沈雋　林建國

【摘 要】乳制品飲料生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的大量廢水因其具有排放量大、有機物含量高、成分復雜等特點，對生態(tài)環(huán)境造成了嚴重污染。本文從乳制品企業(yè)生產(chǎn)車間及其廢水處理活性污泥中獲取樣品，通過篩選獲得了COD去除率與蛋白質(zhì)降解率表現(xiàn)較好的F1地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）、F3枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和W11短短芽孢桿菌（Brevibacillus brevis）三株菌株。在30℃、pH為7的試驗條件下，以模擬乳制品廢水作為底物，研究了利用三株菌株不同組合混合發(fā)酵去除COD和降解蛋白質(zhì)的能力。研究結(jié)果表明，F(xiàn)3/W11兩株菌組合混合發(fā)酵處理效果最好，處理72h后得到最佳蛋白去除率達到87.38%，最佳COD去除率達到77.61%。

【關(guān)鍵詞】乳制品飲料生產(chǎn)廢水;生物處理;COD去除率;蛋白降解率

中圖分類號： X792文獻標識碼： A 文章編號： 2095-2457（2019）27-0008-003

DOI：10.19694/j.cnki.issn2095-2457.2019.27.003

【Abstract】Wastewater generated during dairy beverage production is a source of major environmental pollution due to its massive volume， high concentration of organic matter and complex composition. In this article， we collected samples from the dairy production workshop and wastewater treatment activated sludge. Showing characters of higher COD removal rate and better protein degradation performance，F(xiàn)1（Bacillus licheniformis），F(xiàn)3（Bacillus subtilis）and W11（Brevibacillus brevis）were obtained after screening. With experiment set at 30℃，pH 7，simulated dairy wastewater as substrate， the 3 bacterial strains were combined in every way， fermented and studied for COD removal and protein degeneration performance. The results showed that fermented F3/W11 strain mixture had the best effect， with a 87.38% protein removal rate and a 77.61% COD removal rate after 72h treatment.

【Key words】Wastewater from dairy beverage production; Biological treatment; COD removal rate; Protein degradation rate

近年來，乳制品飲料銷量逐年遞增，其在生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的大量廢水具有排放量大、有機物含量高、成分復雜等特點，不達標排放將對生態(tài)環(huán)境造成了嚴重污染。

目前，國內(nèi)外對乳制品廢水處理的研究主要集中在工藝流程的設(shè)計和運行參數(shù)的優(yōu)化上，對于能夠?qū)θ橹破窂U水發(fā)酵降解的微生物研究較少[1]。微生物發(fā)酵法技術(shù)成熟后可與傳統(tǒng)廢水處理方式相結(jié)合，對于治理乳制品廢水問題具有重要的實踐指導意義。

本文從乳制品企業(yè)生產(chǎn)車間及其廢水處理活性污泥中獲取樣品，篩選出三株COD去除率與蛋白質(zhì)降解率表現(xiàn)較好的菌株[2]，研究了模擬乳品廢水培養(yǎng)基發(fā)酵處理過程中溫度、pH、菌種以及發(fā)酵時間對蛋白降解和COD去除效果的影響。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

F1地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）、F3枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），W11短短芽孢桿菌（Brevibacillus brevi）由本實驗室分離篩選。

1.1.2 基礎(chǔ)培養(yǎng)基NA

蛋白胨10.0g、牛肉粉3.0g、氯化鈉5.0g、瓊脂15.0g、蒸餾1000mL，煮沸溶解，調(diào)節(jié)pH=7.3±0.2。分裝錐形瓶，121℃高壓滅菌15min。

1.1.3 模擬乳品廢水培養(yǎng)基

稀釋到COD 3000mg/L的均質(zhì)全脂牛奶、NH4Cl（0.57g/L）、KH2PO4（（0.21g/L）、K2HPO4（0.54g/L）和Na2HPO4（0.67g/L）、（COD：N：P比100：5：1）[3]。

1.2 儀器與設(shè)備

本研究使用的儀器設(shè)備主要有生物安全柜、紫外可見光分光光度計等，具體見表1：

1.3 方法

1.3.1 菌種接種量和比例

將保存于斜面上的三株菌種分別接種到NA培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)48h，挑取單菌落接種至NA液體培養(yǎng)基中，待菌量生長至108CFU/mL，取6mL培養(yǎng)基接種到裝有600mL模擬廢水培養(yǎng)基的錐形瓶中[4]。

1.3.2 蛋白質(zhì)含量測定

不同條件處理樣品后，采用BradFord法測定樣品中的蛋白質(zhì)含量[5]，再計算蛋白降解率。

1.3.3 COD含量測定

不同條件處理樣品后，采用重鉻酸鉀硫酸回流法（CODcr）測定樣品中的COD含量[6]，再計算COD去除率。

1.3.4 模擬廢水單株菌發(fā)酵試驗

試驗的初始條件為pH=7，挑取單菌落接種至NA液體培養(yǎng)基中，待菌量長至108CFU/mL，取6mL培養(yǎng)基接種到裝有600mL模擬廢水培養(yǎng)基的錐形瓶中，即初始接種量為106CFU/mL。將接種好的模擬廢水培養(yǎng)基置于恒溫搖床上，30℃，120rpm培養(yǎng)96h，每隔12h取樣一次，分別測定樣品的COD值和蛋白含量[7]。

1.3.5 模擬廢水混合發(fā)酵試驗

為了能夠使模擬廢水培養(yǎng)基體系經(jīng)過處理能夠達到理想的排放標準，研究了F1/W11兩菌株組合、F3/W11兩株菌組合、F1/F3/W11三株菌株組合三種發(fā)酵方式對模擬廢水培養(yǎng)基體系蛋白降解率與COD去除率的影響[8]。兩菌株組合發(fā)酵試驗中，各取3mL接種到裝有600mL模擬廢水培養(yǎng)基的錐形瓶中，初始接種量為106CFU/mL;三菌株組合發(fā)酵試驗中，各取2mL培養(yǎng)基接種到裝有600mL模擬廢水培養(yǎng)基的錐形瓶中，初始接種量為106CFU/mL。將接種好的模擬廢水培養(yǎng)基置于恒溫搖床上，30℃，120rpm培養(yǎng)72h，每隔12h取樣一次，監(jiān)測菌群的生長情況，并分別測定樣品的COD值和蛋白含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 單株菌的最適發(fā)酵處理條件

根據(jù)試驗得出各因素對蛋白質(zhì)降解的影響情況，結(jié)果如圖1所示。

從圖1可以看出，菌株對蛋白去除的影響最大，其中發(fā)酵處理效果最好的菌株為F3，其次為F1，最差為W11;溫度對發(fā)酵過程的影響不大，分析認為，試驗所提供的溫度在適宜這三株菌發(fā)酵的溫度范圍內(nèi)，三株菌都表現(xiàn)出較為寬泛的適宜發(fā)酵溫度;隨著發(fā)酵時間的增加，蛋白降解率也隨之增加，但對蛋白降解率總的影響趨勢是隨著時間的增加而減少的，從經(jīng)濟性考慮3d為最佳發(fā)酵時間;pH對發(fā)酵過程中蛋白降解率的影響總體不大，在pH為7時蛋白降解率最佳[9]。綜合來看，菌株F3在發(fā)酵溫度為30 ℃、pH為7、發(fā)酵時間為3d時，蛋白質(zhì)降解效果最佳為85.52%。

以同樣的方式，試驗得出各因素對COD去除率的影響情況，如圖2所示。

從試驗結(jié)果來看，菌種依然是對COD去除率的影響最大的因素，其次分別為時間、溫度和pH。綜合來看，菌株W11在發(fā)酵溫度為30 ℃、pH為7、發(fā)酵時間為3d時，蛋白質(zhì)降解效果最佳為58.12%。

2.2 最適發(fā)酵處理條件的驗證結(jié)果

為了找出效率與生產(chǎn)成本最佳的發(fā)酵時間，在以上試驗基礎(chǔ)上，在溫度為30 ℃、pH為7的試驗條件下多進行了1天的發(fā)酵驗證試驗，測定了蛋白質(zhì)降解率以及COD去除率的變化，結(jié)果如圖3所示。

從圖3可知，三個菌株在0～24h，蛋白降解率隨著時間的增加而迅速增加，推測這一段時間內(nèi)由于菌株大量生長產(chǎn)生活性蛋白酶迅速降解了蛋白，導致蛋白含量迅速下降;24～72h，蛋白降解率隨著時間的增加而緩慢增加，推測這一段時間內(nèi)菌株生長達到了平臺期，蛋白酶活性下降;72～96h，蛋白降解率幾乎不再增加，表明繼續(xù)發(fā)酵意義不大。綜合考慮發(fā)酵處理的時間成本、設(shè)備成本等因素，72h為最佳發(fā)酵時間，在此條件下F3菌的蛋白降解率能夠達到85.52%。

三個菌株COD去除率與蛋白降解率有相似的規(guī)律，72h后COD去除率幾乎沒有變化，同樣表明繼續(xù)發(fā)酵意義不大。綜合考慮72h為最佳發(fā)酵時間，在此條件下W11菌的COD去除率能夠達到58.12%。

2.3 模擬廢水混合發(fā)酵最佳處理工藝研究

根據(jù)以上試驗結(jié)果可知，降解蛋白效果最好的菌株是F3，去除COD效果最好的菌株是W11。為了同時提高COD去除率和蛋白降解率，選用F3/W11兩株菌株組合、F1/W11兩株菌株組合、F1/F3/W11三株菌株組合三種組合混合發(fā)酵的方式做進一步試驗，測定了三種菌株不同組合混合發(fā)酵過程中活菌數(shù)量的變化，結(jié)果見圖4。

從圖4可知，雖然各混合菌株菌落數(shù)都經(jīng)歷了對數(shù)期、平臺期、衰亡期，但F1/W11兩株菌株混合發(fā)酵過程中菌落生長速率明顯弱于其他兩種混合發(fā)酵方式，且在單菌試驗中F1菌的蛋白降解率明顯低于F3菌，故后續(xù)試驗不考慮F1/W11兩株菌混合發(fā)酵方式。

選用F1/F3/W11三株菌聯(lián)用、F3/W11兩株菌聯(lián)用兩種混合發(fā)酵的方式，測定了兩種混菌發(fā)酵過程中COD去除率與蛋白降解率的變化，結(jié)果見圖5所示。

從圖5可知，F(xiàn)1/F3/W11三株菌混合發(fā)酵時COD去除率與蛋白降解率有相似的規(guī)律，0～24h，隨時間的增加而迅速增加，這一段時間內(nèi)菌株正處于對數(shù)生長期，菌株大量生長導致蛋白含量迅速下降;24～48h，隨著時間的增加而緩慢增加，這一段時間內(nèi)菌株正處于穩(wěn)定期，菌群的生長到達穩(wěn)定期并有大量菌死亡，隨著時間的延長蛋白酶活性下降;48～72h，蛋白降解率隨著時間的延長增長更加緩慢，這個時候菌群雖然開始大量死亡，但還是有很多活菌在有效降解蛋白和COD。

F3/W11兩株菌混合發(fā)酵曲線趨勢與F1/F3/W11三株菌混合發(fā)酵相似，值得注意的是，F(xiàn)3/W11兩株菌混合發(fā)酵剛開始的蛋白降解率與COD去除率增長均不及F1/F3/W1三株菌混合發(fā)酵，但當發(fā)酵時間超過36h之后，蛋白降解率及COD去除率均緩慢超過F1/F3/W1三株菌混合發(fā)酵，與混合菌種的生長曲線規(guī)律一致，證明菌群在發(fā)酵過程中菌活力、蛋白酶活性與菌群生長息息相關(guān)，菌群菌量越大，活力越強，蛋白降解率及COD去除率越大，生長曲線與蛋白降解率及COD去除率呈正相關(guān)的關(guān)系[10]。最終得出結(jié)論，F(xiàn)3/W11混合發(fā)酵的方式要優(yōu)于F1/F3/W11混合發(fā)酵的方式，發(fā)酵72h后，得到最佳蛋白降解率87.38%，最佳COD去除率77.61%。

3 結(jié)論

使用單菌對模擬乳品廢水培養(yǎng)基進行發(fā)酵，COD去除率與蛋白降解率均未達到理想狀態(tài)。Loperena[11]曾報道芽孢桿菌菌株能夠在在34～57%范圍內(nèi)去除COD，在47～87%范圍內(nèi)去除蛋白質(zhì)，雖然篩選出了發(fā)酵效率最高的單一菌種，但其COD去除率與蛋白降解率未在同一試驗條件下超出這一范圍。因而利用混菌發(fā)酵的方式，希望能提高蛋白飲料的發(fā)酵效率，對F1/F3/W11三株菌混合發(fā)酵和F3/W11兩株菌混合發(fā)酵進行比較，從生長曲線、蛋白去除率曲線與COD去除率曲線得出F3/W11兩株菌混合發(fā)酵的方式要優(yōu)于F1/F3/W11三株菌混合發(fā)酵的方式，說明體系中的菌株數(shù)量并非越多越好，低COD去除率、低蛋白去除率的菌株會與高COD去除率、高蛋白降解率的菌株競爭，爭奪體系中的發(fā)酵底物，使得體系中的COD去除率、蛋白降解率整體下降。F3/W11共同發(fā)酵時具有互相促進的作用，COD去除率與蛋白降解率都明顯高于各自單菌株發(fā)酵時的數(shù)值。

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