楊雨菲, 夏云燕, 吳 莎, 鄒巧根*

(1.南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院, 江蘇 南京 211816; 2.南京工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院, 江蘇 南京 211816)

苯海索(C20H31NO, trihexyphenidyl),化學(xué)名為(±)-α-環(huán)己基-α-苯基-1-哌啶丙醇。苯海索為抗膽堿能藥物,通過(guò)抑制黑質(zhì)-紋狀體內(nèi)膽堿能神經(jīng)活性抑制副交感神經(jīng),用于緩解運(yùn)動(dòng)障礙、震顫等癥狀。苯海索通常被用于帕金森病的治療,臨床研究[1,2]顯示,單獨(dú)使用苯海索能夠顯著降低帕金森癥狀的發(fā)生,并且不良反應(yīng)相對(duì)較少。苯海索還可用于精神疾病的治療及輔助治療[3],可用于減緩精神分裂癥陰性癥狀、精神障礙、靜坐不能、流涎和撤藥等癥狀。有臨床研究[4]將苯海索與抗精神病藥物(包括氯氮平、維思通、奮乃靜、喹硫平、氯丙嗪和氟哌啶醇)聯(lián)用，用于減輕或預(yù)防由抗精神病藥物引起的錐體外系不良反應(yīng)。苯海索還可用于治療腦性癱瘓肌張力障礙[5],療效良好的同時(shí)無(wú)嚴(yán)重不良反應(yīng)。

基于苯海索熔沸點(diǎn)較低的性質(zhì),早期對(duì)于苯海索的體內(nèi)檢測(cè)多利用氣相色譜偶聯(lián)不同檢測(cè)器進(jìn)行定量分析[6],也有通過(guò)液相色譜-質(zhì)譜法[7]和放射性免疫分析法[8]對(duì)苯海索進(jìn)行定量檢測(cè)。目前對(duì)于苯海索血漿樣品的前處理方法主要采用液液萃取法和固相萃取法。液液萃取法常用的萃取劑為乙酸乙酯[7]、乙酸乙酯-正己烷(1∶3, v/v)[9]、環(huán)己烷[10]、庚烷[11]和苯-乙酸乙酯(1∶1, v/v)[12]等。固相萃取法利用Sep-Pak C18固相萃取柱[11]、Isolute HCX-5 (100 mg)混合模式固相萃取柱[13]提取樣品。有報(bào)道表明，生物樣本分析采用區(qū)別于傳統(tǒng)前處理方法的手段，包括利用新體系對(duì)樣品進(jìn)行萃取[14]、衍生化前處理[15]等。針對(duì)苯海索體內(nèi)研究的新方向包括利用新型電極碳糊電極(CPE)對(duì)苯海索片劑及尿液樣本進(jìn)行檢測(cè)[16]。此外,利用鈰(IV)(Ce(IV))或高錳酸鉀(KMnO4)在酸性介質(zhì)中誘導(dǎo)銅納米團(tuán)簇(CuNCs)化學(xué)發(fā)光(CL)的方法也被用于苯海索的定量檢測(cè)[17]。通過(guò)對(duì)血漿[7-11,17]、血清[18]、全血[6,12]、頭發(fā)[19]和尿液樣本[10,13,16]的檢測(cè),可對(duì)苯海索進(jìn)行臨床用藥監(jiān)測(cè)和藥代動(dòng)力學(xué)研究等。

現(xiàn)有的對(duì)于苯海索血漿樣品的檢測(cè)方法仍存在前處理方法繁瑣耗時(shí)、檢測(cè)分析時(shí)間長(zhǎng)、不適用于大批量樣品檢測(cè)等問題,因而有必要開發(fā)一種簡(jiǎn)便快捷、靈敏、適用于高通量分析的方法,以滿足人血漿中苯海索定量分析的檢測(cè)要求。

本文建立了一種超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)測(cè)定人血漿中苯海索含量的方法。采用以甲醇為沉淀劑的蛋白質(zhì)沉淀前處理方法,提取過(guò)程快速簡(jiǎn)便且回收率高,靈敏度良好。應(yīng)用本方法考察了空腹及餐后健康受試者的藥代動(dòng)力學(xué)行為,并進(jìn)行了生物等效性評(píng)價(jià)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

超高效液相色譜儀配有LC-30AD液相色譜泵、DGU-20A5R脫氣機(jī)、CTO-20AC柱溫箱和SIL-30ACMP自動(dòng)進(jìn)樣器(Shimadzu公司,日本); API5500型三重四極桿質(zhì)譜儀、Turbo Spray離子源(Applied Biosytems/Sciex公司,美國(guó)); XP6微量天平(Mettler Toledo公司,瑞士); Heraeus Muitifuge X1R離心機(jī)(Thermo Fisher公司,美國(guó)); Milli DirectQ純水儀(Millipore公司,美國(guó))。

鹽酸苯海索對(duì)照品(純度100%,批號(hào):1.2)購(gòu)自法國(guó)European Pharmacopoeia公司;鹽酸苯海索-d11(純度98.0%,批號(hào):13-YSW-162-1)購(gòu)自加拿大TRC公司。鹽酸苯海索片受試制劑(2 mg,批號(hào):1806001)購(gòu)自天津力生制藥有限公司;鹽酸苯海索片參比制劑(2 mg,批號(hào):1257989M)購(gòu)自美國(guó)Watson公司。乙腈和甲醇購(gòu)自德國(guó)Merck公司;甲酸和醋酸銨購(gòu)自阿拉丁公司;異丙醇購(gòu)自永華化學(xué)科技江蘇有限公司,以上試劑均為色譜級(jí)。超純水為實(shí)驗(yàn)室純水儀自制。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

稱取適量鹽酸苯海索對(duì)照品,用甲醇溶解,配制成質(zhì)量濃度為1.00 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,于2～8 ℃保存;用乙腈-水(30∶70, v/v)配制質(zhì)量濃度為2.00、4.00、20.0、40.0、100、300、700和800 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和質(zhì)量濃度為2.00、5.00、40.0和600 ng/mL的質(zhì)控樣品工作溶液。

稱取適量鹽酸苯海索-d11對(duì)照品,經(jīng)過(guò)質(zhì)量校正系數(shù)進(jìn)行校正,用甲醇溶解,配制成質(zhì)量濃度為1.00 mg/mL的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液,于2～8 ℃保存;用乙腈-水(30∶70, v/v)稀釋至25 ng/mL,作為內(nèi)標(biāo)工作液。

1.3 血漿樣品前處理

向96孔板中加入50 μL血漿樣品,然后加入10 μL 25.0 ng/mL內(nèi)標(biāo)工作溶液和10 μL 100 mmol/L醋酸銨水溶液,渦旋混勻;加入400 μL甲醇沉淀,振蕩混勻,于4 ℃以4 000 r/min離心5 min;轉(zhuǎn)移100 μL上清液于40 ℃吹干,用300 μL乙腈-水(30∶70, v/v)復(fù)溶,進(jìn)樣分析。

1.4 分析條件

色譜柱:Acquity UPLC BEH C8柱(50 mm×2.1 mm, 1.7 μm,美國(guó)Waters公司);柱溫:40 ℃;自動(dòng)進(jìn)樣器溫度:5 ℃;流速:0.4 mL/min;流動(dòng)相A:乙腈-水(95∶5, v/v);流動(dòng)相B: 0.1%(v/v)甲酸水溶液(含5 mmol/L醋酸銨);進(jìn)樣量:5 μL。洗脫梯度見表1。

表1 梯度洗脫程序

A: acetonitrile-water (95∶5, v/v); B 0.1% (v/v) formic acid aqueous solution containing 5 mmol/L ammonium acetate.

離子源:電噴霧電離(ESI)源,正離子模式;掃描模式:多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式;離子源溫度(TEM): 550 ℃;離子化電壓(IS): 2 500 V;碰撞氣(CAD)壓力:0.06 MPa;噴霧氣(GS1)壓力:0.4 MPa;輔助加熱氣(GS2)壓力:0.4 MPa。苯海索反應(yīng)檢測(cè)離子對(duì)為302.3→98.0 (m/z),碰撞電壓(CE)為32 V;苯海索-d11反應(yīng)檢測(cè)離子對(duì)為313.2→98.1 (m/z), CE為33 V;苯海索及苯海索-d11的去簇電壓(DP)、入口電壓(EP)和碰撞室出口電壓(CXP)分別為100、10和13 V。苯海索及苯海索d-11的質(zhì)譜圖見圖1。

圖1 苯海索和苯海索-d11的質(zhì)譜圖

1.5 臨床試驗(yàn)方案

本次試驗(yàn)為隨機(jī)、自身交叉、兩序列兩周期、設(shè)盲的人體生物等效性試驗(yàn)。以力生制藥研制的鹽酸苯海索片(2 mg)為受試制劑,以Watson生產(chǎn)的鹽酸苯海索片(2 mg)為參比制劑進(jìn)行空腹和餐后的單次口服給藥的生物等效性相關(guān)試驗(yàn)。該臨床試驗(yàn)在獲得倫理委員會(huì)批準(zhǔn)后開展進(jìn)行。相鄰兩周期之間設(shè)置清洗期,時(shí)間為14 d。

研究分為兩部分,第一部分為空腹給藥,第二部分為餐后給藥,兩部分各篩選30例受試者。受試者充分了解實(shí)驗(yàn)內(nèi)容后簽署知情同意書。其中空腹試驗(yàn)中22號(hào)受試者因故主動(dòng)退出,因此未納入生物等效性分析。

試驗(yàn)每例受試者在每個(gè)周期服藥前1 h內(nèi)(記為0 h)及服藥后15、30、45、60、80、100、120和150 min,以及3、4、6、8、12、24、36、48、72、96和120 h采血。所采集的血樣置于含有肝素鈉為抗凝劑的采血管中,采集完成后于1 h內(nèi)于2～8 ℃以4 000 r/min離心10 min,獲得血漿樣品。

1.6 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析

使用WinNonlin 8.0軟件處理血藥濃度數(shù)據(jù)并計(jì)算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù),同時(shí)對(duì)參數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。將達(dá)峰濃度(Cmax)、時(shí)間從零點(diǎn)到最后一個(gè)時(shí)間點(diǎn)的血藥濃度-時(shí)間曲線下面積(AUC0-t)和時(shí)間從零點(diǎn)到無(wú)窮大時(shí)的血藥濃度-時(shí)間曲線下面積(AUC0-∞)經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后進(jìn)行方差分析,并通過(guò)計(jì)算90%置信區(qū)間的方法對(duì)參比制劑和受試制劑進(jìn)行生物等效性分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1線性關(guān)系

取空白血漿950 μL,加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液50 μL,配制成苯海索質(zhì)量濃度分別為0.100、0.200、1.00、2.00、5.00、15.0、35.0和40.0 ng/mL的血漿樣品,按1.3節(jié)描述進(jìn)行前處理并進(jìn)樣分析。在Analyst軟件中積分,以待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值(y)為縱坐標(biāo)、待測(cè)物的血藥濃度(x, ng/mL)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸,權(quán)重因子(w)為1/x2。結(jié)果表明,苯海索在0.100～40.0 ng/mL范圍內(nèi),相關(guān)系數(shù)(r)為0.998 4～0.999 0,線性關(guān)系良好。

圖2 人血漿中苯海索及苯海索-d11的典型提取離子色譜圖

2.1.2準(zhǔn)確度和精密度

取空白血漿950 μL,加入不同濃度的質(zhì)控工作液50 μL,配制成定量下限(LLOQ)、低、中、高4個(gè)水平(0.100、0.250、2.00和30.0 ng/mL)的質(zhì)控樣品,每個(gè)水平各重復(fù)6個(gè),按1.3節(jié)方法進(jìn)行前處理,并連續(xù)測(cè)定3批,考察批內(nèi)、批間的準(zhǔn)確度和精密度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,批內(nèi)和批間準(zhǔn)確度分別為97.9%～115.5%和103.1%～110.5%,批內(nèi)和批間精密度分別為2.5%～10.7%和4.5%～7.8%。表明方法準(zhǔn)確度及精密度均良好。

2.1.3選擇性

取6批不同來(lái)源的空白血漿,通過(guò)1.3節(jié)方法進(jìn)行前處理(其中內(nèi)標(biāo)工作液以乙腈-水(30∶70, v/v)代替)后進(jìn)樣檢測(cè)。取空白血漿、定量下限濃度血漿樣品、定量上限(ULOQ)濃度(40.0 ng/mL)的血漿樣品和健康受試者單劑量口服2 mg鹽酸苯海索片1.0 h后的血漿樣品,按1.3節(jié)方法進(jìn)行前處理(其中含定量上限濃度苯海索的血漿樣品中內(nèi)標(biāo)工作液用乙腈-水(30∶70, v/v)代替)后進(jìn)樣檢測(cè),相關(guān)色譜圖見圖2。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同來(lái)源空白血漿中內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)苯海索及苯海索-d11的測(cè)定無(wú)干擾,同時(shí)待測(cè)物和內(nèi)標(biāo)互相不干擾測(cè)定。

2.1.4基質(zhì)效應(yīng)

取來(lái)自6個(gè)受試者的空白基質(zhì),在低、中、高3個(gè)水平(0.250、2.00和30.0 ng/mL)下分別計(jì)算苯海索及內(nèi)標(biāo)的基質(zhì)因子,并且計(jì)算經(jīng)內(nèi)標(biāo)歸一化后的基質(zhì)因子?；|(zhì)因子是指在基質(zhì)中待測(cè)物的響應(yīng)峰面積與純?nèi)芤褐写郎y(cè)物響應(yīng)峰面積的比值,內(nèi)標(biāo)歸一化的基質(zhì)因子為待測(cè)物的基質(zhì)因子與內(nèi)標(biāo)基質(zhì)因子的比值。結(jié)果顯示,高、中、低3個(gè)水平的質(zhì)控樣品經(jīng)內(nèi)標(biāo)校正后的基質(zhì)因子分別為99.0%、99.0%和101%,表明基質(zhì)效應(yīng)不影響苯海索的定量測(cè)定。

以高脂(含300 mg/dL甘油三酯)和溶血(將全血渦旋后加入對(duì)應(yīng)體積的空白基質(zhì)中混勻配制成2.0%(v/v)溶血血漿)基質(zhì)配制低水平(0.250 ng/mL)和高水平(30.0 ng/mL)血漿樣品,通過(guò)1.3節(jié)方法進(jìn)行前處理后進(jìn)樣分析,用于考察高脂和溶血對(duì)于樣品檢測(cè)的影響。結(jié)果顯示,高脂及溶血均不影響測(cè)定方法的準(zhǔn)確度和精密度。

2.1.5提取回收率

將低、中、高3個(gè)水平(0.250、2.00和30.0 ng/mL)的待測(cè)物苯海索樣品進(jìn)行前處理,與未經(jīng)提取處理的樣品進(jìn)行比較,考察回收率。結(jié)果表明,低、中、高3個(gè)水平血漿樣品中苯海索的提取回收率分別為98.4%、95.2%和94.9%,顯示該蛋白質(zhì)沉淀的前處理方法提取回收率較高。

表2 健康受試者空腹(n=29)及餐后(n=30)服用受試制劑及參比制劑后的主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù) (mean±SD)

Tmax: time ofCmax;Cmax: maximum plasma concentration; AUC0-t, AUC0-∞: areas under the plasma concentration-time curves from zero to the last measurable concentration or to infinity;t1/2: terminal half-life.

2.1.6穩(wěn)定性

實(shí)驗(yàn)分別考察了低含量(0.250 ng/mL)和高含量(30.0 ng/mL)血漿樣品的凍融穩(wěn)定性、長(zhǎng)期儲(chǔ)存穩(wěn)定性、前處理過(guò)程中的穩(wěn)定性和全血穩(wěn)定性。取在不同實(shí)驗(yàn)條件下放置的樣品,通過(guò)1.3節(jié)前處理方法處理后進(jìn)樣分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,血漿樣品于-80 ℃經(jīng)過(guò)4次凍融、室溫條件下放置26 h、處理后在進(jìn)樣室(2～8 ℃)放置7 d、于-80 ℃保存77 d,低濃度質(zhì)控樣品及高濃度血漿樣品對(duì)比理論值的相對(duì)誤差為-4.6%～10.5%,表明在上述條件下苯海索血漿樣品均穩(wěn)定。

配制含待測(cè)物的全血樣品,部分全血樣品離心獲得血漿作為零時(shí)間點(diǎn)樣品,其余全血樣品在室溫和冰浴條件下分別放置2 h后離心獲得血漿作為全血穩(wěn)定性樣品,將穩(wěn)定性樣品與零時(shí)間點(diǎn)樣品經(jīng)過(guò)1.3節(jié)樣品前處理后進(jìn)樣分析,結(jié)果顯示全血樣品冰浴及室溫放置2 h內(nèi)均穩(wěn)定。

2.2 血漿樣品中苯海索的測(cè)定

采用上述方法測(cè)定健康受試者在空腹和餐后單次給予鹽酸苯海索參比制劑和受試制劑(2 mg)后的血藥濃度,以時(shí)間為橫坐標(biāo)、血藥濃度為縱坐標(biāo)分別繪制參比制劑和受試制劑在空腹和餐后的苯海索血藥濃度-時(shí)間曲線。受試者空腹及餐后單劑量口服鹽酸苯海索片后前24 h平均血藥濃度-時(shí)間曲線見圖3。

圖3 受試者空腹及餐后單劑量口服鹽酸苯海索片后前24 h的平均血藥濃度-時(shí)間曲線

如表2所示，采用WinNonlin 8.0軟件,選擇非房室模型,按實(shí)際采血時(shí)間及血藥濃度計(jì)算主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。分別將Cmax、AUC0-t和AUC0-∞對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換,計(jì)算獲得其90%置信區(qū)間?？崭乖囼?yàn)中Cmax、AUC0-t和AUC0-∞的90%置信區(qū)間為82.2%～99.4%、82.3%～97.3%和83.4%～97.9%,餐后條件下分別為100.8%～122.8%、96.8%～112.4%和96.6%～112.1%,均在80.0%～125.0%范圍內(nèi),表明參比制劑和受試制劑在空腹和餐后條件下吸收速度和吸收程度均無(wú)顯著差異,具有生物等效性。

通過(guò)對(duì)比餐后和空腹試驗(yàn)結(jié)果,進(jìn)食對(duì)于Cmax起到降低作用,并且達(dá)峰時(shí)間獲得較大延長(zhǎng)。而對(duì)于AUC0-t和AUC0-∞并無(wú)顯著差異。因此,進(jìn)食較大地影響了鹽酸苯海索的吸收速度,而對(duì)于吸收程度并無(wú)較大影響,食物對(duì)于苯海索體內(nèi)濃度的波動(dòng)具有較大影響,參比制劑和受試制劑受食物影響的體內(nèi)行為相似。

3 結(jié)論

本文建立了靈敏、高效、準(zhǔn)確的UPLC-MS/MS法定量分析人血漿中的苯海索,并應(yīng)用于空腹和餐后苯海索片人體生物等效性評(píng)價(jià)。該方法靈敏度高,前處理方法簡(jiǎn)便快捷,可應(yīng)用于大批量樣品分析,為仿制藥的質(zhì)量研究和控制提供參考。