柳 佳，姚慶強(qiáng)，鄧志鵬

（1.濟(jì)南大學(xué) 山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院 醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，山東 濟(jì)南250200；2.山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院 藥物研究所，山東 濟(jì)南250062；3.國(guó)家衛(wèi)生部生物技術(shù)藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南250062；4.山東省罕少見(jiàn)病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南250062）

桑白皮為?？浦参锷＃∕orus albaL.）的干燥根皮，是一味傳統(tǒng)中草藥，主要分布于我國(guó)安徽、河南、河北、湖南、四川、廣東等地，具有瀉肺平喘，利水消腫的功效[1]?，F(xiàn)研究表明，桑白皮具有鎮(zhèn)咳平喘[2]、抗炎[3]、降血糖[4-5]和降血脂[6]的作用。桑白皮的化學(xué)成分繁多，主要包括黃酮類化合物、芪類化合物、Diels-Alder型加合物和多糖類化合物等[7]。桑色素（morin）是從桑白皮（Mori cortex）中分離得到的黃酮類化合物[8]。近年，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)桑色素具有抗癌、抗高尿酸血癥和消炎作用[9]，但尚未有關(guān)于桑色素的藥動(dòng)學(xué)研究。本文建立了一種快速、高靈敏度、高選擇性的超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法（UPLC-MS/MS）測(cè)定桑色素在大鼠血漿中的濃度，并將其應(yīng)用于大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)研究。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Shimadzu Prominence 超高效液相色譜儀（日本島津公司）；AB SCIEX Q-TRAP 5500 型質(zhì)譜儀，包括電噴霧離子源（ESI），Analyst?1.6.3數(shù)據(jù)采集和處理系統(tǒng)（美國(guó) AB SCIEX 公司）；EVA50A型多功能樣品濃縮儀（北京普利泰科儀器公司）；Sorvall Biofuge Stratos高速冷凍離心機(jī)（賽默飛世爾）；EL204電子天平（梅特勒-托利多）；IKA Vortex天才3旋渦混勻器（廣州艾卡儀器設(shè)備公司）。

1.2 試劑

桑色素標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)：HMO52276198，純度：98.87 %，寶雞辰光）；芫花素標(biāo)準(zhǔn)品（內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，純度：94.2 % ，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；丙二醇（分析純，批號(hào)：20170901，南京威爾藥業(yè)）；甲醇（色譜純，批號(hào)：18075174，美國(guó)TEDIA公司）；乙腈（色譜純，批號(hào)：164791，賽默飛世爾）；甲酸為（色譜純級(jí)別，天津科密歐）；實(shí)驗(yàn)用水為娃哈哈純凈水，其他試劑均為分析純。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

5只健康雄性Sprague-Dawley大鼠，體重200±20 g，購(gòu)自濟(jì)南朋悅動(dòng)物繁育公司，許可證號(hào)為SCXK（魯）20140007。實(shí)驗(yàn)期間大鼠在恒定環(huán)境下飼養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度為23±3 ℃，相對(duì)濕度為55 %±15 %，自由飲食飲水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件及質(zhì)譜條件

2.1.1 色譜條件 采用Thermo Hypersil GOLD-C18（50 mm×4.6 mm，3 μm）色譜柱對(duì)待測(cè)樣品和內(nèi)標(biāo)化合物進(jìn)行分離，流動(dòng)相為0.1 % 甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫，洗脫程序?yàn)椋?～2.5 min，70 % B→90 % B；2.5～2.6 min，90 % B→7 %B；2.6～5.0 min，70 % B；流速設(shè)定為0.5 ml/min，柱溫設(shè)為40 ℃，自動(dòng)進(jìn)樣器溫度為15 ℃，進(jìn)樣量2 μl。

2.1.2 質(zhì)譜條件 采用電噴霧離子源，選用負(fù)離子檢測(cè)方式，掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）。氣簾氣（CUR）設(shè)定為35 psi，碰撞氣設(shè)為medium，離子源噴霧電壓（IS）設(shè)為-4500 V，離子源溫度（TEM）設(shè)為 550 ℃，霧化氣壓力（Gas 1）設(shè)為 55 psi，加熱氣壓力（Gas 2）設(shè)定為55 psi。通過(guò)切換閥的切換， 每次運(yùn)行僅記錄1.0～5.0 min 的MS/MS 數(shù)據(jù)。桑色素和內(nèi)標(biāo)的定量離子分別為m/z300.9→151.2和m/z283.1→268.2，同時(shí)將m/z300.9→125.1作為桑色素的定性離子對(duì)。桑色素和芫花素的二級(jí)MS圖譜見(jiàn)圖1。

圖1 桑色素和芫花素的MS圖譜

2.2 溶液的制備

2.2.1 大鼠灌胃溶液的配制 精密稱取桑色素標(biāo)準(zhǔn)品4.41 mg，加丙二醇10 ml，超聲，然后邊渦流邊緩慢滴加10 ml水，得到桑色素單體的大鼠灌胃溶液（濃度為218.01 μg/ml）。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 精密稱取桑色素標(biāo)準(zhǔn)品5.10 mg，用甲醇1 ml溶解，配制成5.10 mg/ml的儲(chǔ)備溶液，-80 ℃貯存。臨用前先超聲，再用乙腈逐步稀釋獲得系列標(biāo)準(zhǔn)溶液后待用。精密稱取芫花素標(biāo)準(zhǔn)品2.88 mg，加入甲醇6 ml，超聲溶解，并用乙腈逐步稀釋成濃度為50 ng/ml的內(nèi)標(biāo)工作溶液。

2.3 血漿樣品的處理方法

取50 μl內(nèi)標(biāo)溶液，置入1.5 ml EP管,依次加入50 μl血漿樣品和100 μl乙腈，渦旋振蕩5 min，6 ℃條件下以13 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min，取上清進(jìn)樣，進(jìn)樣量2 μl。

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

參照FDA[10]和中國(guó)藥典2015版的指導(dǎo)原則[11]，對(duì)本文建立的UPLC-MS/MS方法進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，包括選擇性、標(biāo)準(zhǔn)曲線、精密度和準(zhǔn)確度、提取回收率、基質(zhì)效應(yīng)和穩(wěn)定性等。

2.4.1 選擇性 分別取6份來(lái)自不同批次的大鼠空白血漿樣品、含桑色素和內(nèi)標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品及給藥10 min后的大鼠血漿樣品進(jìn)行 UPLC-MS/MS 分析。結(jié)果顯示，空白血漿中無(wú)內(nèi)源性雜質(zhì)干擾，桑色素和內(nèi)標(biāo)化合物的峰形良好且互不干擾，保留時(shí)間分別為1.33，1.68 min。在高濃度樣品之后測(cè)定大鼠空白血漿樣品，其殘留不影響桑色素和內(nèi)標(biāo)的含量測(cè)定。

2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線 將桑色素的儲(chǔ)備溶液用乙腈逐步稀釋成濃度為20.2，40.3，100.8，403.4，1008.4，4033.6，10084 ng/ml的系列對(duì)照品溶液。取對(duì)照品溶液10 μl，加入190 μl大鼠空白血漿，最終得到濃度分別為1.01，2.02，5.04，20.2，50.4，201.7，504.2 ng/ml的對(duì)照血漿樣品溶液。按2.3項(xiàng)方法處理上述血漿樣品后進(jìn)行UPLC-MS/MS分析，連續(xù)測(cè)定3 d，記錄峰面積。以桑色素的濃度（ng/ml）作為橫坐標(biāo)（x），桑色素峰面積和內(nèi)標(biāo)峰面積的比值作為縱坐標(biāo)（y），權(quán)重因子采用1/X2進(jìn)行線性回歸分析，得到桑色素的線性回歸方程，其回歸方程為y=1.46×10-3x+2.82×10-3（r=0.9953），線性范圍為1.01～504.2 ng/ml，定量下限為1.01 ng/ml，其精密度RSD≤7.24 %，RE≤-1.19 %，滿足生物樣品測(cè)定的方法學(xué)要求。

2.4.3 精密度與準(zhǔn)確度 將桑色素的儲(chǔ)備溶液用乙腈逐步稀釋，得到低、中、高濃度的質(zhì)控樣品溶液，桑色素的濃度分別為40.4，606，8068 ng/ml。取10 μl質(zhì)控樣品溶液，加入190 μl大鼠空白血漿，渦旋振蕩并離心，最終得到血漿濃度為2.02，30.3，403.4 ng/ml的質(zhì)控血漿樣品。將質(zhì)控血漿樣品按2.3項(xiàng)方法處理并進(jìn)樣分析（每個(gè)濃度進(jìn)樣5次，連續(xù)測(cè)定3 d），計(jì)算同一濃度下的精密度和準(zhǔn)確度，得到日內(nèi)精密度RSD≤9.04%，RE≤10.06 %；連續(xù)測(cè)定3 d，其日間精密度RSD≤6.10 %，RE≤10.40 %。

2.4.4 提取回收率和基質(zhì)效應(yīng) 取50 μl內(nèi)標(biāo)溶液，依次加入50 μl低、中、高3個(gè)濃度的質(zhì)控血漿樣品溶液和100 μl乙腈（重復(fù)6份），按2.3項(xiàng)方法處理，取上清進(jìn)樣分析，記錄桑色素及內(nèi)標(biāo)的峰面積（Am，AIS）；另取50 μl空白血漿，加入150 μl乙腈，渦流混合5 min，13 000 r/min離心5 min，取全部上清，氮?dú)獯蹈?，?50 μl內(nèi)標(biāo)溶液和50 μl桑色素溶液（濃度分別為2.02，30.3，403.4 ng/ml）對(duì)其進(jìn)行復(fù)溶（重復(fù)6份），渦流混合后進(jìn)行UPLCMS/MS分析，記錄桑色素及內(nèi)標(biāo)的峰面積（Bm，BIS）。桑色素和內(nèi)標(biāo)的回收率用峰面積之比A/B計(jì)算。桑色素的回收率為85.3 %～92.9 %，內(nèi)標(biāo)的回收率為91.2 %。另取50 μl純水和150 μl乙腈，渦流混合后經(jīng)氮?dú)獯蹈桑偌尤?0 μl內(nèi)標(biāo)溶液和50 μl桑色素溶液（濃度為2.02，30.3，403.4 ng/ml），按2.3項(xiàng)方法處理，平行測(cè)定6份，記錄桑色素和內(nèi)標(biāo)的峰面積（Cm，CIS）。分別以峰面積的比值B/C計(jì)算桑色素和內(nèi)標(biāo)的基質(zhì)效應(yīng)。桑色素的基質(zhì)效應(yīng)為91.6 % ～ 105.9 %，內(nèi)標(biāo)為103.1 %。由結(jié)果可見(jiàn)，大鼠血漿中的基質(zhì)對(duì)桑色素的離子作用很微弱，不影響結(jié)果的準(zhǔn)確性，可忽略。

2.4.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 桑色素分別于-80 ℃放置7 d、-80 ℃反復(fù)凍融3次、室溫放置6 h、自動(dòng)進(jìn)樣器（15℃）中放置12 h。按2.3項(xiàng)方法處理后進(jìn)行UPLCMS/MS分析，平行測(cè)定3次。結(jié)果RSD≤15 %，RE≤15 %，表明桑色素在上述4種環(huán)境下均保持穩(wěn)定。

2.5 大鼠藥動(dòng)學(xué)研究及結(jié)果

大鼠按2.186 mg/kg灌胃給藥，給藥前禁食12 h，自由飲水。分別在給藥后0.083，0.167，0.5，0.75，1，1.5，2，3，5，8，12，24 h于眼底靜脈叢取血約300 μl，置入肝素化的EP管，13 000 r/min離心3 min，取上層血漿,置-80 ℃保存待測(cè)。

按2.1項(xiàng)條件，采用UPLC-MS/MS測(cè)定大鼠血漿中桑色素的濃度，采用DAS2.1.1軟件進(jìn)行擬合，得到血藥濃度-時(shí)間曲線（見(jiàn)圖2）和主要的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（見(jiàn)表1）。大鼠灌胃給予桑色素單體后，藥-時(shí)曲線下面積（AUC0-∞）為375.8±265.7 μg/L·h，消除半衰期（t1/2z）為3.27±1.26 h，達(dá)峰時(shí)間（Tmax）為0.167±0.00 h，藥峰濃度（Cmax）為234.2±45.8 μg/L。

圖2 大鼠體內(nèi)桑色素的血藥濃度-時(shí)間曲線（n=5）

3 討論

本實(shí)驗(yàn)比較了桑色素在水-甲醇、水-乙腈、0.1 % 甲酸水溶液-乙腈及含10 mmol/L乙酸銨的0.1 % 甲酸水溶液-乙腈4種流動(dòng)相條件下的分離效果，流動(dòng)相為0.1 % 甲酸水溶液-乙腈時(shí)桑色素和內(nèi)標(biāo)的分離效果最好。通過(guò)比較桑色素在ESI下正、負(fù)兩種離子的檢測(cè)方式，發(fā)現(xiàn)桑色素在負(fù)離子模式下的響應(yīng)明顯高于正離子，所以本實(shí)驗(yàn)選擇在負(fù)離子檢測(cè)方式下進(jìn)行。在負(fù)離子檢測(cè)模式下，對(duì)桑色素進(jìn)行二級(jí)MS分析，得到桑色素的主要碎片離子為m/z300.9→151.2和m/z300.9→125.1，內(nèi)標(biāo)的主要碎片離子為m/z283.1→268.2。分別將m/z300.9→151.2，m/z283.1→268.2作為桑色素和內(nèi)標(biāo)的定量離子，同時(shí)采用m/z300.9→125.1對(duì)桑色素進(jìn)行定性分析。在負(fù)離子條件下對(duì)桑色素和內(nèi)標(biāo)的各質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果如下：桑色素的去簇電壓（DP）、射入電壓（EP）、碰撞室射出電壓（CXP）、碰撞能（CE）分別為50 V，15 V，15 V和 28 V，內(nèi)標(biāo)的去簇電壓（DP）、射入電壓（EP）、碰撞室射出電壓（CXP）、碰撞能（CE）分別為65 V，15 V，50 V和32 V。

表1 桑色素的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（±s，n=5）

表1 桑色素的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（±s，n=5）

藥動(dòng)學(xué)參數(shù)桑色素AUC0-t/μg·(L·h)-1361.2±261.7 AUC0-∞/μg·(L·h)-1375.8±265.7 MRT0-t/h2.48±1.23 MRT0-∞/h3.11±1.29 t1/2z/h3.27±1.26 Tmax/h 0.167±0.00 CL/L·(h·kg)-1 7.636±3.41 Vd/L·kg-133.0±16.5 Cmax/μg·L-1 234.2±45.8

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)考察了SD大鼠灌胃給予桑色素單體后的藥動(dòng)學(xué)性質(zhì)，結(jié)果表明，桑色素在大鼠體內(nèi)呈非線性動(dòng)力學(xué)特征，且其在大鼠體內(nèi)吸收速度較快，大鼠灌胃給藥0.167 h即達(dá)血藥峰濃度（Cmax）。本文建立了一種測(cè)定大鼠血漿中桑色素濃度的UPLCMS/MS方法，該方法操作簡(jiǎn)便、前處理簡(jiǎn)單、穩(wěn)定性良好且回收率較高，可用于生物樣品中桑色素含量的測(cè)定，為桑色素的進(jìn)一步研究提供幫助和支持。