色譜條件

色譜柱:Atlantis T3(250 mm×4.6 mm, 5 μm)和Gemini C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm);柱溫:40 ℃;進樣量:20 μL;流速:0.6 mL/min;流動相A: 10 mmoL/L pH 5.6 KH2PO4;流動相B:甲醇;檢測波長:260 nm。梯度洗脫條件見表1。

表1 液相色譜法梯度洗脫條件

A: 10 mmoL/L pH 5.6 KH2PO4; B: methanol.

1.5 超高效液相色譜-串聯(lián)質譜條件

1.5.1液相色譜條件

色譜柱:ACQUITY UPLC HSS T3(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm);柱溫:40 ℃;進樣量:5 μL;流速:0.25 mL/min;流動相A: 0.1%(體積分數(shù))甲酸水;流動相B:甲醇。梯度洗脫條件見表2。

表2 超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法梯度洗脫條件

A: 0.1% (v/v) formic acid; B: methanol.

1.5.2質譜條件

離子源:電噴霧離子源(ESI+);離子源溫度:150 ℃;錐孔氣流量:150 L/h;脫溶劑氣溫度:450 ℃;脫溶劑氣流量:850 L/h;錐孔電壓:40 V;掃描模式:多反應監(jiān)測(MRM)掃描;其他質譜參數(shù)見表3。

表3 CMP質譜參數(shù)

* Quantitative daughter ion.

2 結果與討論

2.1 前處理的考察

針對嬰幼兒乳粉中核苷酸的前處理方式主要有沉淀蛋白質[18]、固相萃取[20-22]等,其中固相萃取主要包括HLB柱和SAX柱凈化兩種。本文考察了方法一----等電點沉淀蛋白質法對目標物含量的測定,實驗(結果見圖1)發(fā)現(xiàn),牛奶粉和羊奶粉都存在多種干擾物質,尤其是CMP和GMP附近干擾嚴重,嚴重影響定量,須進一步對樣品凈化。

圖1 方法一處理乳粉后的色譜圖

由于HLB柱是以親脂性二乙烯苯和親水性N-乙烯基吡咯烷酮兩種單體按照一定比例聚合成的大孔共聚物,其保留機理為反相,為通用型固相萃取小柱。本研究嘗試采用方法二----等電點沉淀& HLB柱凈化法實施樣品凈化,結果顯示HLB柱在上樣過程有CMP、UMP和IMP流出、淋洗過程有CMP、UMP、GMP和AMP流出,說明核苷酸在HLB柱上保留效果差,此柱不適合乳粉中核苷酸的凈化。

圖2 CMP光譜圖比較

由于強陰離子交換柱-SAX鍵合基團為永久性帶正電的基團----季銨基,針對弱酸性化合物選擇性高、保留能力強。本文參考鄭紅等[21]的文獻,根據(jù)化合物等電點優(yōu)化的最佳pH,考察了方法三----等電點沉淀&SAX柱凈化法對5種目標物的凈化效果,結果(見圖2)表明,牛奶粉凈化效果良好,但羊奶粉中CMP的色譜峰形雖然良好,但其光譜圖與標準工作液差異大,仍存在干擾雜質。

鑒于方法三去除CMP中的干擾雜質能力差,利用NaCl的鹽析功能和EDTA的絡合作用(即方法四)去除雜質,結果表明,該方法對牛奶粉和羊奶粉均有較好的凈化效果,很好地解決了羊奶粉CMP的雜質干擾問題。方法三測定CMP值為0.369 3 g/kg、CMP光譜圖與標準工作液光譜圖明顯不一致,方法四測定CMP值降至0.066 5 g/kg, CMP光譜圖與標準工作液一致,說明方法四凈化效果好。

圖3 不同階段CMP光譜圖和LC-MS/MS色譜圖

為進一步研究方法四對羊奶粉中CMP的凈化及保留效果,分別測定上樣后溶液、淋洗后溶液,發(fā)現(xiàn)均有與CMP保留時間一致的化合物流出,但光譜圖與標樣存在差異。如圖3所示,經(jīng)液相色譜-串聯(lián)質譜進一步確認,上樣、淋洗后溶液在CMP保留時間處無目標峰,不存在與CMP相同的母離子、子離子,故為雜質。此外洗脫液中CMP離子比率與標樣一致,結果與方法四一致。

綜上所述,方法四用NaCl& EDTA沉淀&SAX柱凈化法的前處理條件,對目標物選擇性好,凈化效果優(yōu),適用于嬰幼兒乳粉尤其是羊奶粉中核苷酸的檢測。

圖4 不同色譜柱對羊奶粉的分離效果

圖5 雜質峰1、GMP、雜質峰2及IMP光譜圖

2.2 色譜條件的考察

Atlantis T3色譜柱對硅羥基進行特殊封端處理----裸露硅羥基適量但不完全封端,對極性化合物保留強,兼容100%水相。Gemini C18色譜柱與聚合物型填料類似,具有寬廣的PH穩(wěn)定性,在100%緩沖液流動相中保持穩(wěn)定。本文考察了Gemini C18柱和Atlantis T3色譜柱對于目標物的分離效果。牛奶粉基質中GMP和IMP峰前不存在干擾峰,Gemini C18和Atlantis T3色譜柱對其分離效果相當。羊奶粉中由于小分子化合物多,尤其在GMP和IMP峰前易存在干擾峰,色譜柱的分離效果直接影響準確定量(見圖4)。如圖5所示,羊奶粉中雜質峰1光譜圖與GMP類似,在Gemini C18柱上兩者分離度差,影響準確定量;IMP在Gemini C18柱定量結果偏高,可能是由于IMP與雜質峰2在Gemini C18柱上合為一個峰所致;Atlantis T3柱能有效分離干擾雜質峰1和峰2,使GMP和IMP定性定量準確。綜合比較,Atlantis T3色譜柱抗干擾能力強,分離效果好,適用于復雜基質中核苷酸的測定。

2.3 方法學考察

2.3.1線性范圍與檢出限

將標準工作液由低濃度到高濃度經(jīng)液相色譜測定,以5種核苷酸峰面積為縱坐標(以Y表示)、濃度為橫坐標(以X表示,單位為mg/L)繪制標準曲線。采用空白基質加標的方法,以信噪比S/N=3得到目標物的檢出限(LOD),以信噪比S/N=10得到目標物的定量限(LOQ),計算方法檢出限和定量限。線性回歸方程及檢出限、定量限值見表4。

2.3.2回收率和精密度

實驗采取陰性樣品中添加0.05、0.10和0.50 g/kg 3個水平的標準溶液,每個水平平行測定6次,得到方法的回收率及精密度,結果見表5。結果顯示,3個水平的加標回收率為91.1%～110%,相對標準偏差為2.3%～4.7%。本方法對乳粉質控樣品NIST SRM 1849a進行檢測,結果與中位值比較的偏差在10%以內,具體結果見表6。

表4 5種核苷酸的線性回歸方程、相關系數(shù)、檢出限及定量限

Y: intensity,X: mass concentration, mg/L.

2.4 實際樣品的測定

選擇市售品牌(品牌1～3為牛奶粉,品牌4～6為羊奶粉)的嬰幼兒配方乳粉進行測定,結果見表7。結果顯示,核苷酸的測定結果與標示值含量相當,且滿足GB 14880-2012中0.12～0.58 g/kg的要求。

表5 樣品中5種核苷酸的回收率及精密度(n=6)

表6 NIST SRM 1849a中核苷酸的含量

表7 嬰幼兒配方乳粉中核苷酸的含量

ND: not detected.

3 結論

本文優(yōu)化了前處理條件和色譜條件,建立了嬰幼兒乳粉中5種核苷酸的高效液相色譜法,解決了羊奶粉中核苷酸測定的干擾問題。通過方法學驗證,比對了乳粉質控樣NIST SRM 1849a的檢測結果,結果滿意。綜上所述,該方法穩(wěn)定性好,準確度高,結果可靠。通過本文的研究,為監(jiān)管部門和企業(yè)自控提供了技術支持。